专利名称：微生物发酵法生产瑞拉菌素的生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种农药活性物质的生产工艺，尤其是涉及一种微生物发酵法生产瑞拉菌素的生产工艺。
背景技术：
自从20世纪40年代有机氯和有机汞农药问世以后，人们在与农业害虫和杂草斗争过程中，主要是依靠化学农药这一现代化武器。但是，随着化学农药的品种和产量激增，施用范围日益扩大，农药残毒污染而造成世界性公害，引起人们的忧虑。随着人们环保意识的增强，对人畜安全、无毒、无公害、不污染环境、不毒杀害虫天敌的生物农药异军突起。目前，世界各国都在大力研究和推广应用生物农药，以维护生态环境。生物农药在生产上的推广应用，已经产生了巨大的经济效益、社会效益和生态效益。在生物农药中微生物源农药是目前应用最广、发展最快、最有前途的一类，也越来越受人们的青睐。目前，我国农业正进入一个从传统农业向高效优质和可持续发展的现代农业转变的新的历史时期，特别是进入WTO以后我国农业还面对日趋激烈的国际竞争，微生物农药的研究和应用在新世纪之初迎来一个前所未有的历史机遇和技术挑战，它的开发和利用是解决当前农业生态环境问题的重要突破口之一。为了保护生态环境和促进农业可持续发展，开发微生物农药具有广阔的前景和深远的意义。
微生物农药以农用抗生素最为典型。农用抗生素在我国的研究开发历史悠久，经历了漫长的发展过程，也取得了可喜的成就，现在仍然是众多研究者关注的焦点。众所周知，井岗霉素是70年代开发成功的生物农药，经历了多年的应用，至今仍是生产上用于防治水稻纹枯病的当家品种。
农用抗生素来源于微生物，特别是放线菌。据统计，在1000多种抗生素中约有2/3以上是由放线菌产生的，而链霉菌属放线菌产生的抗菌素又占放线菌目的90％以上；且放线菌是土壤生态系中微生物三大类群之一，广泛存在于各类土壤中。单就微生物而言，已被人类研究过的不足自然界存在的1‰，而这些研究过的微生物中，只发现了其中的1％能产生生物活性物质，何况微生物是易变的，由于基因重组和染色体畸变，天天都在产生新的变种，因此对这一领域的研究可以说是永无止境的。土壤微生物种类繁多，数量巨大，1克土壤内微生物的总数相当于整个海洋生物的数量(即1克土壤内含有1亿个细菌，1000万个放线菌和100万个真菌)。迄今为止，大多数抗生素均是在土壤微生物-尤其是放线菌中发现的，土壤微生物是一个有丰富内含的宝藏，是医药、工业制药的丰富资源。
我国地大物博、生物资源丰富。陕西的渭北旱原南部是陕西的第二粮仓，土层深厚、富饶，有机质丰富，是世界苹果优生区，其土壤中也蕴藏着大量的有益微生物种群，而且这部分地区土壤干燥、偏碱性，湿度较小，有利于放线菌的生长。因此本发明便选择了从渭北旱原南部的麦地、苹果园和油菜地的土壤中分离放线菌，然后筛选拮抗菌株，并从其发酵液中分离具有杀菌或抑菌活性的物质。
目前，国内市场上生产农药的方法有1、化学合成法以各种化工原料通过改变反应条件，添加催化剂的方法进行化学合成，形成化学反应方程式制取最终产物。此方法存在合成思路难制定，合成路线长，原材料和中间体成本高，收率低等缺点。
2、制剂加工法在原料药中添加不同辅料将其制成不同剂型的成品以更好的发挥其药效。缺点是成本过高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微生物发酵法生产瑞拉菌素的生产工艺，其简化了工艺，降低了成本，提高了产量，并能减小环境污染。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种微生物发酵法生产瑞拉菌素的生产工艺，其特征在于生产工艺为(1)发酵委内瑞拉链霉菌秦岭变种经过摇瓶发酵生产得发酵液；(2)提取；发酵液通过预处理、过滤、减压浓缩、离心、沉淀、干燥、阳离子交换吸附、洗脱、减压浓缩干燥制得瑞拉菌素粗品；(3)精制粗品经纯化溶解、大孔树脂柱层析、反相制备分离、浓缩干燥制得成品。
