专利名称：一种Stat3基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用的制作方法
一种Stat3基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应
用
技术领域：
本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种Stat3基因的原位杂交检测试剂盒及 其检测方法和应用
背景技术：
癌症也叫恶性肿瘤，肿瘤是指机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞异常 增生而形成的局部肿块。癌症病变的基本单位是癌细胞。人体细胞老化死亡后会有新生 细胞取代它，以维持机体功能，人体绝大部分细胞都可以增生，但这种增生是有限度的，而 癌细胞的增生则是无止境的，这使患者体内的营养物质被大量消耗。同时，癌细胞还能释放 出多种毒素，使人体产生一系列症状，晚期时它转移到全身各处生长繁殖，最后导致人体消 瘦、无力、贫血、食欲不振、发热及脏器功能受损等，器官功能衰竭而死亡。最近的相关文献报道Stat3是癌基因，在大部份癌症中它具有促进癌细胞恶变， 并促进细胞转移。STAT信号传导与转录激活因子(Signal Transducer andActivator of Transcription, STAT)蛋白家族是一组可以被不同的细胞因子受体激活的相关蛋白，在细 胞因子-受体相互作用的过程中充当载体，保持信号在细胞内传递的内在特异性。在这些 STAT蛋白当中，STAT3由于其与肿瘤的关系较为密切。编码STAT3的基因在人类定位于第 17号染色体(q21. 1 q21. 2)，其结构与其他的STAT蛋白相似，具有以下几个主要部分 (1)保守的氨基酸末端与STAT蛋白的四聚体化有关；(2)DNA连接区具有特异性针对活 性IFN- γ回文序列(GAS)元件的序列；(3) SH3结构域位于第500 600位氨基酸，能与 富含Pro的基序(motif)结合；(4)SH2区参与受体恢复和STAT的二聚体化；(5) C-末端 转录激活结构域在转录激活域内的色氨酸(S727)或接近C端的酪氨酸(Y705)被磷酸化 后，STAT3即被激活。STAT3在最开始被发现时，仅仅是被看作是STAT家族中一个简单的附 加成员，在炎症反应时IL-6的释放反应中，发挥作用是诱导一套有限的靶基因转录。但是 目前已知的研究结果表明，STAT3可以被许多细胞因子、生长因子和其它刺激所激活，比其 它STAT蛋白有着更为重要的生理功能。STAT3的激活与肿瘤，STAT3在细胞内起着重要的 信号传递作用，负责将细胞外的信号传递到细胞核，通过诱导靶基因转录表达生物刺激的 效应作用。细胞因子与细胞表面(或者胞浆内的)受体结合后，受体的gpl30亚基形成二 聚体，导致与gpl30相连的Jak酶发生磷酸化，进而使得STAT3分子C-末端的酪氨酸残基 (Y705)发生磷酸化在，通过其SH2区形成二聚体而激活，并转移到细胞核内与靶基因的启 动子结合，诱导靶基因的转录。S727的色氨酸残基发生磷酸化也可以导致STAT3的激活。 但对于色氨酸激酶是否存在同一性尚有一些争议，很有可能是因为不同的激活信号导致色 氨酸被ERKl、ERK2、p38、JNK和一种H-7敏感激酶中的任意一种磷酸化。绝大多数证据表 明磷酸化在STAT3激活转录过程中起着推动作用，然而也有证据表明色氨酸磷酸化具有负 面作用，但是其机制还没有明确。在发现STATs之后不久，就出现了最早的一批关于原发癌 灶和肿瘤来源细胞株当中存在的STAT蛋白持续性酪氨酸磷酸化(即持续性活化)的报道。随着在v-Src变形细胞内初步发现组成性磷酸化的STAT3以后，已经累积了相当多的证据 表明活性STAT3在细胞恶变过程中起关键性作用。许多肿瘤来源细胞株都需要STAT蛋白 (特别是STAT3)来保持转变后的表现型。成纤维细胞表达激活的STAT3后细胞发生变形， 暗示STAT3是一个癌基因。此外，大量的鼠和人类的恶性肿瘤细胞中都表现有活性STAT3， 包括许多头颈部癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤和其它血液系统恶性肿瘤。随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开， 至今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克 隆时)就能做到早期预测诊断。采用核酸原位杂交技术检测STAT3基因，对癌症的早期基 因水平的诊断有重要的临床意义。STAT3基因序列号NM-003150，mRNA，4953bp在染色体 17q21. 31"，CDS 219.........2528bp。原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起 来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含 有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链 即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细 胞原位显示特异的DNA或RNA分子。
