专利名称：一种il-2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用的制作方法
一种IL-2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应
用
技术领域：
本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种IL-2基因的原位杂交检测试剂盒及 其检测方法和应用
背景技术：
癌症也叫恶性肿瘤，肿瘤是指机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞异常 增生而形成的局部肿块。癌症病变的基本单位是癌细胞。人体细胞老化死亡后会有新生 细胞取代它，以维持机体功能，人体绝大部分细胞都可以增生，但这种增生是有限度的，而 癌细胞的增生则是无止境的，这使患者体内的营养物质被大量消耗。同时，癌细胞还能释放 出多种毒素，使人体产生一系列症状，晚期时它转移到全身各处生长繁殖，最后导致人体消 瘦、无力、贫血、食欲不振、发热及脏器功能受损等，器官功能衰竭而死亡。根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数160万，死亡人数近 160万，患者600万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800万，患者约有8400万 人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。而且，绝大部分癌症患者都只有很 短的生存期，人类到目前为止还没战胜癌症这一恶疾，如何做到治愈癌症的关键是要做到 基因水平的早期诊断。IL-2是细胞因子，它在肿瘤的发生过程中起十分重要的作用，一旦机体IL-2的表 达降低，肿瘤就会朝恶性方向发展。IL-2通过以下几方面的功能作用来达到消灭和杀死癌 细胞1. IL-2是淋巴T细胞的生长因子，能延长T细胞的活性，刺激T细胞进入细胞分裂周 期，增强T细胞的杀伤活性；在体内能增强抗原诱导的细胞毒性T细胞(TC)的活性，可以辅 助抗原和半抗原直接在体内诱导产生(TC)。二者均能对癌细胞进行攻击和杀伤作用。2.可 促进NK细胞的增殖，维持NK细胞的长期生长。肿瘤病人经IL-2治疗后，血中NK细胞数量 明显增加。3. IL-2可促进LAK、TIL细胞的功能活性，同时能延长LAK、TIL细胞存活，也能 扩增和活化LAK、TIL细胞，LAK是淋巴细胞与IL-2接触后产生的一种具有高效抗肿瘤效 应的杀伤细胞，只有在IL-2存在下LAK才能产生，也只有在IL-2的存在下LAK才能发挥效 果。4.可促进B细胞的增殖和产生免疫球蛋白，并刺激巨噬细胞，提高巨噬细胞的吞噬能 力。5. IL-2能刺激NO(—氧化氮)的产生，消灭癌细胞。IL-2通过以上等途径来消灭癌细 胞，当癌症发生时机体的IL-2分泌会降低，同样机体IL-2的降低也会使癌细胞生长。人类 的各种癌症都有IL-2的表达降低，IL-2在血液中的浓度变化可用于癌症病人的早期的检 测和预测指标。癌症从癌前变到形成癌症，需要几年时间，如何做到早期检测和诊断及预后的检 测及诊治后的复发、转移早期检出，是降低发病率和死亡率的关键。采用核酸原位杂交技 术检测IL-2基因，对癌症的早期基因水平的诊断有重要的临床价值。IL-2基因序列号 NM_000586，822bp，mRNA，4q26-q27〃，cds 56—517bp0随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，至今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆 时)就能做到早期预测诊断。原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起 来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含 有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链 即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细 胞原位显示特异的DNA或RNA分子。
发明内容本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种IL-2基因的原位杂交检测试 剂盒的用途。本发明的再一的目的是，提供一种IL-2基因的原位杂交检测试剂盒。本发明的另一的目的是，提供一种IL-2基因的原位杂交检测方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种IL-2基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症疾病药物中的应用，所述 的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。所述的放射性核素选自3H、35S、125I或32P中的一种。所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素 中的一种。所述的非放射性标记物优选自地高辛。所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是一种IL-2基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其中所述的杂交 探针序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是一种IL-2基因的原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；b、检测a步骤得到的杂交复合体。本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试 剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂 交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括仪器操作