上述生产工艺包括(1)发酵①菌种培养a菌种培养基放线菌分离培养用培养基高氏一号培养基；真菌培养及颉抗试验用培养基PDA；b将配置好的分离培养用培养基NaCl调节PH7.0，装于斜面试管和三角瓶，在0.105Mpa蒸气压力灭菌30分钟，自然冷却至45℃，三角瓶中培养基用于菌种的分离、筛选。斜面试管倾斜45°摊平，待凝固放置30°培养箱培养，48小时后无菌条件下接种纯化或筛选的菌株，在30°培养箱培养36-86h，放置冰箱4℃保管；c取筛选出的丰满无杂菌的最优拮抗菌株36-72h培养皿内培养菌种，刮下菌体，接种于发酵液中；(2)发酵培养培养成熟的菌株接种于发酵瓶，在适宜条件下，菌体发酵代谢产生活性物质；a发酵培养基发酵培养基配方黄豆饼粉2％，葡萄糖1％，淀粉1.5％，碳酸钙0.25％，磷酸氢二钾0.05％；b根据发酵培养基配方配制发酵培养基，将配制好的培养基等量加入多个发酵瓶中，经发酵条件的优化得出摇床转速在150r/min，30-34℃摇瓶培养72h活性物质充分产生；(3)、发酵液预处理发酵到时后，用1mol/l草酸调PH到4，静置0.5h后再调PH至4.0，再静置半小时后过滤，收集滤液；(4)粗提a滤液在旋转薄膜蒸发器中70℃减压浓缩至小体积，用6mol/L的NaOH调PH至7.0，5000rpm离心30min，弃沉淀，取上清液。上清液用10倍体积的冰冻丙酮沉淀，弃上清液，取沉淀，干燥。
b732阳离子交换树脂吸附732阳离子树脂用水浸泡2h后，减压抽去气泡，倾去水，再用大量无离子水洗至澄清，去水后加4倍量2mol/l的HCl，搅拌4h，除去酸液，水洗至中性，再加4倍量2mol/L NaOH，搅拌4h，除去碱液，水洗至中性，用4倍量的2mol/LNaOH浸泡2h，转为Na+型装柱，将丙酮沉淀用重蒸水充分溶解，加样，用蒸馏水冲洗至流出液无色、澄清，然后用3％氨水洗脱，分段收集洗脱液。用孢子萌发法检测各段洗脱液的活性。活性部分减压浓缩得粗提物；(5)精提a大孔树脂柱层析新树脂先用无水乙醇浸泡3-4d后，装入层析柱，用无水乙醇冲洗大孔树脂，放置6h，待大孔吸附树脂沉降紧实后，以6倍柱体积的蒸馏水冲洗柱体，然后用3-4倍体积的2％HCl溶液冲洗树脂并浸泡2-4h，再用蒸馏水洗至出水为PH呈中性，用3-4倍体积的2％NaOH溶液冲洗树脂，并浸泡2-4h，而后用蒸馏水洗至出水为PH呈中性，将离子交换树脂提取的活性洗脱液静态吸附到大孔树脂上，分别用蒸馏水、40％乙醇、60％乙醇、100％乙醇作为洗脱剂，洗脱液每管收集20ml，减压浓缩，用孢子萌发法测活，将活性洗脱液干燥，得精提物；b在反相制备柱高效液相色谱上对精提物进一步切割分离，制备色谱各峰用孢子萌发法测活性，对抑菌效果强的单组分进行分离制备，并对其进行理化性质和结构分析。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下1.制造简单。工艺简单，易行，操作过程中各个环节均可人为控制条件。
2.质量好。生产出的活性物质粗品对供试的多种植物病毒病原真菌及几种细菌都有很好的抑制效果。1mg/l的药剂抑制率在45％以上，其中对水稻稻瘟病菌、小麦根腐病菌、辣椒疫霉病菌、黄瓜霜霉病菌、十字花科软腐病菌及番茄青枯病菌在低浓度也能达到较好的效果，100mg/l的药液抑制率高达75％以上。
3.不会造成环境污染。是天然产物容易分解、无积累、选择性极高，而对其它生物和环境安全。
