专利名称：Egfr基因突变筛查评估分子靶向药物疗效的检测方法
技术领域：
本发明涉及EGFR基因突变筛査评估分子靶向药物疗效的检测方法，利用直接测序的 方法对EGFR基因18-21号外显子进行突变检测，为针对性的靶向治疗提供依据，以避免不 合理用药，更好的为患者提供治疗方案，属于药物检测技术领域。
背景技术：
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一种广泛分布于人 体各组织细胞膜上的多功能糖蛋白，是HER/ErbB家族成员之一。该家族包括EGFR、 HER2、 HER3和HER4。 EGFR与其配体(EGF、 TGFa 、 HB — EGF、 amphiregulin、 betacellulin) 结合后在细胞表面形成二聚体。这种二聚体包括与其本身形成的同源二聚体和与erbB家 族其它成员形成的异源二聚体。受体二聚体化后，内在的蛋白激酶活化，TK磷酸化使信 号下传。从而，激活其下游的3条主要信号通路Ras2/Raf2/MAPK通路、磷脂酰三磷酸 肌醇(PI3K)和丝苏氨酸蛋白激酶(AKT)、 JAK和STAT通路。3条信号转导通路最终介导细 胞分化、生存、迁移、侵袭、黏附和细胞损伤修复等一系列过程。靶向EGFR的药物，通 过阻断信号传导，来达到治疗目的。
EGFR是一种跨膜受体，它属于一个包括四种相关蛋白的家族。每个受体可选择性地 与10种不同的配体结合。当一个配体结合一个单链EGFR后，受体形成二聚体，它通过 酪氨酸激酶的活性，激活受体自磷酸化，在细胞内发出信号。自磷酸化触发一系列胞内途 径，可导致癌细胞增殖、阻滞凋亡、活化(肿瘤)侵袭和转移，并刺激肿瘤诱导的新生血管 形成。EGFR的基因突变作为使用药物是否有效的一个重要因素。直到最近的研究发现，EGFR 的基因突变仍存在于外显子18 21，不同外显子的突变将导致构象变化，改变和增强蛋白 的活性，同样增强对TKI的敏感性。TKI通过与ATP竞争结合EGFR胞内酪氨酸激酶区，阻 止酪氨酸残基磷酸化，从而阻止EGFR信号通路的传导，最终达到抑制肿瘤增殖、转移、 血管生成等一系列肿瘤细胞生物活动。
表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)如阿瓦斯丁 (AVASTIN)，特罗凯 (Erlotinib)，吉非替尼(gefitinib,又称易瑞沙，Iressa);西妥昔单(Erbitux)等能通 过抑制肿瘤发生、发展中必须的表皮生长因子受体酪氨酸激酶阻断肿瘤细胞的信号传导， 从而达到抑制肿瘤细胞的增生、侵袭、转移、血管生成并促进肿瘤细胞的调亡。根据药物的作用耙点和性质，可将耙向EFGR药物分为两类 一类是单克隆抗体(Cetuximab， ABX-EGF， EMD 72000等)，通过识别受体的胞外区，竞争与配体结合，干扰EGFR的自身 磷酸化及阻碍细胞表面EGFR 二聚体形成，抑制信号传导系统激活，从而抑制肿瘤细胞增 殖；另一类是小分子的化合物(IRESSA， Erlotinib, EKB2569等)，能进入细胞内，直接 作用于EGFR的胞内区，干扰ATP结合，抑制酪氨酸的活性阻断激酶的自身磷酸化及底物 的磷酸化，彻底阻断异常的酪氨酸激酶信号传导。虽然两类药物的作用部位不同，但通过 阻止配体介导的受体及下游信号通路的激活，最终产生相似的效果，即阻滞细胞在G1期、 促进凋亡、抑制新生血管形成、抑制侵袭和转移，从而起到治疗作用。
Lynch等和Paez等首先报道了位于EGFR酪氨酸激酶编码区第18 21外显子的突变与 gefitinib的有效率明显相关。实验证实EGFR基因突变能导致细胞功能改变，Lynch等发 现导入del747 753InsS和L858R的细胞与具有野生型EGFR的细胞相比，EGFR蛋白的表 达水平相当，加入EGF后EGFR突变体的磷酸化程度更高，持续时间更长。Paez等发现携 带L858R的H325S细胞对gefitinib的敏感性比野生型细胞高100倍；gefitinib不但抑 制EGFR自我磷酸化，还抑制EGFR下游分子ERK1/2和AKT激酶的磷酸化。EGFR基因共28 个外显子.其中编码酪氨酸激酶区的是第18 21外显子。对EGFR基因突变的数据分析表 明，尽管突变部位分散在整个酪氨酸激酶编码区，但89%的突变集中在第19外显子的缺 失和第21外显子的L858R点突变。