1).将待测标本放入反应槽中；
2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；
3).仪器自动弃去液体，自动后固定；
4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42°C )
5).仪器自动弃去液体，自动清洗；
6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42°C )；7).仪器自动弃去液体，自动清洗；8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；10).取出封片镜检。本发明优点在于1、本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。2、本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。3、本发明的临床意义是更早期跟踪检测癌症发生动态过程，以及用于癌症预防医 学的检测和筛选工具。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影像 医学检查有显著不同。本发明可以在基因水平上检测IL-2异常表达，在影像医学检查及其 它检查未发现占位性癌症病灶之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿块之前，能 及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床癌症病患一个真正的预后早期诊断。这样 才有可能实施癌症的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治癌症恶疾。
图1是是本发明实施例中癌症病人IL-2基因过量表达图片。图2是正常人IL-2基因表达图片。
具体实施方式下面结合附图对本发明具体实施方式
作详细说明。实施例1一种IL-2基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、增效剂，其中，所 述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体和
标本组成如下
消化液100 μ 1/管1管/盒无色透明液体
保护液100 μ 1/管1管/盒无色透明液体
预杂交液1300 μ 1/ 管2管/盒无色透明液体
正义杂交液10μ 1/管1管/盒无色透明液体
反义杂交液10μ 1/管1管/盒无色透明液体
封闭液1000 μ 1/ 管1管/盒无色透明液体
碱性磷酸酶抗体 μ /管1管/盒无色透明液体
显色剂A175 μ 1/ 管1管/盒黄色液体
显色剂B320 μ 1/ 管1管/盒无色透明液体
缓冲液I IOx90ml/ 瓶1瓶/盒浅黄色或无色透明液体
缓冲液II IOx80ml/ 瓶1瓶/盒浅黄色或无色透明液体
缓冲液III IOx20m/瓶3瓶/盒浅黄色或无色透明液体
缓冲液IV IOx90ml/ 瓶1瓶/盒浅黄色或无色透明液体
固定液90ml/ 瓶1瓶/盒无色透明液体
阳性对照标本 6片/盒上述试剂成分说明(所有试剂购自SIGMA)1、消化液:20mg/ml 蛋白酶 K，IOOmg 蛋白酶 K，加 DEPC-H2O 5ml ；2、保护液0· 2g的glycine加入Iml的1 X缓冲液I ；3、预杂交液:1 X缓冲液II 7. 5ml50 X D 3ml10mg/ml yest t-RNA 750ulllmg/ml SALMON TESTES DNA 682ul0. 04M EDTA 3ml50% formamide 15ml4、封闭液0.03g的bloking(购买自罗氏公司)加入Iml IX缓冲液III;5、IOx 缓冲液 I (PH7. 1-7. 4)NaCl 80gNa2HPO4. 12H20 360gKCl 2gKH2PO4 2g加三蒸水至11，并高压灭菌；6、IOx 缓冲液 II (PH7. 0)NaCl 175. 3g柠檬酸钠88. 2gHCl 几滴加三蒸水至11，并高压灭菌；7、缓冲液 III :(PH7. 9)Tris 121. IgNaCl 87. 66gHCl 60ml 左右加三蒸水至11，并高压灭菌；8、缓冲液 IV:IM Tris-HCl (PH9. 5) =Tirs 121. Ig 加 HCl 3ml 左右，加水 900ml，调 PH 至 9. 5，加 水至11，并高压灭菌；IM NaCl =NaCl 58. 44 加水至 11，并高压灭菌；0. 5M MgCl2 101. 65g MgCl2. 6H20 加水至 11，并高压灭菌；9、固定液多聚甲醛40g加IX缓冲液I至11，稍加热(约50_60度)搅拌至溶 解；10、显色剂 A =NBT Ig 加 70% DMFl 1. 44ml ；11、显色剂 B =BCIP Ig 加 100% DMF30ml。本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。实施例2一种IL-2基因原位杂交检测方法及其试剂盒应用
