专利名称：适合在毕赤酵母中表达的抗氧化肽基因及其载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程技术，具体涉及的是采用基因工程手段设计、合成的抗氧化肽 基因及其载体，该载体可使抗氧化肽基因在毕赤酵母中组成型高水平表达，其表达产物为N 端和C端都完整的抗氧化肽Val-His-Leu-Lys-Pro。
(二)
背景技术：
自从Harman提出自由基理论以来，人们认识到人体内氧化产生的自由基与人的衰老和 许多疾病有关。人体在正常生理代谢过程中会产生少量的自由基，如超氧阴离子、羟基自由 基等，这些自由基通过与存在于体内的抗氧化酶及其他抗氧化剂的作用而被消除。因此，在 正常状态下，体内自由基维持在一定水平并处于动态平衡之中，并不表现出对组织、细胞功 能的损伤。然而，随着增龄或在某些病理状态下以及机体受到创伤时，过多的氧自由基不能 被及时清除而堆积在细胞内，致使它们与机体内的一些生物大分子，如蛋白质、核酸、脂质 等发生反应，生成大量氧化物或过氧化物，影响细胞物质和能量代谢的正常进行。抗氧化肽 能有效地清除体内过剩的活性氧自由基，保护细胞和线粒体的正常结构和功能，防止脂质过 氧化的发生。适当摄入具有抗氧化活性的物质可以降低体内自由基水平，防止脂质过氧化， 帮助机体抵御疾病。目前国内抗氧化活性肽仍处于初级开发应用阶段，对抗氧化肽的研究还 仅仅停留在实验室的生产和提取阶段。
随着生物工程技术的发展，越来越多高活性的抗氧化肽抗氧化剂近些年来在国内外发展 很快，用途也越来越广。抗氧化剂的种类很多，然而化学合成的抗氧化剂如BHA、 BHT等， 由于其本身具有毒、副作用，各国政府纷纷对其强制规定了 ADI值，控制其过量添加。于是 人们把目光逐步转向从各种植物、动物组织中提取天然抗氧化剂，如骨骼肌中的肌肽、大豆 蛋白水解得到的大豆肽等等。抗氧化活性多肽由于低毒、高效等特点，作为食品和机体的抗 氧化剂，是近年来国内外科学工作者们较热的研究课题，这些研究使人们对多肽的生物活性 有了新的认识，也为保健食品的开发提供了一个有前途的基料。然而以动物或植物蛋白为原 料通过生物技术或酶工程制取抗氧化肽，后期分离提取、纯化的研究中，脱盐问题一直没能 得到很好的解决，盐的存在一定程度上会影响抗氧化活性的测定。此外，目前的分离纯化手 段损失率较大，且很难纯化得到分子量相同的肽段。
本发明根据已知抗氧化活性的五肽Val-His-Leu-Lys-Pro，设计其基因组成，并且使该基 因在毕赤酵母中的分泌表达，从而制造出一株工程酵母，专门生产抗氧化肽 Val-His-Leu-Lys-Pro,提高肽的纯度的同时，简化了分离精制工艺，节省了设备投资，非常适 合工业化生产。
发明内容
本发明目的在于提供适合在毕赤酵母中表达的抗氧化肽基因及其载体。 本发明的目的是这样实现的
1. 适合在毕赤酵母中表达的抗氧化肽基因的设计
根据抗氧化肽Val-His-Leu-Lys-Pro的氨基酸序列、毕赤酵母密码子用法和高表达优越密 码子设计抗氧化肽基因。为适合该基因在毕赤酵母中的分泌表达，在基因的5'端引入了酵 母分泌信号肽切割位点。为了便于表达载体的构建，在基因的两端分别引入了XhoI、 Notl酶 切位点。即设计的串联基因的结构为XhoI-信号切割序列-抗氧化肽基因-终止密码子-NotI。
GCGGCCGC。信号切割序列与抗氧化肽基因的核苷酸序列间无间隔，以保证其分泌表达产物 N端和C端的完整性。
2. 抗氧化肽基因毕赤酵母表达载体的构建 根据目的基因序列，设计了以下2条寡核苷酸，用于基因合成。
将毕赤酵母表达载体pGAP用XhoI、 Notl双酶切，回收载体片段。将载体片段、AOP-l、 AOP-2混合，进行连接反应。 连接反应体系
去离子水 3pL 10x ligase Buffer 1 |iL
AOP-l (20pM) lnL AOP國2 (20一) lpL pGAP载体片段 3pL T4 ligase 1 jxL
总体积 lOpL 连接反应条件23'C过夜
将连接产物转化大肠杆菌DH5 a ,在含卡那霉素的LB平板上筛选转化子，将转化子送 交上海生工测序。获得含有目的序列(CTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGTTCAC TTGAAG CCATAAGCGGCCGC)的转化子，即为抗氧化肽基因毕赤酵母表达载体。该载体 转化毕赤酵母后分泌表达的抗氧化肽序列为Val-His-Leu-Lys-Pro。