实验证实有功能的突变EGFR是一种糖蛋白的跨膜受体，是酪氨酸激酶生长因子受体 家族的成员。 一旦EGFR胞外部分与配体相结合，就会在细胞表面形成受体同源二聚体或 异源二聚体。EGFR最常见的异源二聚体化类型是Her-2。该二聚体化改变了受体的构象， 导致受体胞内结构的特定酪氨酸残基自身磷酸化，激活其下游信号途径，将外界信号转导 至细胞内，这种突变的基因被转染到细胞后，提高了细胞对EGF的反应性，也明显增加了 对gefitinib的敏感性。
Lynch等认为这种现象可能是由于EGFR突变使EGFR酪氨酸激酶ATP结合位点的某些 关键基团发生重构，增强了与ATP或其竞争性抑制剂gefitinib的相互作用。因此，有突 变EGFR基因的患者表现出对gefitinib更好的治疗反应。Paez等率先分析了 119例NSCLC 患者的突变与临床特征的关系，发现EGFR突变发生率在腺癌中高于其他病理类型，女性 高于男性。此次实验全部选择原发性肺腺癌患者，结果男性EGFR基因突变发生率明显低 于女性，与Paez等人的结果相符。美国非小细胞肺癌的患者中只有约10X有EGFR的基因 突变，然而在亚洲人中，约30X的非小细胞肺癌患者有EGFR的基因突变。本实验中腺癌
6EGFR突变率为37.6%，高于非小细胞肺癌的平均突变率，这也说明在中国人腺癌中的突 变率高于其他病理类型的突变率，而且明显高于欧美人。Pao等发现不吸烟NSCLC患者的 EGFR突变率高于既往吸烟的患者，本研究中，无吸烟史病例EGFR基因突变发生率为47. 1 %,也明显高于有吸烟史者，与有些文献报道一致。以EGFR受体酪氨酸激酶为靶点抗肿 瘤药物已经成为晚期肺癌治疗的一种新选择。由于NSCLC中EGFR基因突变与TKIs治疗敏 感性显著相关，临床上应根据EGFR突变情况来选择用药。
发明内容
本发明的目的是提供一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制药物疗效的检测方法，可 用于评估易瑞沙类药物治疗肿瘤的疗效。
为了实现以上目的，本发明的技术方案是提供一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制
药物疗效的检测方法，其特征在于，具体步骤为 步骤1.采集被测者血清或肿瘤组织样本； 步骤2。基因组DNA的抽提方法
采用硅胶吸附法抽提步骤1中被测者DNA，抽提时间为2-3小时，采用电泳凝胶成像 法对DNA浓度和纯度作检测，肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检 测；
步骤3.基因分型
将每一个被测者样本分别放入4个反应孔，4个反应孔分别检测EGFR基因18-21号 外显子突变情况，采用PCR技术进行扩增、凝胶电泳技术检测纯度、测序技术对这些位点 进行基因型进行确定
步骤3-l，反应体系配置
在每一个反应孔中加入PCR标准反应体系，标准反应体系的引物浓度为10uM，反应 体系总体积为20ul，其中，PCR试剂(天根生化KT202-12) 5ul，正向引物和反向引物各 0.4ul， 20ngM的步骤2得到的EGFR DNA模板3ri，去离子水11.2ul;
EGFR基因第18外显子正向和反向引物
正相弓l物s ttccaaatgagctggcaagt
反向引物gtcaatggcccctttcataa
EGFR基因第19外显子正向和反向引物
正相弓l物ccccagcaatatcagcctta
反向引物agtgctgggtagatgccagtEGFR基因第20外显子正向和反向引物 正相弓l物gcacagcttttcctccatga 反向引物gatgggacaggcactgattt EGFR基因第21外显子正向和反向引物 正相引物actaacgttcgccagccata 反向弓l物tcattcactgtcccagcaag 步骤3-2， PCR反应条件
将反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为95。C预热15分钟；再进 行35个循环的95。C、 45秒；60°C、 45秒；72°C、 60秒；72°C、 7分钟后降温至4。C;
步骤3-3，将反应孔在PCR扩增仪反应后的产物进行电泳检测，有肉眼可见清晰白色 条带即可进入下一步
a. lwtM琼脂糖凝胶插小号孔梳子；
b. 2000bpDNA标记物6ul
c. 步骤3-2的PCR产物4ul加入电泳缓冲液lul