一、标本处理1、用IOml的离心管，装4. 5ml淋巴细胞分离液，再将3ml抗凝血缓慢加入含有淋 巴细胞分离液(血淋巴细胞分离液=1 1.5)的离心管中，2000r/min离心IOmin ；2、吸取中间层白细胞至另一离心管中，再在此管中加入约两倍的IX缓冲液I，混 勻，1500g/min 离心 IOmin ；3、弃上清·沉淀加入约两倍的1 X缓冲液I，混勻，1500g/min离心IOmin ；4、弃上清，并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴在玻片上 推片，自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3ml血，可以做4张片子；5、用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用IX缓冲液I洗5min。每缸 可以放16片；6、标本可保存在_20°C，或继续做实验。二、将试剂盒中试剂配制成使用浓度1、将IOX缓冲液I用三蒸水按1 10稀释成IX缓冲液I ；2、将20X缓冲液II用三蒸水按1 10稀释成2X缓冲液II ；按1 100稀释成0. 2X缓冲液II ；按1 200稀释成0. 1 X缓冲液II ；3、将IOX缓冲液III用三蒸水按1 10稀释成1 X缓冲液III ；4、10 X缓冲液IV用三蒸水按1 10稀释成X缓冲液IV (取1#，2#，3#各10ml， 加水至IOOml既可)。三、实验步骤1、取每位待检者标本两张，(另外两张留作复查用)及阳性对照标本两张(每次 实验做一对阳性对照)；2、在玻璃缸里加消化液(消化液IOOul加IX缓冲液199.9ml，即为使用浓 度)20ml。37°C水浴预热10分钟。放进16张玻片，37°C处理12min，再用1 X缓冲液I洗 5min ；3、用0. 2%的保护液(保护液Iml加IX缓冲液I99ml即为使用浓度)洗IOmin, 三蒸水洗5min，以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥；4、将玻片放入保湿盒内，加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在 42°C恒温水浴箱中3h以上；5、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70%，90%，95%的乙醇各洗 2min,自然干燥；6、将玻片放入保湿盒内，每位病人标本两张，一张加正义杂交液20ul/片，另一张 加反义杂交液20ul/片，盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42°C恒温水浴箱中16-24h ；7、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内在42°C恒温水浴箱中用2X缓冲液II洗两次，每次15min在42°C恒温水浴箱中用0. 2X缓冲液II洗一次，每次15min在42°C恒温水浴箱中用0. 1 X缓冲液II洗两次，每次15min ；8、用IX缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；9、将玻片放入保湿盒内，加0.5% 1封闭液(Iml封闭液加5mllX缓冲液 III) IOOul/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min ；
10、取出玻片，用IX缓冲液III洗30s，自然干燥；11、将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1. 8mllX缓冲液III) IOOul/ 片，盖紧保湿盒在室温下作用30min ；12、取出玻片，用IX缓冲液III洗3次，每次15min;13、1X缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73. 3ul，显色剂B157. 5ul加到 30ml IX缓冲液IV中，混勻)，室温避光12h以上；14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX缓冲液I混勻)封片镜检。四、结果判断在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。阳性对照标本加反义杂交液的应该80%以上染上紫色。所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克 服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探 针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察 mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的IL-2 基因表达量，用来确定癌症是否发生。临床研究表明，IL-2基因是癌症的特异基因，因为 IL-2基因在正常人中不表达，唯独在癌表达，说明癌症已经发生，用来确定癌症是否发生， 或是正常。从而获得癌症的诊断信息。本发明实施例采样为癌症病人5名，正常对照组5名。抽所有待检人的外周血 3-5毫升(分离白细胞)做原位杂交。结果表示，所有癌症患者IL-2基因有过度表达，细胞 染色；正常对照组IL-2基因不表达，细胞无染色。具体结果请见图1和图2。实施例3用IL-2基因试剂盒检测癌症疾病与用CD147基因试剂盒检测癌症疾病之间平行 实验。为了科学评价上述基因各自在癌症疾病的特异性、敏感性、准确性。我们用平行试 验的方法，同时检测上述基因的mRNA，检测技术采用核酸原位杂交技术，用同一例癌症疾病 患者的外周血，同时检测IL-2基因和CD147(CD147基因-CD147序列号:AB085790,972bp, cds :40…849bp)基因的mRNA(进行核酸原位杂交、免疫组化染色、镜下记数、结果报告等均 采用实施例1和实施例2的原位杂交技术的相同方法和步骤及试剂)。发现IL-2基因在 癌症疾病病人中表达量比⑶147基因在同一疾病病人的表达量要高。结果表明，IL-2基因 对癌症疾病诊断的特异性、敏感性、准确性比CD147基因更好，原位杂交基因表达图显示， IL-2基因的表达量是70%，⑶147基因的表达量是40%。本发明的试剂盒作于癌症疾病诊 断的指标有非常重要的临床意义。SEQUENCE LISTING<110>芮屈生物技术(上海)有限公司<120> 一种IL-2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用<130>/<160>1
