一种结核分枝杆菌基因表达文库的构建方法及应用的制作方法

专利名称：：一种结核分枝杆菌基因表达文库的构建方法及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物工程
技术领域：
。具体涉及一种结核分枝杆菌基因表达文库的构建方法及应用。
背景技术：
：RobertKoch首次成功分离培养了结核分枝杆菌，从而为战胜世界上一个主要的瘟疫带来了巨大的希望。然而125年过去了，结核分枝杆菌仍然是一个分布广泛的病原菌，感染了近三分之一的人类并且每年杀死约两百万人(RaviglioneMC.TheTB印idemicfrom1992to2002.7iiZ;e2rw7o57's(^/j'"Z人2003,83:4-14.)。结核分枝杆菌具有一些难以治愈的特征。它能够适应种种不利的生存环境并且能够阻止正常巨噬细胞的成熟。结核分枝杆菌还能够进入休眠状态，使得感染并不表现出症状，在体内一直潜伏数十年。当宿主的免疫系统由于营养不良，患病或者年老的而变得衰弱，潜伏的结核杆菌就有可能复活(SmithI.餘co》a"eri咖to力ercw7osispathogenesisandmoleculardeterminantsofvirulence.yer，2003，16:463-496.)。作为一个古老的致病菌，针对它的预防措施和诊断方法却是儿十年没有更新。大量数据表明卡介苗(BCG)接种对儿童的保护效果较明显，但对成人的免疫效果极不稳定(BroschRetal.GenomeplasticityofBCGandimpactonvaccineefficacy.尸潔爿ca"cj'〃"，2007，104:5596-5601.)。艮P使对于儿童，BCG的免疫保护效果在不同地区不同种族中也存在显著差异(080%)。BCG的局限性推动了抗结核病新疫苗的开发。找到更好的保护性抗原，发展安全、高效的新型结核病疫苗势在必行。在诊断方面，目前存在敏感性较低，特异性较差，操作复杂，检测周期长等问题，因此找到更多的特异性抗原，开发研制快速特异诊断结核病的方法，成为控制结核病蔓延的首要任务。由于临床耐药菌株的出现，研究细菌耐药机制，并针对耐药菌寻找新药靶，开发新型抗结核药物也已迫在眉睫。同时抗原一般都是细胞壁的重要组成部分或者是分泌蛋白，有些还承担着重要的细胞代谢过程。因此抗原也是非常合适的候选药物靶标。本发明通过外源表达结核分枝杆菌的蛋白质，利用血清学技术鉴定出新的保护性抗原，在建立新的免疫预防方法、诊断检测方法以及新药的开发等领域都具有重要的应用价值。Bisen等利用鸟枪法打断结核分枝杆菌基因组DNA进行外源表达，利用ELISA和westernblot检测表达蛋白质的免疫原性，获得了一些能与结核病人血清特异反应的抗原(BisenPSetal.AnalysisoftheshotgunexpressionlibraryoftheMycobacteriumtuberculosisgenomeforimmunodominantpolypeptides:potentialuseinserodiagnosis.Ci/"ZVag"Ls力/腳"/30厶2003,10:1051-1058.)。其缺陷是将结核分枝杆菌基因组随机打断，这样并不能够准确得到其每个基因的表达产物，因此这种方法做鉴定到的抗原是不全面的。Malen等将双向电泳与血清学技术联合应用，最终利用串联质谱在结核分枝杆菌的培养物滤液中鉴定到4个能与结核病病人血清发生强烈反应的蛋白质(MalenH，SoftelandT，WikerHG.AntigenanalysisofMycobacteriumtuberculosisH37Rvculturefiltrateproteins.5<朋《////^ww厶2008,67:245^52.)。