d. 电泳电压120v
e. 电泳时间20min拍摄一张电泳图；30min拍摄一张电泳图； 步骤3-4，纯化
终浓度PCR产物纯化试剂0. 2U SAP+ PCR产物纯化试剂2. 5U EX0N1/ 7ul;
在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系总体积为7ul、去离子水ddH20 3。825ul、 PCR产物纯化试剂SAP 0. 05ul、PCR产物纯化试剂EX0N1 0.125ul、步骤3-3的PCR产物3ul; 反应条件为37°C 、 60min; 80°C、 15min; 4'C恒温保存;
步骤3-5，将纯化后的每一个反应孔进行测序，引物浓度为luM， ABI 3730测序仪；
步骤3-5-1，从-20度冰箱中取出步骤3-4的PCR纯化产物、测序试剂BigDye、四种 dNTP、 luM测序引物，18-21号外显子测序引物分别为ttccaaatgagctggcaagt; ccccagcaatatcagcctta; gcaca-gcttttcctccatga; actaacgttcgccagccata;
步骤3-5-2，记录日期、所作反应的PCR纯化产物名、所用引物、反应体系、测序试 剂用量、PCR反应条件；
步骤3-5-3，取一块反应板，标上模板名、测序引物名、日期；
步骤3-5-4，每个样本需做两个PCR反应，用一个反应孔；
步骤3-5-5，在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系为0.5ul的BigDye、 1. 4ul的dNTP、 2ul的测序引物、3ul的PCR纯化产物、0. lul的去离子水ddH20;体系分装好后，
上离心机，达900转/分即停；
步骤3-5-6，将反应板放在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为预热96
'C10秒；再进行25个循环的96°C、 10秒；50°C、 5秒；60°C、 4分钟；60°C、 4分钟后
降温至4'C恒温保存；
步骤3-5-7，扩增结束后，在每孔加入lul 125raM乙二胺四乙酸EDTA;
步骤3-5-8，再在每孔加入无水乙醇15ul于室温进行沉淀，不得超过24小时；
步骤3-5-9，将96孔板放入冰冻离心机，3650转/分，4。C离心30分钟；
步骤3-5-10,轻轻倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，再在每孔加30ul 70wt%
乙醇，3650转/分，4'C离心15分钟，轻轻倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，
将残余酒精风干，室温放置20分钟；
步骤3-5-11，每孔加入8ul 95wtM甲酰胺与ddH20混合物；
步骤3-5-12，在ABI 3730上进行结果读取，用软件Chromas査阅测序检测结果18-21 每个外显子都2类结果，即正常结果和突变结果； 步骤4，结果分析
1，未检出突变您的检测结果中未发现EGFR基因第18-21号外显子上存在突变； 2.检出突变您的检测结果中发现EGFR基因第18-21号外显子上存在突变。
本发明对EGFR基因第18-21号外显子上进行检测，相应位点特异性引物的设计以及 用于序列测定的实验方案、试剂以及报告生成系统，通过同时检测分析个体的EGFR基因 第18-21号外显子上是否存在突变来评估用于治疗癌症个体的表皮生长因子受体酪氨酸激
酶抑制剂类药物的有效性。
采集样本的类型为血清样本，采用硅胶吸附法抽提DNA具有所需样品量少，抽提质量
稳定，抽提产物纯度高，操作简便的特点。
利用本发明对超过100例以上中国人群样本的检测结果显示，根据上述方法进行的 EGFR基因第18-21号外显子上基因型检测检出率可达99%以上，结果可重复性达到100%。
本发明的优点是可用于检测癌症个体的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂类药物。
图1为7个样本PCR后产物的电泳结果图2为EGFR基因第18号外显子实验无突变结果示意图3为EGFR基因第19号外显子实验无突变结果示意9图4为EGFR基因第20号外显子实验无突变结果示意图； 图5为EGFR基因第21号外显子实验无突变结果示意图； 图6为EGFR基因第18号外显子实验突变结果示意图； 图7为EGFR基因第19号外显子实验突变结果示意图； 图8为EGFR基因第20号外显子实验突变结果示意图； 图9为EGFR基因第21号外显子实验突变结果示意图。