<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>822<212>DNA<213> 智人(Homo sapiens)<400>1
0149]agttccctatcactctctttaatcactactcacagtaacctcaactcctgccacaatgta600150]caggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacaaacagtgcacc1200151]tacttcaagttctacaaagaaaacacagctacaactggagcatttactgctggatttaca1800152]gatgattttgaatggaattaataattacaagaatcccaaactcaccaggatgctcacatt2400153]taagttttacatgcccaagaaggccacagaactgaaacatcttcagtgtctagaagaaga3000154]actcaaacctctggaggaagtgctaaatttagctcaaagcQ-Q-Q-Q-Q-C Cacttaagacc3600155]cagggacttaatcagcaatatcaacgtaatagttctggaactaaagggatctgaaacaac4200156]attcatgtgtgaatatgctgatgagacagcaaccattgtagaatttctgaacagatggat4800157]taccttttgtcaaagcatcatctcaacactgacttgataattaagtgcttcccacttaaa5400158]acatatcaggccttctattt3. 3.3.3. 3. ttaaattttatatttattgttgaatgtatg6000159]gtttgctacctattgtaactattattcttaatcttaaaactataaatatggatcttttat6600160]gattctttttgtaagccctaggggctctaaaatggtttcacttatttatcccaaaatatt7200161]tattattatgttgaatgttaaatatagtatctatgtagattggttagtaa7800162]taaatttgat3.3.3. 3. 3.3.3.3.aa82权利要求
一种IL 2基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的杂交探针序列如SEQID NO. 1所 示的RNA序列。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的标记物选自放射性核素或非 放射性标记物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的放射性核素选自3H、35S、125I或32P 中的一种。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的非放射性标记物选自生物素、地高 辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的非放射性标记物优选自地高辛。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的试剂盒还包括增效剂，所述的 增效剂是碱性磷酸酶抗体。
8.—种IL-2基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其特征在于，所述的 杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。
9.一种IL-2基因的原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤a、将权利要求8所述试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；b、检测a步骤得到的杂交复合体。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于a步骤中形成杂交复合体的条件为 核酸杂交的温度为42°C ；核酸杂交的时间为16-24小时，所述的底物选用血液细胞标本或 组织细胞标本。
全文摘要
本发明涉及一种IL-2(细胞因子2)基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种IL-2基因原位杂交检测方法。另外，本发明还提供了试剂盒在制备检测癌症疾病药物中的应用。本发明优点在于本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。
文档编号C12Q1/68GK101993946SQ20091005618
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月10日 优先权日2009年8月10日 公开号200910056183.8
发明者张云福, 裘建英 申请人:芮屈生物技术(上海)有限公司