寡糖混合物的制作方法

专利名称：：寡糖混合物的制作方法寡糖混合物发明领域本发明涉及M混合物，包含所述^t混合物的食物产品和生产所述，混合物的方法。发明背景人类的结肠被多种细菌所建群，所述细菌对消化道生理具有正面和负面的双重作用，也具有其它系统性的影响，结肠中所发现的细菌的优势类群包括类菌体、双歧杆菌、真细菌、梭菌和乳杆菌。所存在的细菌响应结肠中的底物有效性、氧化还原电位、pH、02张力和分布，具有变化的活性。通常，肠内的细菌可分为对宿主发挥潜在危害或有益作用的物种。致病作用(例如，其可能由梭菌或类菌体引起)包括腹泻、感染、肝脏损害、致癌作用和肠腐烂。健康促进作用可以由有害细菌的生长抑制、免疫功能的刺激、增强必需营养成分的消化和吸收以及维生素的合成所引起。具有健康促进作用的细菌类群(例如双歧杆菌属(5i^/W"Cten'M附)和乳杆菌(l""M""7/船))在数量和/或活性上的增加是值得期望的。特别就嬰儿来说，可以认为嬰儿的胃肠道直至出生前都是无菌的。在出生的过程中，其遭遇了来自母亲消化道和皮肤的细菌并开始建群。针对嬰儿的喂养，消化道小型生物群的组成存在大的差异。母乳喂养的嬰儿的粪便菌群包括M杆菌和一些乳杆菌种类的可观群体，而配方乳喂养的婴儿具有更复杂的小型生物群，双歧杆菌、类菌体、梭菌和链球菌一般都存在。断乳后，开始建立类似成/4莫式的消化道小型生物群模式。对于所有的婴儿均建议使用母乳。但是，在一些情况下，母乳喂养是不充分的，或者出于医学原因是不成功的，或者母亲选择不用母乳喂养。针对这些情况开发了嬰儿配方乳(infantformulae).向食品中添加益生元是促进结肠中有益细菌的数量和/或活性的一种方法。益生元是不消化的食品成分，其通过选择性的刺激结肠中一种或有限数量的细菌的生长和/或活性来有益的影响宿主，从而增进宿主健康。此类成分是不消化的，因为其在胃或小肠中不能被分解和吸收，从而可以完整的通过并到达结肠，在此处由有益细菌选择性的进行发酵。益生元的实例包括某些S^，例如果M(FOS)和半乳S^(GOS)。已知人乳比大多数其它动物乳含有更大量的不能消化的寡糖。事实上，不能消化的寡糖代表了母乳中第三大固体成分(在乳糖和脂类之后)，初乳中存在的浓度是12-15g/1，成熟乳汁中以5-8g/l存在。人乳寡糖非常耐受酶水解，表明这些寡糖可以显示出与其热值不直接相关的关鍵性功能。由于对人乳的组成已经有更好的了解，已经建议将益生元添加到婴儿配方乳中。多种补充了益生元例如果寡糖和半乳^t混合物的婴儿配方乳是可商购的。但是，此类混合物只是粗略的近似人乳中的，混合物。在人乳中已经检测到超过100种不同的^ll成分，其中一些至今尚未在动物乳例如牛乳中检测到，或仅检测到少量。仅以非常小的量存在于牛乳和初乳中或者完全不存在的人乳寡糖类型的实例是唾液酸化和岩藻糖基化的寡糖。美国专利申请号2003/0129278描述了以产生于一种或几种动物乳中的寡糖为基础的S^t混合物，其特征在于包含至少两种寡糖级分，每一级分均由至少两种不同的S^瞎组成，其中游离的乳糖不属于所述S^。存在于物乳中所存在的那些寡糖。此外，a)如果所述，仅从一种动物乳中提取，中性寡糖与酸性(唾液酸化)寡糖的比例是90-60:10-40重量％，或者b)如果所述，是从至少两种动物乳中提取的，则从两种不同的动物乳中提取的S^各占S^t混合物中存在的，总量的10重量％。本发明的目标是提供*#混合物，其作为益生元是有效的，特别是在人的消化道中。发明概述在一方面，本发明涉及寡糖混合物，其包含5-70wt。/。