具体实施例方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例
一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制药物疗效的检测方法，具体步骤为 步骤1.采集被测者血清或肿瘤组织样本； 步骤2.基因组DNA的抽提方法-
采用硅胶吸附法抽提步骤1中被测者DNA，抽提时间为2-3小时，采用电泳凝胶成像 法对DNA浓度和纯度作检测，肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检 测；
步骤3.基因分型
将每一个被测者样本分别放入4个反应孔，4个反应孔分别检测EGFR基因18-21号 外显子突变情况，采用PCR技术进行扩增、凝胶电泳技术检测纯度、测序技术对这些位点 进行基因型进行确定
步骤3-l，反应体系配置
在每一个反应孔中加入PCR标准反应体系，标准反应体系的引物浓度为10uM，反应 体系总体积为20ul，其中，PCR试剂(天根生化KT202-12) 5ul，正向引物和反向引物各 0.4ul， 20ngM的步骤2得到的EGFR DNA模板3W，去离子水11.2ul;
EGFR基因第18外显子正向和反向引物
正相弓l物ttccaaatgagctggcaagt
反向弓l物gtcaatggcccctttcataa
EGFR基因第19外显子正向和反向引物
正相弓l物ccccagcaatatcagcctta
反向弓l物agtgctgggt卿tgccagt
EGFR基因第20外显子正向和反向引物正相弓l物gcacagcttttcctccatga 反向弓l物gatgggacaggcactgattt EGFR基因第21外显子正向和反向引物 正相弓l物actaacgttcgccagccata 反向弓l物tcattcactgtcccagcaag 步骤3-2， PCR反应条件
将反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为95'C预热15分钟；再进 行35个循环的95。C、 45秒；6(TC、 45秒；72°C、 60秒；72°C、 7分钟后降温至4。C;
步骤3-3，将反应孔在PCR扩增仪反应后的产物进行电泳检测，有肉眼可见清晰白色 条带即可进入下一步
a. lwtM琼脂糖凝胶插小号孔梳子；
b. 2000bpDNA标记物6ul
c. 步骤3-2的PCR产物4ul加入电泳缓冲液lul
d. 电泳电压120v
e. 电泳时间20min拍摄一张电泳图；30min拍摄一张电泳7个样本PCR后产物，25ng/ul的电泳结果图，目的条带800bp左右； 如图1所示，为7个样本PCR后产物的电泳结果图。 步骤3-4，纯化
终浓度PCR产物纯化试剂0. 2U SAP+ PCR产物纯化试剂2. 5U EXON1/ 7ul;
在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系总体积为7ul、去离子水ddH20 3 . 82 5ul、 PCR产物纯化试剂SAP (promega M8201 ) 0.05ul 、 PCR产物纯化试剂EXONl (NEB M0293V)0. 125ul、步骤3-3的PCR产物3ul;反应条件为37°C 、 60min; 80°C、 15min; 4'C恒温保存；
步骤3-5，将纯化后的每一个反应孔进行测序，引物浓度为luM， ABI 3730测序仪； 步骤3-5-1，从-20度冰箱中取出步骤3-4的PCR纯化产物、测序试剂BigDye(PE
Applied Biosystems 4337574 )、四种dNTP、 luM测序引物，18-21号外显子测序引物分
另ij为ttccaaatgagctggcaagt ; ccccagcaatatcagcctta ; gcacagcttttcctccatga ;
actaacgttcgccagccata;
步骤3-5-2，记录日期、所作反应的PCR纯化产物名、所用引物、反应体系、测序试
剂用量、PCR反应条件；
11步骤3-5-3，取一块反应板，标上模板名、测序引物名、日期；步骤3-5-4，每个样本需做两个PCR反应，用一个反应孔；