4.具有迅速的资源再生性。整个工艺过程持续时间短，原材料可重复利用，并可通过修改工艺条件不断提高产品品质。
5.有害生物相对不易产生抗药性。该工艺生产出的活性物质造成敏感菌菌丝尖端形成膨胀泡而破裂，原生质外泄，从而造成溶菌现象。活性物质作用于病原菌的细胞壁、细胞膜，造成细胞壁、细胞膜破裂。
6.生产成本低、生产安全、排污少，其副产品还可以加工为饲料或肥料。原料来源容易，生产周期短，因此生产成本低。生产过程和产品均对环境不构成危害，各个工艺步骤产生的废水废渣均是很好的氮源、碳源、糖源和微量元素，是最好的加工有机饲料和肥料的原材料。
四
图1为发明生产流程框图；图2为发明发酵生产流程框图；图3为本发明粗提生产流程框图；图4为本发明精提生产流程框图。
五具体实施例方式瑞拉菌素又称瑞拉霉素，化学名为1-(3-呋喃基-4-酰胺)-2-N-氨基脒基葡萄苷(Zuelaemycin)，参见图1，本发明的生产工艺为用委内瑞拉链霉菌秦岭变种作为生产菌株，经过摇瓶发酵生产得发酵液，发酵液通过预处理、过滤、减压浓缩、离心、沉淀、干燥、732阳离子交换树脂吸附、洗脱、减压浓缩干燥、大孔树脂柱层析、反相制备分离、浓缩干燥制得瑞拉菌素成品。
实施例一、生产过程1、发酵委内瑞拉链霉菌秦岭变种经过摇瓶发酵生产得发酵液；2、提取发酵液通过预处理、过滤、阳离子交换吸附、洗脱、减压浓缩干燥制得瑞拉菌素粗品；3、精制粗品经纯化溶解、大孔树脂柱层析、反相制备分离、浓缩干燥制得成品。
二、工艺过程(一)发酵(参见图2)1、菌种筛选(1)放线菌培养基放线菌分离用培养基配方硝酸钾0.1％、磷酸氢二钾0.05％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.001％、可溶性淀粉2.0、琼脂2.0％、水1000ml。
真菌培养及颉抗试验用培养基配方马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂1.8％、水1000ml、PH6.5-7.0.
(2)筛选①准备将配置好的分离培养用培养基NaCl调节PH7.2-7.4，装于斜面试管和三角瓶，在0.105Mpa蒸气压力灭菌30分钟，自然冷却至45℃。斜面试管倾斜45°摊平，待凝固放置30°培养箱培养，48小时后无菌条件下接种纯化或筛选的菌株，在30°培养箱培养36-86h，放置冰箱4℃保管；
②采样与分离以秦岭原始森林采集的土壤为材料，通过制备土壤悬浮液、采用涂抹法和混菌法平板接种、划线分离纯化三个步骤进行放线菌的分离。
③初筛与复筛从分离到的放线菌中采用十字交叉法，用皿内琼胶平板直接初筛；然后选择在初筛中拮抗性好的放线菌，以液体发酵培养的方法进行繁殖，测定发酵滤液对病原菌的颉颃性；选择复筛中抗菌谱较广，且颉颃性较好的菌株进行单孢分离；用生长素率法测定每个单孢菌的发酵滤液的拮抗性选出对供试病原菌有良好拮抗作用，拮抗性最好的菌株作为目标放线菌菌株。
(3)发酵条件的优化与接种①液体发酵条件的优化以生长速率法测定的发酵滤液(50ml/l)的抑制率为指标分别从有机氮源、有机碳源、无机离子、PH、发酵时间、发酵温度、摇床转速等不同方面进行最优培养基正交实验，优化发酵条件。
②取筛选出的丰满无杂菌的最优拮抗菌株36-72h培养皿内培养菌种，刮下菌体，接种于发酵液中；2、发酵培养培养成熟的菌株接种于发酵瓶，在适宜条件下，菌体发酵代谢产生活性物质。
(1)经蒸气灭菌在121℃，0.12-0.15Mpa压力下，灭菌30分钟，自然冷却备用。
(2)发酵培养基发酵培养基配方黄豆饼粉1.5％，葡萄糖2.0％，可溶性淀粉1.0％，碳酸钙0.1％，食盐0.4％，硫酸铵0.25％，磷酸氢二钾0.02％，水1000ml.