的、选自GalNAcal，3Gal卩l，4Glc和Gal卩l，6GalNAcal，3Gaipi，4Glc中的至少一种N-乙酰化寡糖，20謹90wto/o的、选自Gal卩l，6Gal、Galj31,6Gaipi，4GlcGaipi，6Gaipi，6Glc、Gal卩l，3Gaipi，3Glc、Gaipi，3Ga职，4Glc、Galpl，6Gaipi,6Gaipi，4Gk、Gal卩l，6Gaipi，3Gaipi，4GlcGaipi，3Gaipi，6Gal(51，4Glc和Gaipi，3Gal(51，3Gaipi，4Glc中的至少一种中性寡糖，以及5-50wt%的、选自NeuAca2,3Gal(51，4GIc和NeuAca2，6Gal(31，4Glc中的至少一种唾液酸化的^J瞎。此成分是新的保护性和免疫调节成分，作为益生元是特别有效的。与可商购的益生元成分例如，FOS和GOS相比，混合物在结构上与人乳寡糖更接近，例如其中它包括酸性和中性寡糖的混合物。在一个实施方案中，*#混合物源自动物乳，例如一种或多种牛乳、山羊乳或水牛乳。在另一个方面中，本发明涉及包含上述M混合物的食物产品。任选的，食物产品是嬰儿食物或配方乳，但是该产品可以是幼儿、嬰儿或成人消费的任何食品或饮料。消费含有作为益生元的此类S^混合物食品将选择性的促进结肠中一种或有限数量的有益细菌的生长和/或活性，从而改善宿主健康。附图的简要说明图l显示了在进行实施例3中描述的干扰2周后，在小肠(空肠)和粪便中短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)(A，B)、长双歧杆菌(B,longum)(C，D)和产气荚膜梭菌(C.perfringens)(E，F)计数。对于对照组和根据本发明的OS混合物组，显示了用对数值表示的细菌计数中位数(具有强的标准偏差)。基于强ANOVA显示效果概率(N=9到10)。(NA,由于值低于检测底限而无可用)。图2显示了在实施例3中描述的干扰喂养时间中产气荚膜梭菌的相对整体代谢活性。数据以对照组(灰色框)和OS混合物组(白色框)的具有中位数和四分位数间距的框线图表示(N-9到10)。如通过涉及费歇耳恰当检验的中位数检验所评估的，对于第0天和第14天，益生元的效果是显著的(p<0.005)。图3显示了千扰2周后在小肠(空肠)(A、C、E)和粪便(B、D、F)中短双歧杆菌、长双歧杆菌和产气荚膜梭菌的计数。对于对照组、仅具有中性半乳*^的组和具有根据本发明的*#混合物的組，显示了以对数值表示的细菌计数的中位数(具有四分位数间距)。ND，未检测到的。发明的详细描述在本说明书中，在阅读和解释说明书、实施例和权利要求时必须考虑对下列词语所给出的定义。"嬰儿配方乳，，在生命前四至六个月期间用于嬰儿的完全营养的食物。(1991年5月14日欧盟条约(EuropeanCommissionDirective)91/321/EEC关于婴儿配方乳和后续配方乳(follow-onformulae)的1.2章)已知嬰儿可以单纯只用婴儿配方乳喂养，或者婴儿配方乳可以由母亲或其它护理人作为人乳的补充进行喂养。本文中使用的术语"嬰儿配方乳"与普遍使用的表达方式"初始配方乳"是同义的。N-乙酰化寡糖具有N-乙酰残基的寡糖。中性寡糖没有带电荷，也没有N-乙酰残基的寡糖。"益生元，，通过选择性的刺激结肠中一种或有限数量的细菌的生长和/或活性来有利的影响宿主，从而增强宿主健康的不可消化的食物成分。(Gibson和Roberfroid"DietaryModulationoftheHumanColonicMicrobiota:IntroducingtheConceptofPrebiotics"J.Nutr125:1401—1412)具有2至20范围(包括端值)的聚合度(DP)但不包括乳糖的糖类。