步骤3-5-5，在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系为0. 5ul的BigDye、 1.4ul的dNTP、 2ul的测序引物、3ul的PCR纯化产物、0. lul的去离子水ddH20;体系分装好后，上离心机，达900转/分即停；
步骤3-5-6，将反应板放在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为预热96。C10秒；再进行25个循环的96°C、 10秒；50°C、 5秒；60°C、 4分钟；60°C、 4分钟后降温至4'C恒温保存；
步骤3-5-7，扩增结束后，在每孔加入lul 125mM乙二胺四乙酸EDTA;
步骤3-5-8，再在每孔加入无水乙醇15ul于室温进行沉淀，不得超过24小时；
步骤3-5-9，将96孔板放入冰冻离心机，3650转/分，4。C离心30分钟；
步骤3-5-10，轻轻倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，再在每孔加30ul 70wt%乙醇，3650转/分，4t;离心15分钟，轻轻倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，将残余酒精风干，室温放置20分钟；
步骤3-5-11，每孔加入8ul 95wty。甲酰胺与ddH20混合物；步骤3-5-12，在ABI 3730上进行结果读取，用软件Chromas査阅测序检测结果18-21每个外显子都2类结果，即正常结果和突变结果；如图2所示，为EGFR基因第18号外显子实验无突变结果示意图；如图3所示，为EGFR基因第19号外显子实验无突变结果示意图；如图4所示，为EGFR基因第20号外显子实验无突变结果示意图；如图5所示，为EGFR基因第21号外显子实验无突变结果示意图。图6为EGFR基因第18号外显子实验突变结果示意图；图7为EGFR基因第19号外显子实验突变结果示意图；图8为EGFR基因第20号外显子实验突变结果示意图；图9为EGFR基因第21号外显子实验突变结果示意图。被测者EGFR基因第18-21号外显子的图片与上述正常结果相同，均无突变。
步骤4.最后得出检测结果，给出结果分析如下大量研究表明EGFR基因第18-21号外显子的突变与表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂类药物治疗癌症疗效有密切关系。EGFR突变使EGFR酪氨酸激酶ATP结合位点的某些关键基团发生重构，增强了与ATP或其竞争性抑制剂吉非替尼(gefitinib，又称易瑞沙，Iressa)的相互作用，个体使用表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂类药物治疗肿瘤效果佳，相反如果EGFR18-21号外显子不存在突变，那么个体使用表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂类药物治疗肿瘤效果不佳。您的检测结果中不存在EGFR基因第18-21号外显子突变。
12序列表
〈110〉上海中优医药高科技有限公司
〈120>EGFR基因突变筛查评估分子耙向药物疗效的检测方法〈歸12
<210〉 1〈211〉 600<212〉 DNA
〈213〉人(Homo sapiens)
〈400> 1
taccaacttctgtcaagctctgt卿g犯ggcgtacatttgtccttccaaatgagctggc60
aagtgccgtgtcctggcacccaagcccatgccgtggctgctggtccccctgctgggccat120
gtctggcactgctttccagc3tggtg鄉gctgaggtgacccttgtctctgtgttcttgt180
CCCCCCC3gCttgtggagcctcttacaccc观tgg卿agctccc犯cceLagctctcttg240
aggatcttgaagg3犯ctgaiattca^a犯gatcaaagtgctgggctccggtgcgttcggc300
acggtgtataaggtaaggtccctggcacaggcctctgggc tgggccgcagggcctctcat360