(3)接种根据发酵培养基配方配制发酵培养基，将配制好的培养基等量加入多个发酵瓶中，经发酵条件的优化得出，摇瓶培养72h活性物质充分产生。
(4)培养在摇床转速150r/min，PH8.0，温度30-34℃下培养72h左右。
3、发酵液预处理(1)发酵到时后，用草酸(1mol/l)调PH到4.0.
(2)在无菌操作台上将发酵液静置0.5h后再用草酸调PH至4.0，边搅拌边调节。再静置半小时后过滤，收集滤液。
(二)提取采用旋转薄膜蒸发将发酵液与其他物质分离，经丙酮沉淀干燥，732阳离子交换树脂吸附，洗脱，减压浓缩得粗提物.
1、发酵液的预处理核定发酵液体积，开搅拌并维持半小时，使可溶蛋白充分絮凝，用精密试纸重新测试PH至4.0。
2、浓缩(1)浓缩前，先对浓缩设备进行检查，是否已清洗干净，同时检查蒸气，并排尽蒸气管内的冷凝水，确认完成后，进发酵液进行浓缩。
(2)滤液在旋转薄膜蒸发器中70℃减压浓缩至小体积，用精密试纸检查PH值，如低于7.0，用6mol/L的NaOH调PH至7.0。
(3)5000rpm离心30min，弃沉淀，取上清液。上清液用10倍体积的冰冻丙酮沉淀，弃上清液，取沉淀，干燥。
(4)在浓缩时，加防溅球，发酵液不装满，否则易冲料，且冲料后难以洗涤。升温要慢一些。严禁中途补加发酵液，控制料液浓度在规定位置即浓缩起始体积的20％-25％即可。
(5)浓缩结束后要检查PH值，PH值不得低于7.0。
(6)每批浓缩结束时，对滤液收集罐、浓缩罐及气管道永无菌水清洗，第一遍清液当粗品母液处理。
4、粗提(参见图3)(1)浓缩同时检查732阳离子交换树脂，做吸附准备。
①732阳离子树脂用水浸泡2h后，减压抽去气泡，倒去水。
②用大量无离子水洗至澄清，去水后加4倍量2mol/l的HCl，搅拌4h，除去酸液，水洗至中性，再加4倍量2mol/L NaOH，搅拌4h，除去碱液，水洗至中性，用4倍量的2mol/L NaOH浸泡2h，转为Na+型装柱。
(2)将丙酮沉淀用重蒸水充分溶解，加样，用蒸馏水冲洗至流出液无色、澄清，然后用3％氨水洗脱，分段收集洗脱液。用孢子萌发法检测各段洗脱液的活性。活性部分减压浓缩得粗提物。
5、精提(参见图4)(1)大孔树脂柱层析①准备新树脂先用无水乙醇浸泡3-4d后，装入层析柱，用无水乙醇冲洗大孔树脂，放置6h。待大孔吸附树脂沉降紧实后，以6倍柱体积的蒸馏水冲洗柱体。然后用3-4倍体积的2％HCl溶液冲洗树脂并浸泡2-4h，再用蒸馏水洗至出水为PH呈中性。用3-4倍体积的2％NaOH溶液冲洗树脂，并浸泡2-4h，而后用蒸馏水洗至出水为PH呈中性。
②精提将离子交换树脂提取的活性洗脱液静态吸附到大孔树脂上，分别用蒸馏水、40％乙醇、60％乙醇、100％乙醇作为洗脱剂，洗脱液每管收集20ml，减压浓缩，用孢子萌发法测活，将活性洗脱液干燥，得精提物。
6、在反相制备柱高效液相色谱上对精提物进一步切割分离，制备色谱各峰用孢子萌发法测活性，对抑菌效果强的单组分进行分离制备，并对其进行理化性质和结构分析。
权利要求
1.一种微生物发酵法生产瑞拉菌素的生产工艺，其特征在于生产工艺为(1)发酵委内瑞拉链霉菌秦岭变种经过摇瓶发酵生产得发酵液；(2)提取；发酵液通过预处理、过滤、减压浓缩、离心、沉淀、干燥、阳离子交换吸附、洗脱、减压浓缩干燥制得瑞拉菌素粗品；(3)精制粗品经纯化溶解、大孔树脂柱层析、反相制备分离、浓缩干燥制得成品。