其缺陷在T结核分枝杆菌的有些抗原物质只有在感染宿主细胞时才特意表达或者分泌，所以只检测其在体外培养时的滤液不能够准确反映其在宿主细胞内的真实情况，有必要准确克隆表达其全基因组所有编码基因，对其表达产物的抗原性进行研究。Kashino等利用高效液相色谱和质谱的方法在结核病病人的尿液中检测到4个特异分泌的蛋白能够特异的与病人血清发生反应(KashinoSSetal-IdentificationandcharacterizationofMycobacteriumtuberculosisantigensinurineofpatientswithactivepulmonarytuberculosis:aninnovativeandalternativeapproachofantigendiscoveryofusefulmicrobialmolecules,"i"//hm//2</，2008.)。其缺陷是只能检测少量在尿液中才能存在的抗原，并不能反映结核分枝杆菌在人体内存在时所分泌的所有抗原。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，构建一种结核分枝杆菌基因表达文库及其应用。本发明通过PCR(聚合酶链式反应)获得结核分枝杆菌基因组所有编码基因，利用传统分子克隆方法精确克隆结核分枝杆菌的基因片段混合物至大肠杆菌表达载体，得到了结核分枝杆菌的基因表达文库。通过对该文库的基因进行外源表达和变性纯化，得到了高覆盖率的结核分枝杆菌的基因表达产物，最终综合利用血清学方法与分子生物学实验方法鉴定出新的保护性抗原，以便为结核病的检测和防治提供新的侯选抗原或为结核病的治疗提供新的药物靶标。本发明是这样实现的为了实现本发明，申请人制备获得了两个适用于构建结核分枝杆菌基因表达文库的表达载体，利用PCR反应获得结核分枝杆菌的全部编码基因，进而通过将结核分枝杆菌的全部编码基因精确克隆到构建的表达载体中，通过转化大肠杆齒表达菌株BL21(DE3),最后得到结核分枝杆菌基因表达文库，对该文库进行了初步应用，证明该文库可以有效地筛选到新型保护性抗原，从而完成了本发明。具体地本发明的技术方案如下一、构建结核分枝杆菌基因表达文库的组氨酸标签融合表达载体pETEXba步骤如下(1)将商购的载体pET28a上的T&I酶切位点消除，获得一个中间载体pET28a-AX;(2)将步骤(l)获得的中间载体pET28a-AX用限制性内切酶yWel和i7;oI进行消化；(3)利用极端嗜热古菌Sso7/atei^c"s的c^《2基因作为第一个媒介基因，通过PCR的方法从极端嗜热古菌5!卵7/aten'^w基因组中扩增获得末端含有A&I和i2wl酶切位点的Wc&媒介基因；(4)将步骤(3)获得的媒介基因^fc必用限制性内切酶/V&I和J力ol进行消化；(5)将步骤(2)的载体和步骤(4)的媒介基因在16'C连接过夜，得到第二个中间载体pET28a-62;(6)将步骤(5)获得的第二个中间载体pET28a-62用限制性内切酶和Aol进行消化；(7)利用极端嗜热古菌SsW/ateric^的微型染色体维持基因MCM作为第二个媒介基因，通过PCR方法获得末端含有^coRI和酶切位点的MCM媒介基因；(8)将步骤(7)获得的MCM媒介基因用限制性内切酶化oRI和勒ol进行消化；(9)将步骤(6)的载体和步骤(8)的媒介基因在16。C连接过夜，得到表达载体pETEXba,其大小为6526bp，该载体pETEXba的核苷酸序列如序列表SEQIDNO;1所示。它还包括一个适用于克隆结核分枝杆菌所用编码基因的多克隆位点。在上述制备步骤中，步骤(3)中cofc^基因的扩增所用的弓l物对的序列如下正向引物14bEcoR-f:GCGCGGCATATGAGAATTCATGAGTGATATAATTGATGAG,反向引物14bEcoR-r:ATATGACTCGAGTACTCCAGAGATCAGCAAACCT;步骤(7)中MCM基因扩增所用的引物对的序列如下正向引物TrgXcm-f:GAGCGAATTCGTTGGAMTTCCTAGTMAC,反向引物Xcm-r:GGATGGCTCGAGTCTAGACTAGACTTTTTTGTMCAT。