发明内容本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种Stat3基因的原位杂交检测试 剂盒的用途。本发明的再一的目的是，提供一种Stat3基因的原位杂交检测试剂盒。本发明的另一的目的是，提供一种Stat3基因的原位杂交检测方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种Stat3基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症疾病药物中的应用，所述 的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示。 所述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。所述的放射性核素选自3H、35S、125I或32P中的一种。所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素 中的一种。所述的非放射性标记物优选自地高辛。所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是一种Stat3基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其中所述的杂交 探针序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是一种Stat3基因的原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；b、检测a步骤得到的杂交复合体。本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂 交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括仪器操作
1).将待测标本放入反应槽中；
2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；
3).仪器自动弃去液体，自动后固定；
4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42°C )；
5).仪器自动弃去液体，自动清洗；
6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42°C )；
7).仪器自动弃去液体，自动清洗；
8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；
9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；
10).取出封片镜检。
本发明优点在于
1、本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。
2、本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。
3、本发明的临床意义是更早期跟踪检测癌症发生动态过程，以及用于癌症预防医
学的检测和筛选工具。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影像 医学检查有显著不同。本发明可以在基因水平上检测Stat3异常表达，在影像医学检查及 其它检查未发现占位性癌症病灶之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿块之前， 能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床癌症病患一个真正的预后早期诊断。这 样才有可能实施癌症的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治癌症恶 疾。
图1是本发明实施例中癌症病人Stat3过量表达图。图2是本发明实施例中正常人Stat3图。
具体实施方式下面结合附图对本发明具体实施方式
作详细说明。实施例1一种Stat3基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、增效剂，其中，所 述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体和
标本组成如下
消化液100 μ 1/管1管/ ^ 无色透明液体
保护液100 μ 1/管1管/i^ 无色透明液体
预杂交液1300 μ 1/ ,r 2管/i^ 无色透明液体
正义杂交液10μ 1/管1管/i^ 无色透明液体
反义杂交液10μ 1/管1管/ ^ 无色透明液体
封闭液1000 u l／管l管／盒五色透明液体
碱性磷酸酶抗体 l u l／管l管／盒五色透明液体
显色剂A175 u l／管 l管／盒黄色液体
显色剂B320 u l／管 l管／盒五色透明液体
缓沖液工 10x 90ml／瓶l瓶／盒浅黄色或五色透明液体
缓沖液II 10x 80ml／瓶l瓶／盒浅黄色或五色透明液体
缓沖液II工10x 20m／瓶3瓶／盒浅黄色或五色透明液体
缓沖液IV 10x 90ml／瓶l瓶／盒浅黄色或五色透明液体
固定液90ml／瓶l瓶／盒五色透明液体
阳性对照标本6片／盒
上述试剂成分说明(所有试剂购自SIGMA)
l、消化液20mg／ml蛋白酶K，100mg蛋白酶K，加DEPC一几0 5ml；
2、保护液0．2g的glycine加入lml的l×缓沖液工；
3、预杂交液l×缓沖液II 7．5ml
50×D 3ml
10mg／ml yest七一RNA 750ul
l lmg／ml SALMON TESTES DNA 682ul
0．04M EDTA 3ml
50％formami de l 5ml
4、封闭液0．03g的bloMng(购买自罗氏公司)加入lml l×缓沖液II工；
5、10x缓沖液工(PIt7．卜7．4)
NaCl 80g