2.根据权利要求1所述的微生物发酵法生产瑞拉菌素的生产工艺，其特征在于(1)发酵①菌种培养a菌种培养基放线菌分离培养用培养基高氏一号培养基；真菌培养及颉抗试验用培养基PDA；b将配置好的分离培养用培养基NaCl调节PH7.0，装于斜面试管和三角瓶，在0.105Mpa蒸气压力灭菌30分钟，自然冷却至45℃，三角瓶中培养基用于菌种的分离、筛选。斜面试管倾斜45°摊平，待凝固放置30°培养箱培养，48小时后无菌条件下接种纯化或筛选的菌株，在30°培养箱培养36-86h，放置冰箱4℃保管；c取筛选出的丰满无杂菌的最优拮抗菌株36-72h培养皿内培养菌种，刮下菌体，接种于发酵液中；(2)发酵培养培养成熟的菌株接种于发酵瓶，在适宜条件下，菌体发酵代谢产生活性物质；a发酵培养基发酵培养基配方黄豆饼粉2％，葡萄糖1％，淀粉1.5％，碳酸钙0.25％，磷酸氢二钾0.05％；b根据发酵培养基配方配制发酵培养基，将配制好的培养基等量加入多个发酵瓶中，经发酵条件的优化得出摇床转速在150r/min，30-34℃摇瓶培养72h活性物质充分产生；(3)发酵液预处理发酵到时后，用1mol/l草酸调PH到4，静置0.5h后再调PH至4.0，再静置半小时后过滤，收集滤液；(4)粗提a滤液在旋转薄膜蒸发器中70℃减压浓缩至小体积，用6mol/L的NaOH调PH至7.0，5000rpm离心30min，弃沉淀，取上清液。上清液用10倍体积的冰冻丙酮沉淀，弃上清液，取沉淀，干燥；b732阳离子交换树脂吸附732阳离子树脂用水浸泡2h后，减压抽去气泡，倾去水，再用大量无离子水洗至澄清，去水后加4倍量2mol/l的HCl，搅拌4h，除去酸液，水洗至中性，再加4倍量2mol/L NaOH，搅拌4h，除去碱液，水洗至中性，用4倍量的2mol/LNaOH浸泡2h，转为Na+型装柱，将丙酮沉淀用重蒸水充分溶解，加样，用蒸馏水冲洗至流出液无色、澄清，然后用3％氨水洗脱，分段收集洗脱液。用孢子萌发法检测各段洗脱液的活性。活性部分减压浓缩得粗提物；(5)精提a大孔树脂柱层析新树脂先用无水乙醇浸泡3-4d后，装入层析柱，用无水乙醇冲洗大孔树脂，放置6h，待大孔吸附树脂沉降紧实后，以6倍柱体积的蒸馏水冲洗柱体，然后用3-4倍体积的2％HCl溶液冲洗树脂并浸泡2-4h，再用蒸馏水洗至出水为PH呈中性，用3-4倍体积的2％NaOH溶液冲洗树脂，并浸泡2-4h，而后用蒸馏水洗至出水为PH呈中性，将离子交换树脂提取的活性洗脱液静态吸附到大孔树脂上，分别用蒸馏水、40％乙醇、60％乙醇、100％乙醇作为洗脱剂，洗脱液每管收集20ml，减压浓缩，用孢子萌发法测活，将活性洗脱液干燥，得精提物；b在反相制备柱高效液相色谱上对精提物进一步切割分离，制备色谱各峰用孢子萌发法测活性，对抑菌效果强的单组分进行分离制备，并对其进行理化性质和结构分析。
全文摘要
本发明涉及一种微生物发酵法生产瑞拉菌素的生产工艺，其简化了工艺，降低了成本，提高了产量，并能减小环境污染。本发明生产工艺为(1)发酵委内瑞拉链霉菌秦岭变种经过摇瓶发酵生产得发酵液；(2)提取；发酵液通过预处理、过滤、减压浓缩、离心、沉淀、干燥、阳离子交换吸附、洗脱、减压浓缩干燥制得瑞拉菌素粗品；(3)精制粗品经纯化溶解、大孔树脂柱层析、反相制备分离、浓缩干燥制得成品。
文档编号C12P19/00GK101082056SQ20071001778
公开日2007年12月5日 申请日期2007年4月29日 优先权日2007年4月29日
发明者安德荣, 张勤福, 刘欢 申请人:西北农林科技大学