唾液酸化，具有有关联电荷的唾液酸残基的*#本发明提供了寡糖混合物，其包含5-70wt%的、选自GalNAcal，3Gaipi，4GIc和Gal[51，6GalNAcal，3Gaipi，4Glc中的至少一种N國乙酰化寡糖，20-90wt。/。的、选自Gal(51，6Gal、Gaipi，6Gal(51，4GlcGaipi，6Gal(51，6Glc、Gal卩l，3Gaipi，3Glc、Gaipi，3Gal(51，4Glc、Gaipi,6Gaipi，6Gaipi，4Glc、Gaipi，6Gaipi，3Gaipi，4GlcGaipi,3Gal(31，6Gaipi，4Glc和Gaipi，3Gal(31，3Gaipi，4Glc中的至少一种中性寡糖，以及5-50wt%的、选自NeuAca2，3Gal卩l，4Glc和NeuAca2，6Gaipi，4Glc中的至少一种唾液酸化的S4t，以及包含上述絲混合物的嬰儿或成人食物产品。优选的，混合物包含10-70wt。/。的特定的N-乙酖化寡糖，20-80wt。/o的特定的中性*#和10-50wt。/。的特定的唾液酸化的S^。更优选的混合物包含15-40wt。/。的N-乙酰化絲，40-60wt。/o的其它中性S^和15-30wt%的唾液酸化的斜l特别优选的混合物是30wt。/。的N-乙酰化寡糖，50wt%的中性寡糖和20wt。/。的唾液酸化的寡糖。可选的，混合物可以适宜的包含5-20wt。/。的特定的N-乙酰化S^瞎，60-90wt。/o的特定的中性^t和5-30wt。/。的特定的唾液酸化的S^t。可以从一种或多种动物乳中制备本发明的M混合物。可以从任何哺乳动物中获得乳，特别是从奶牛、山羊、水牛、马、大象、骆驼或绵羊。可选的可以通过购买和混合单个组分来制备，混合物。例如，合成的半乳^t，例如商标为Vivinal⑧和Elix，or⑧的Gal卩l，6Gaipi，4Glc、Gaipi，6Gaipi，6Glc、Gaipi，3Gaipi，4Glc、Gaipi，6Gal|31，6Gaipi，4Glc、Galpl，6Gaipi，3Galpl，4Glc和Gal(51,3Gal(51，6Gaipi，4Glc及其混合物是可商购的。其它寡糖供应商是西格玛-阿尔德里克化学公司德斯科实验室(DextraLaboratories,Sigma-AldrichChemieGmbH)和可瓦哈克公司(KyowaHakkoKogyo公司)。可选的，可以使用特定的糖基转移酶例如半乳糖基转移酶来生产中性寡糖。可以通过氨基葡糖苷酶和/或氨基半乳糖苷酶对N-乙酰基-葡萄糖和/或N-乙酰基半乳糖的作用来制备N-乙酰化寡糖。相同的，N-乙酰基-半乳糖基转移酶和/或N-乙酰基-糖基转移酶也可以用于该目的。还可以通过使用不同的酶(重组的或天然的)的发酵技术和/或微生物发酵来生产N-乙酰化寡糖。在后一种情况下，；敞生物可以表达它们的天然的酶和底物，或者可以被改造为生产不同的底物和酶。可以使用单个微生物培养物或混合培养物。可以从DP=1起始的任何聚合度(DP)开始，通过接纳体底物开始N-乙酰化寡糖形成。另一个选择是从游离或与S^(例如，乳酮糖)结合的己酮糖(例如，果糖)化学转换为N-乙酰己糖胺或含有寡糖的N-乙酰己糖胺，如Wrodnigg,T.M.;Stutz，A.E.(1999)Angew.Chem.Int.Ed.38:827-828中描述的。可以通过色语或过滤技术从天然来源例如动物乳中分离唾液酸化的寡糖3，唾液酸-乳糖和6，唾液酸-乳糖。可选的，可以通过使用特定的唾液酸转移酶的生物技术来生产它们，所述生物技术或者是通过基于酶的发酵技术(重组的或天然的酶)或者是通过微生物发酵技术。