Na，[tPO。．121t，0 360g
KCl 2g
KIt，P。．2g
加三蒸水至11，并高压灭菌；
6、10x缓沖液II(PIt7．0)
NaCl 175．3g
柠檬酸钠88．2g
[tCl几滴
加三蒸水至11，并高压灭菌；
7、缓沖液II工(PIt7．9)
／riS 121．1g
NaCl 87．66g
[tCl 60ml左右
加三蒸水至11，并高压灭菌；
8、缓沖液IV
1M／riS一[tCl(PIt9．5)／its 121．1g加[tCl 3ml左右，加水900ml，调PH至9．5，加水至11，并高压灭菌；
IM NaCl =NaCl 58. 44 加水至 11，并高压灭菌；0. 5M MgCl2 101. 65g MgCl2. 6H20 加水至 11，并高压灭菌；9、固定液多聚甲醛40g加IX缓冲液I至11，稍加热(约50_60度)搅拌至溶 解；10、显色剂 A =NBT Ig 加 70% DMFl 1. 44ml ；11、显色剂 B =BCIP Ig 加 100% DMF30ml。本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。实施例2一种Stat3基因原位杂交检测方法及其试剂盒应用一、标本处理1、用IOml的离心管，装4. 5ml淋巴细胞分离液，再将3ml抗凝血缓慢加入含有淋 巴细胞分离液(血淋巴细胞分离液=1 1.5)的离心管中，2000r/min离心IOmin ；2、吸取中间层白细胞至另一离心管中，再在此管中加入约两倍的IX缓冲液I，混 勻，1500g/min 离心 IOmin ；3、弃上清.沉淀加入约两倍的1 X缓冲液I，混勻，1500g/min离心IOmin ；4、弃上清，并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴在玻片上 推片，自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3ml血，可以做4张片子；5、用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用IX缓冲液I洗5min。每缸 可以放16片；6、标本可保存在-20°c，或继续做实验。二、将试剂盒中试剂配制成使用浓度1、将IOX缓冲液I用三蒸水按1 10稀释成IX缓冲液I ；2、将20X缓冲液II用三蒸水按1 10稀释成2X缓冲液II ；按1 100稀释成0. 2X缓冲液II ；按1 200稀释成0. 1 X缓冲液II ；3、将IOX缓冲液III用三蒸水按1 10稀释成1 X缓冲液III ；4、10X缓冲液IV用三蒸水按1 10稀释成X缓冲液IV (取1#，2#，3#各10ml， 加水至IOOml既可)。三、实验步骤1、取每位待检者标本两张，(另外两张留作复查用)及阳性对照标本两张(每次 实验做一对阳性对照)；2、在玻璃缸里加消化液(消化液IOOul加IX缓冲液199.9ml，即为使用浓 度)20ml。37°C水浴预热10分钟。放进16张玻片，37°C处理12min，再用1 X缓冲液I洗 5min ；3、用0. 2%的保护液(保护液Iml加IX缓冲液I99ml即为使用浓度)洗IOmin, 三蒸水洗5min，以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥；4、将玻片放入保湿盒内，加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在 42°C恒温水浴箱中3h以上；5、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70%，90%，95%的乙醇各洗 2min,自然干燥；
6、将玻片放入保湿盒内，每位病人标本两张，一张加正义杂交液20ul/片，另一张 加反义杂交液20ul/片，盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42°C恒温水浴箱中16-24h ；7、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内在42°C恒温水浴箱中用2X缓冲液II洗两次，每次15min在42°C恒温水浴箱中用0. 2X缓冲液II洗一次，每次15min在42°C恒温水浴箱中用0. 1 X缓冲液II洗两次，每次15min ；8、用IX缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；9、将玻片放入保湿盒内，加0.5% 1封闭液(Iml封闭液加5ml IX缓冲液 III) IOOul/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min ；10、取出玻片，用IX缓冲液III洗30s，自然干燥；11、将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1.8ml 1 X缓冲液III) IOOul/ 片，盖紧保湿盒在室温下作用30min ；12、取出玻片，用IX缓冲液III洗3次，每次15min;13、IX缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73. 3ul，显色剂B157. 5ul加到30ml 1 X缓冲液IV中，混勻)，室温避光12h以上；14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX缓冲液I混勻)封片镜检。四、结果判断在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。阳性对照标本加反义杂交液的应该80%以上染上紫色。