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ttgtttcac"tgagtgtttgggaaactccagtgtttttcccaagttattgag￡lgga￡L3tCt480
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〈210> 1
〈211〉 600
<212〉 DNA
〈213〉人(Homo sapiens)
〈400〉 2
aggctttaca agcttgagattcttttatcttgtgattcgtggagccc33c60
agctgcagggctgcgggggcgtcacagcccccagcaatatcagccttaggtgcggctcca120cagccccagtgtccctcaccttcggggtgcatcgctggta￡LC￡ltCC3CCCagatcactgg180
gcagcatgtggcaccatctc8LC33ttgCC8gttaacgtcttccttctctctctgtcatag240
ggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaattcccgtcgctatcaaggaattaaga300
g犯gC33C3tctccgaaagcatcctcgatgtgagtttctgctttgctgtg360
tgggggtccatggctctgaacctcaggcccaccttttctcatgtctggcagctgctctgc420
tctagaccctgctcatctccacatcctaaatgttcactttctatgtctttccctttctag480
ctctagtgggtataactccctccccttagagacagcactggcctctcccatgctggtatc540
caccccaaaaggctgg犯acaggcaattactggcatctacccagcactagtttcttgaca600
〈210〉 1
〈211〉 600
〈212〉 DNA
〈213〉人(Homo sapiens)
〈400> 3
cgtccctgtgctaggtcttttgcaggcacagcttttcctccatgagtacgtattttgaaa60
ctcaagatcgcattcatgcgtcttcacctggsaggggtccatgtgcccctccttctggcc120
accatgcgaagccacactgacgtgcctctccctccctccaggaagcctacgtgatggcca160
gcgtggacaacccccacgtgtgccgcctgctgggcatctgcctcacctccaccgtgcagc240
tcatcacgcagctcatgcccttcggctgcctcctggactatgtccgggaa300
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gg卿tacggggagggg卿taaggagccaggatcctcacatgcggtctgcgctcctggg420
atagc犯g3gtttgccatggggatatgtgtgtgcgtgcatgcagcac3cacacattcctt480
tattttggattca3tcaagttgatcttcttgtgcacaaatcagtgcctgtcccatctgca540
"tg"tggaaactctcalcaatcagctacctttgaag犯ttttctctttattgagtgctcagt600
<210〉 1〈211〉 600〈212〉 DNA
〈213〉人(Homo sapiens)<400〉 4
C3gC3gCgggttacatcttctttcatgcgcctttccattctttggatcagtagtcactsLa 60cgttcgccagccataagtcctcgacgtggag鄉ctc卿gcctggcatgaacatgaccc120
tg犯ttcggatgcagagcttcttcccatgatgatctgtccctcacagc3gggtcttctct180
gtttcagggcatg￡Lact￡icttggaggaccgtcgcttggtgcaccgcgacctggC8LgCCag240
gaacgtactgcgcagcatgtcaagatcacag3ttttgggCtggccaaact300
gctgggtgcgaataccatgcaaagtaaggaggtggcttta360