在后一种情况下，微生物可以表达它们的天然的酶和底物，或者可以被改造为生产不同的底物和酶。可以使用单个微生物培养物或混合培养物。可以从DP-1起始的任何聚合度(DP)开始，通过接纳体底物开始唾液酸寡糖形成。在本发明的优选的方面，上述，混合物被掺入到食品中。在本发明的背景中，术语"食物产品，，意在涵盖任何可消费的物质。因此，它可以是意在,iLA消费的产品，特别是嬰儿配方乳、后续配方乳、幼儿食品例如婴儿谷类食品等。特别的，本发明的S^混合物可以掺入到嬰儿配方乳、脱7jC奶粉或谷类食品混合物中。可以根据食物的类型以本领域已知的任何合适的方法制备食物产品，并且在生产过程中的合适阶段将本发明的，混合物添加到产品中。例如，可以通过将蛋白质源、除乳糖以外的任何糖类和脂肪源以合适的比例混合在一起来制备婴儿配方乳。如果需要可以添加乳化剂。此时可加入维生素和矿物质，但通常随后再加入以避免热降解。任何亲脂性维生素、乳化剂等都可以在混合之前溶解于脂肪源中。水，优选的已经过反渗透的水，可随后混合进去以形成液体混合物。然后，可以对液体混合物加热处理以减少细菌负载量(load)。例如，可以快速加热液体混合物到约80。C至约110。C范围约5秒钟至约5分钟。这可以通过注蒸汽或通过热交换器例如板式热交换器来完成。然后，将液体混合物冷却至约6(TC至约85'C,例如通过瞬时冷却。然后将液体混合物搅匀，例如以两个阶段进行，在第一阶段中在大约7Mpa至大约40Mpa下，第二阶段中在大约2Mpa至大约14Mpa下。然后进一步冷却搅匀的混合物，以添加任何热敏感成分例如维生素和矿物质。此时方{更的对搅匀的混合物的pH和固体含量进行标准化。将搅匀的混合物转移至合适的干燥设备中，例如喷雾干燥器或冷冻干燥器，将其转变为粉末。该粉末应该具有以重量计少于约5%的含湿量。优选的通过干燥混合将本发明的寡糖混合物直接添加到嬰儿配方乳中。但是，如果它是从动物乳中制备的，例如如下所述，则可以不用首先去除所有乳糖就方便地添加，混合物。由于婴儿配方乳含有的糖类成分通常全部或部分的由乳糖构成，对本领域技术人员而言显而易见的是，考虑到*#混合物提供的额外的糖类，而需要调整嬰儿配方乳中的糖类的量。幼儿或嬰儿食物产品或配方乳中的，混合物的终浓度优选的以干物质的重量计在0.3-4%,优选的在0.75-1.54%。这对应于每升复水配方乳0.2至5克的浓度，优选的l至2g/1。但是，这些量不应视为限制性的，并且应该根据目标群体进行调整，例如，基于幼儿或婴儿的体重和年龄或健康进行调整。优选的，每次喂养时给幼儿喂养含有本发明的，混合物的配方乳或食物。可选的，可以通过湿混合将，混合物添加到湿的婴儿或成人食物产品中。混合物可以以每升产品约0.2至5克S^t的浓度添加到幼儿或婴儿配方乳中。但是，这些量不应视为限制性的，并且应该根据目标群体进行适当调整，例如基于幼儿或嬰儿的体重和年龄，或者特定群体的健康进行调整。尽管补充特别针对婴儿或幼儿营养的食物产品是优选的，但补充非特别针对的或针对成A^体的食物产品也可以是有益的。例如，可以将本发明的S^混合物掺入到健康护理营养品和老年人营养品中。此类食物产品可包括奶、酸奶、凝乳、奶酪、发酵奶、基于奶的发酵产品、水激凌、基于发酵谷类的产品或基于奶的产品等。除了本发明的S^t混合物，食物产品例如婴儿配方乳还可以包含一种或多种单独添加的其它寡糖。现在将通过参考下列实施例对本发明进行阐述。实施例1下面仅通过实施例来描述一种制备根据本发明的，混合物的方法。将200,000升乳清超滤渗透物预浓缩至22%(w/w)总固体(TS)，在大约75。C巴氏消毒大约30秒，然后在60。C蒸发浓缩达到59%(w/w)的TS。在结晶器中以每小时2。C的速度将液体冷却24小时至结晶出乳糖。