所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克 服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探 针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察 mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的 Stat3基因表达量，用来确定癌症是否发生。临床研究表明，Stat3基因是癌症的特异基因， 因为Stat3基因在正常人中不表达，唯独在癌表达，说明癌症已经发生，用来确定癌症是否 发生，或是正常。从而获得癌症的诊断信息。本发明实施例采样为癌症病人5名，正常对照组5名。抽所有待检人的外周血 3-5毫升(分离白细胞)做原位杂交。结果表示，所有癌症患者Stat3基因有过度表达，细 胞染色；正常对照组Stat3基因不表达，细胞无染色。具体结果请见图1和图2。实施例3用Stat3基因试剂盒检测癌症疾病与用CEA基因试剂盒检测癌症疾病之间平行实 验。为了科学评价上述基因各自在癌症疾病的特异性、敏感性、准确性。我们用平行试 验的方法，同时检测上述基因的mRNA，检测技术采用核酸原位杂交技术，用同一例癌症疾病 患者的外周血，同时检测Stat3基因和CEA(癌胚抗原)基因的mRNA(进行核酸原位杂交、 免疫组化染色、镜下记数、结果报告等均采用实施例1和实施例2的原位杂交技术的相同方 法和步骤及试剂)。发现Stat3基因在癌症疾病病人中表达量比CEA基因在同一疾病病人的表达量要高。结果表明，Stat3基因对癌症疾病诊断的特异性、敏感性、准确性比CEA基 因更好，原位杂交基因表达图显示，Stat3基因的表达量是70%，CEA基因的表达量是50%。 本发明的试剂盒作于癌症疾病诊断的指标有非常重要的临床意义。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。SEQUENCE LISTING<110>芮屈生物技术(上海)有限公司<120> 一种Stat3基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用<130>/<160>1<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>4953<212>DNA<213> 智人(Homo sapiens)<400>1ggtttccggagctgcggcggcgcagactgggagggggagccgggggttccgacgtcgcag60
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一种Stat3基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的杂交探针序列如SEQID NO. 1所 示的RNA序列。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的标记物选自放射性核素或非 放射性标记物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的放射性核素选自3H、35S、125I或32P 中的一种。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的非放射性标记物选自生物素、地高 辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的非放射性标记物优选自地高辛。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的试剂盒还包括增效剂，所述的 增效剂是碱性磷酸酶抗体。
8.一种Stat3基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其特征在于，所述 的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。
9.一种Stat3基因的原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤a、将权利要求8所述试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；b、检测a步骤得到的杂交复合体。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于a步骤中形成杂交复合体的条件为 核酸杂交的温度为42°C ；核酸杂交的时间为16-24小时，所述的底物选用血液细胞标本或 组织细胞标本。
全文摘要
本发明涉及一种Stat3(Signal Transducer and Activator ofTranscription 3，STAT3)基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种Stat3基因原位杂交检测方法。另外，本发明还提供了试剂盒在制备检测癌症疾病药物中的应用。本发明优点在于本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。
文档编号C12Q1/68GK101993945SQ20091005618
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月10日 优先权日2009年8月10日 公开号200910056182.发明者张云福, 裘建英 申请人:芮屈生物技术(上海)有限公司