ggtcagccagcattttcctgacaccagggaccaggctgccttcccactagctgtattgtt420
taacacatgcgctctccagacattctgggtgagctcgcagcagctgctgc480
tggcagctgggtccagccagggtctcctggtagtgtgagccagagctgctttggg￡l￡LC6Lg540
tacttgctgggacagtgaatgaggatgttatccccaggtgatcattagcaaatgttaggt600
〈210>5〈211>20〈212〉腿<213>人工序列
〈220〉
〈223〉用于EGFR基因第18号外显子序列扩增的正向引物。<400〉5
ttccaaatga gctggcaagt 20
〈210>6<211〉20〈212〉腿<213>人工序列
〈220>〈223〉用于EGFR基因第18号外显子序列扩增的反向引物。<400〉6
gtcaatggcc cctttcataa 20
〈210〉7<211〉20〈212>腿<213〉人工序列
〈220〉
〈223>用于EGFR基因第19号外显子序列扩增的正向引物。<400〉7
ccccagcaat atcagcctta 20
〈210>8<211〉20〈212〉 DNA<213>人工序列
〈220>
〈223〉用于EGFR基因第19号外显子序列扩增的反向引物。〈400〉8
agtgctgggt agatgccagt 20
<210〉9〈211>20〈212> DNA
16〈213〉人工序列 〈220>
〈223〉用于EGFR基因第20号外显子序列扩增的正向引物。 <棚>9
gcacagcttt tcctccatga 20
〈210>10 〈211〉20 〈212> DNA 〈213〉人工序列
〈220>
〈223〉用于EGFR基因第20号外显子序列扩增的反向引物。 <400>10
gatgggacag gcactgattt 20
<210>11 〈211〉20 <212>廳 〈213〉人工序列
〈220〉
〈223〉用于EGFR基因第21号外显子序列扩增的正向引物。 〈400〉11
actaacgttc gccagccata 20
17〈210〉12 〈211>20 〈212> DNA <213>人工序列
〈220〉
〈223〉用于EGFR基因第21号外显子序列扩增的反向引物。 <400>12
tcattcactg tcccagcaag 20
权利要求
1、一种EGFR基因突变筛查评估分子靶向药物疗效的检测方法，其特征在于，具体步骤为步骤1.采集被测者血清或肿瘤组织样本；步骤2.基因组DNA的抽提方法采用硅胶吸附法抽提步骤1中被测者DNA，抽提时间为2-3小时，采用电泳凝胶成像法对DNA浓度和纯度作检测，肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；步骤3.基因分型将每一个被测者样本分别放入4个反应孔，4个反应孔分别检测EGFR基因18-21号外显子突变情况，采用PCR技术进行扩增、凝胶电泳技术检测纯度、测序技术对这些位点进行基因型进行确定步骤3-1，反应体系配置在每一个反应孔中加入PCR标准反应体系，标准反应体系的引物浓度为10uM，反应体系总体积为20ul，其中，PCR试剂5ul，正向引物和反向引物各0.4ul，20ng/μl的步骤2得到的EGFR DNA模板3μl，去离子水11.2ul；EGFR基因第18外显子正向和反向引物正相引物ttccaaatgagctggcaagt反向引物gtcaatggcccctttcataaEGFR基因第19外显子正向和反向引物正相引物ccccagcaatatcagcctta反向引物agtgctgggtagatgccagtEGFR基因第20外显子正向和反向引物正相引物gcacagcttttcctccatga反向引物gatgggacaggcactgatttEGFR基因第21外显子正向和反向引物正相引物actaacgttcgccagccata反向引物tcattcactgtcccagcaag步骤3-2，PCR反应条件将反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为95℃预热15分钟；再进行35个循环的95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、60秒；72℃、7分钟后降温至4℃；步骤3-3，将反应孔在PCR扩增仪反应后的产物进行电泳检测，有肉眼可见清晰白色条带即可进入下一步a.1wt％琼脂糖凝胶插小号孔梳子；b.2000bpDNA标记物6ulc.