洗涤结晶的乳糖，然后通过绞拧机(wringer)将其除去。将剩余的液体(母液)通过倾析器进行澄清。将从倾析器获得的17.7%TS的77000升通过60。C蒸发再浓缩到55%(w/w)的TS,并将其在与前面相同的条件下进行第二次乳糖结晶步骤。将因此获得的29000升20.55TS的母液通过电渗析和离子交换的组合以本身已知的方法进行脱矿质，获得28500升的90%脱矿质的17.3%TS的液体。该液体含有每升大约1.5克的下述的混合物约30wt%的GalNAcal，3Gaipi，4Glc和Gaipi，6GalNAcal，3Gaipi，4Glc，50wt。/。的Gaipi，6Gaipi，6Glc、Galpl，6Gaipi，4Glc和Gal(51，3Gaipi，4Glc以及20wt。/o的NeuAca2，3Gaipi，4Glc和NeuAca2，6Gal(51，4Glc，根据起初原料，所述液体可以直接添加到食物产品例如嬰儿配方乳中，或者可以以本领域技术人员本身已知的方法进一步浓缩。例如，可以将液体中残留的乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，这些单糖可以通过纳米过滤去除或者如果需要的话，例如可以通过p-半乳糖苷酶的作用将半乳糖至少部分地聚合以产生半乳寡糖，所述产生的半乳寡糖也将被纳米过滤膜截留。实施例2<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例3在无菌小鼠中研究了根据本发明的Slt混合物对肠道小型生物群的建群和组成的效果。将C3H小鼠保持无菌直到8周龄，并用半合成的AIN餐喂食。在干扰的第1天，通过管饲法给予每只小鼠单剂量的人幼儿小型生物群混合物。将小鼠分为2组，将它们的M变为一组含有1.2%(w/w)乳糖作为额外的糖类的AIN餐，另一组含有1.2%(w/w)乳糖和2.5%(w/w)的本发明的絲混合物的AIN餐，所述混合物包含5。/。(w/w)唾液酸寡糖、5%(w/w)N-乙酰化絲和卯。/0(w/w)中性絲。在干扰14天后通过平板计数短M杆菌、长双歧杆菌和产气荚膜梭菌来评估小肠和粪便中的小型生物群的建群。从图l中可见在小肠中，特别是在粪便中定居的两种双歧杆菌都表现出增加的计数。另一方面，在小肠中，特别是在粪4更中产气荚膜梭菌计数下降。通过测量16SRNA的水平监控产气荚膜梭菌随饲喂时间的相对代谢活性。简而言之，从新鲜收集的粪便样品中抽提RNA,并将RNA进行RT-PCR反应以特异的扩增16SrRNA。通过变性梯度凝胶电泳分离PCR产物，并将产气荚膜梭菌的16SrRNA定量并且才艮据在伺喂期间维持恒定的大肠杆菌(E.coli)16SrRNA信号来归一化。如图2中可见，在干扰后仅一天(图2中的0天)，与对照组相比，产气荚膜梭菌的代谢活性就被根据本发明的OS混合物明显和显著的降低，并且在干扰的持续期内维持更低。实施例4将根据本发明的，混合物对肠内小型生物群的建群和组成的效果与单独的中性^#在限菌小鼠中的效果相比较。将C3H小鼠保持无菌至6周龄，并喂养半合成的AIN餐。通过管饲法给予每只小鼠单剂量的人幼儿小型生物群混合物，并且允许小型生物群自行建群两周。将小鼠分为3组，将它们的#改变为第一组含有1.2%(w/w)乳糖作为额外的糖类的AIN餐，第二组含有1.2%(w/w)乳糖和2.5%(w/w)半乳寡糖的AIN餐以及第三组含有1.2%(w/w)乳糖和2.5%(w/w)根据本发明的寡糖混合物的AIN餐，所述寡糖混合物包含5%(w/w)唾液酸S^t、5%(w/w)N-乙酰化S^和900/。(w/w)中性S^t。