本发明涉及一种基因工程技术，具体涉及的是采用基因工程手段设计、合成的抗氧化肽基因及其载体，该载体可使抗氧化肽基因在毕赤酵母中组成型高水平表达，其表达产物为N 端和C端都完整的抗氧化肽Val-His-Leu-Lys-Pro。毕赤酵母是一种代谢旺盛的真菌，将设计、 合成的乳源抗氧化肽基因转化到毕赤酵母中，制备出一株基因工程酵母，其代谢产物为N端 和C端都完整的抗氧化肽Val-His-Leu-Lys-Pro，为食品级抗氧化肽的生产提供了方便途径， 同时大大降低了生产成本，提高了产品安全性，具有很大的开发潜力。 具体实施方式
实施例
1. 适合在毕赤酵母中表达的抗氧化肽基因的设计
根据抗氧化肽Val-His-Leu-Lys-Pro的氨基酸序列、毕赤酵母密码子用法和高表达优越密 码子设计抗氧化肽基因。为适合该基因在毕赤酵母中的分泌表达，在基因的5'端引入了酵 母分泌信号肽切割位点。为了便于表达载体的构建，在基因的两端分别引入了XhoI、 Notl酶 切位点。即设计的串联基因的结构为XhoI-信号切割序列-抗氧化肽基因-终止密码子-NotI。
GCGGCCGC。信号切割序列与抗氧化肽基因的核苷酸序列间无间隔，以保证其分泌表达产物 N端和C端的完整性。
2. 抗氧化肽基因毕赤酵母表达载体的构建 根据目的基因序列，设计了以下2条寡核苷酸，用于基因合成。
AOP-l 5，- TC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT GTT CAC TTG AAG CCA TAA GC -3，
将毕赤酵母表达载体pGAP用XhoI、 Notl双酶切，回收载体片段。将载体片段、AOP-l、 AOP-2混合，进行连接反应。
连接反应体系
去离子水 10x ligase Buffer AOP-l (20,) AOP-2 (20,) pGAP载体片段 T4 ligase 总体积
连接反应条件23'C过夜
将连接产物转化大肠杆菌DH5 a
3|xL 1
luL lOpL
在含卡那霉素的LB平板上筛选转化子，将转化子送交测序。获得含有目的序列(CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT GTT CAC TTG AAG CCATAAGCGGCCGC)的转化子，即为抗氧化肽基因毕赤酵母表达载体。该载体转化毕赤 酵母后分泌表达的抗氧化肽序列为Val-His-Leu-Lys-Pro。适合在毕赤酵母中表达的抗氧化肽基因序列表
ctcgagaaaa gagaggctga agctgttcac ttgaagccat aagcggccgc 50
毕赤酵母中表达的抗氧化肽氨基酸序列表
Val His Leu Lys Pro
权利要求
1、一种适合在毕赤酵母中表达的抗氧化肽基因及其载体，其特征是设计的串联基因的结构为XhoI-信号切割序列-抗氧化肽基因-终止密码子-NotI，目的基因序列为CTC GAGAAA AGA GAG GCT GAA GCT GTT CAC TTG AAG CCA TAA GCGGCCGC。
2、 一种适合在毕赤酵母中表达的抗氧化肽基因及其载体，其特征是根据目的基因序列，设计了以下2条寡核苷酸，用于基因合成。将毕赤酵母表达载体pGAP用Xhol、 Notl双酶切，回收载体片段。将载体片段、AOP-l、 AOP-2混合，进行连接反应。连接反应体系去离子水 10x ligase Buffer AOP-l (20|iM) AOP-2 (20, pGAP载体片段 T4 ligase 总体积 连接反应条件23'C过夜将连接产物转化大肠杆菌DH5 a3nL 13nL在含卡那霉素的LB平板上筛选转化子，获得含有目的序列的转化子，即为抗氧化肽基因毕赤酵母表达载体。
全文摘要
本发明提供了一种适合在毕赤酵母中表达的抗氧化肽基因及其载体。设计的串联基因的结构为XhoI-信号切割序列-抗氧化肽基因-终止密码子-NotI。目的基因序列为CTC GAGAAA AGA GAG GCT GAA GCT GTT CAC TTG AAG CCA TAA GCGGCCGC。根据目的基因序列构建毕赤酵母的表达载体，获得含有目的序列的转化子，即为抗氧化肽基因毕赤酵母表达载体。该载体转化毕赤酵母后分泌表达的抗氧化肽序列为Val-His-Leu-Lys-Pro。
文档编号C12N15/81GK101457223SQ20081013758
公开日2009年6月17日 申请日期2008年11月21日 优先权日2008年11月21日
发明者孔保华, 杰 李, 李名远, 成 陈, 韩建春 申请人:东北农业大学