步骤3-2的PCR产物4ul加入电泳缓冲液1uld.电泳电压120ve.电泳时间20min拍摄一张电泳图；30min拍摄一张电泳图；步骤3-4，纯化终浓度PCR产物纯化试剂0.2U SAP+PCR产物纯化试剂2.5U EXON1/7ul；在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系总体积为7ul、去离子水ddH2O 3.825ul、PCR产物纯化试剂SAP 0.05ul、PCR产物纯化试剂EXON10.125ul、步骤3-3的PCR产物3ul；反应条件为37℃、60min；80℃、15min；4℃恒温保存；步骤3-5，将纯化后的每一个反应孔进行测序，引物浓度为1uM，ABI 3730测序仪；步骤3-5-1，从-20度冰箱中取出步骤3-4的PCR纯化产物、测序试剂BigDye、四种dNTP、1uM测序引物，18-21号外显子测序引物分别为ttccaaatgagctggcaagt；ccccagcaatatcagcctta；gcacagcttttcctccatga；actaacgttcgccagccata；步骤3-5-2，记录日期、所作反应的PCR纯化产物名、所用引物、反应体系、测序试剂用量、PCR反应条件；步骤3-5-3，取一块反应板，标上模板名、测序引物名、日期；步骤3-5-4，每个样本需做两个PCR反应，用一个反应孔；步骤3-5-5，在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系为0.5ul的BigDye、1.4ul的dNTP、2ul的测序引物、3ul的PCR纯化产物、0.1ul的去离子水ddH2O；体系分装好后，上离心机，达900转/分即停；步骤3-5-6，将反应板放在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为预热96℃10秒；再进行25个循环的96℃、10秒；50℃、5秒；60℃、4分钟；60℃、4分钟后降温至4℃恒温保存；步骤3-5-7，扩增结束后，在每孔加入1ul 125mM 乙二胺四乙酸EDTA；步骤3-5-8，再在每孔加入无水乙醇15ul于室温进行沉淀，不得超过24小时；步骤3-5-9，将96孔板放入冰冻离心机，3650转/分，4℃离心30分钟；步骤3-5-10，轻轻倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，再在每孔加30ul 70wt％乙醇，3650转/分，4℃离心15分钟，轻轻倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，将残余酒精风干，室温放置20分钟；步骤3-5-11，每孔加入8ul 95wt％甲酰胺与ddH2O混合物；步骤3-5-12，在ABI 3730上进行结果读取，用软件Chromas查阅测序检测结果18-21每个外显子都2类结果，即正常结果和突变结果；步骤4，结果分析(1).未检出突变您的检测结果中未发现EGFR基因第18-21号外显子上存在突变；(2).检出突变您的检测结果中发现EGFR基因第18-21号外显子上存在突变。
全文摘要
本发明涉及EGFR基因突变筛查评估分子靶向药物疗效的检测方法，其特征在于，具体步骤为采集被测者血清或肿瘤组织样本，进行基因组DNA的抽提，对EGFR基因第18-21号外显子进行检测，相应位点特异性引物的设计以及用于序列测定的实验方案、试剂以及报告生成系统，通过同时检测分析个体的EGFR基因第18-21号外显子是否存在突变，来评估用于治疗癌症个体的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂类药物的有效性。本发明的优点是可用于癌症个体表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂类药物的应用。
文档编号C12Q1/68GK101654701SQ20091005620
公开日2010年2月24日 申请日期2009年8月10日 优先权日2009年8月10日
发明者傅咏南, 毛丹丹 申请人:上海中优医药高科技有限公司