在干扰14天后通过平板计数短双歧杆菌、长双歧杆菌和产气荚膜梭菌来评估小肠和粪便中的小型生物群建群。从图3中可见，在餐中存在OS混合物时，小肠中，特别是在粪便中定居的两种双歧杆菌都表现出增加的计数。在仅存在中性半乳寡糖时，在小肠或粪便中定居的长双歧杆菌都没有表现出增加的计数。在存在根据本发明的OS混合物时，小肠以及粪便中的产气荚膜梭菌计数降低。然而，仅存在中性半乳寡糖时，在粪便中发现了增加的产气荚膜梭菌的水平。综上所述，这些发现强力的提示，根据本发明的S^混合物对小型生物群平衡具有比单独的中性，更优越的效果。权利要求1.寡糖混合物，其包含5-70wt％的、选自GalNAcα1，3Galβ1，4Glc和Galβ1，6GalNAcα1，3Galβ1，4Glc中的至少一种N-乙酰化寡糖，20-90wt％的、选自Galβ1，6Gal、Galβ1，6Galβ1，4GlcGalβ1，6Galβ1，6Glc、Galβ1，3Galβ1，3Glc、Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，3Galβ1，4GlcGalβ1，3Galβ1，6Galβ1，4Glc和Galβ1，3Galβ1，3Galβ1，4Glc中的至少一种中性寡糖，以及5-50wt％的、选自NeuAcα2，3Galβ1，4Glc和NeuAcα2，6Galβ1，4Glc中的至少一种唾液酸化的寡糖。2.权利要求1所述的，混合物，其包含10-70wt。/。的N-乙酰化寡糖，20-80wt。/o的中性寡糖和10-50wt。/。的唾液酸化的寡糖。3.权利要求1或2所述的，混合物，其包含15-40wt。/。的N-乙酰化象瞎，40-60wt。/o的中性S^和15-30wto/o的唾液酸化的寡糖。4.上述任一项权利要求中所述的S^t混合物，其包含30wt。/。的N-乙酰化,，50wt。/。的中性寡糖和20wt。/。的唾液酸化的,。5.权利要求l所述的^4I混合物，其包含5-20wt。/。的N-乙酰化寡糖，60-90wt。/。的中性寡糖和5-30wt。/。的唾液酸化的寡糖。6.上述任一项权利要求中所述的^t混合物，其来自动物乳。7.权利要求6所述的，混合物，其来自牛乳、山羊乳或水牛乳的一种或多种。8.权利要求1至6中任一项所述的^t混合物，其是合成制备的。9.食物产品，其包含前述任一项权利要求中所述的混合物。10.如权利要求9所述的食物产品，其是嬰儿配方乳。11.如权利要求9或10所述的食物产品，其包含基于干物质的以重量计0.3至4%的，混合物。全文摘要寡糖混合物，其包含5-70wt％的、选自GalNAcα1，3Galβ1，4Glc和Galβ1，6GalNAcα1，3Galβ1，4Glc中的至少一种N-乙酰化寡糖，20-90wt％的、选自Galβ1，6Gal、Galβ1，6Galβ1，4GlcGalβ1，6Galβ1，6Glc、Galβ1，3Galβ1，3Glc、Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，3Galβ1，4GlcGalβ1，3Galβ1，6Galβ1，4Glc和Galβ1，3Galβ1，3Galβ1，4Glc中的至少一种中性寡糖，以及5-50wt％的、选自NeuAcα2，3Galβ1，4Glc和NeuAcα2，6Galβ1，4Glc中的至少一种唾液酸化的寡糖；含有上述寡糖混合物的食品。文档编号A23L1/29GK101400267SQ200780008579公开日2009年4月1日申请日期2007年2月9日优先权日2006年2月10日发明者F·摩根,M·布劳恩,N·斯普伦格,R·贝罗卡尔申请人:雀巢产品技术援助有限公司