二、构建结核分枝杆菌基因表达文库的谷胱甘肽还原酶标签融合表达载体PGEXMCM步骤如下(1)利用极端嗜热古菌S幼J/ataric"s的微型染色体维持基因MCM,作为改造载体的原始媒介基因，通过PCR的方法从极端嗜热古菌Sw7/aten'c"s基因组中扩增获得MCM媒介基因'将该媒介基因用充分酶切形成缺失844个碱基的片段，获得末端含有&》RI和酶切位点的MCM媒介基因；(2)将商购的pTRG载体用限制性内切酶和iMI进行消化；(3)将步骤(l)获得的媒介基因和步骤(2)的载体在16。C连接过夜，得到中间载体pTRGMCM;(4)将商购的pGEX-4T-l载体用限制性内切酶fe/ffl和I力o[进行消化；(5)将通过步骤(3)获得的中间载体pTRGMCM用限制性内切酶fe/dH和ZAoI进行消化；(6)将步骤(4)的载体和步骤(5)的1.2kb片段在16'C连接过夜，得到表达载体pGEXMCM，其大小为6190bp,该载体pGEXMCM的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:2所示。它还包括一个适用于克隆结核分枝杆菌所用编码基因的多克隆位点。在上述制备步骤中步骤(1)中MCM基因扩增所用的引物对的序列如下正向引物Trgada-f:GAGCGMTTCGTTGGAAATTCCTAGTAMC,反向引物Ad即tor-r:GGATGGCTCGAGTCTAGACTAGACTTTTTTGTMCAT。三、结核分枝杆菌表达文库的构建(1)根据GenBank提供的结核分枝杆菌H37Rv基因组核酸序列(登录号NC000962),设计出了结核分枝杆菌基因组所有编码基因的引物(见实施例l)，。通过PCR获得结核分枝杆菌的所有编码基因。设计引物时，根据基因内部的酶切位点种类将结核分枝杆菌所有基因分为六类，前五类基因在上下游引物中分别引入fcoRI和J&I、AcoRI和Z力oI、AfetI和Z力aI、和J力ol、fezzffl和7力oI的酶切位点组合，并校正读码框，最后一类采用连接头的方法在上游引入^:oRI酶切位点，在下游引入酶切位点。部分编码基因的PCK结果见图1。(2)将PCR得到的产物分别按照大小、酶切位点或功能进行分类混合，经酶切消化后，与用相同方法酶切的表达载体连接，转化大肠杆菌DH5a，制备质粒，即得到结核分枝杆菌的基因表达文库混合质粒。获得的混合质粒的电泳结果见图6。四、结核分枝杆菌蛋白质在大肠杆菌中的外源表达以及蛋白质的纯化将得到的表达文库的混合质粒转化BL21(DE3)菌株，'从转化的平板上挑取单菌落分别进行诱导表达。按照《具体实施方式》中描述的方法进行变性条件下的蛋白质纯化。部分蛋白质的表达及纯化结果分别见图7及图8。五、抗原的初步大规模筛选按照《具体实施方式》中描述的方法对纯化的蛋白质进行大规模的抗原筛选。抗原的筛选结果见表2。本发明的优点是，操作成本低、高通量、覆盖率高，并能够全面鉴定到结核分枝杆菌基因组内的所有抗原。本发明更详细的技术方案参见《具体实施方式》。序列表SEQIDNO:l是本发明中表达载体pETEXba的核苷酸序列。序列表SEQIDNO:2是本发明中表达载体pGEXMCM的核苷酸序列。图l:本发明技术路线图；'图2:是本发明实施例1列举的部分结核分枝杆菌基因的PCR扩增结果的电泳图谱。从左到右依次是yiV7鄉c、yWJi7c、WW息/r/JJ。、射孤、AW息7"鹏、射J邻、yWJJ7、iWW《、iPW3激、^iV/3^、AV7J4/、《r/W么yK345'7v"必、AV7J47、iK"必、h"必、jPW35。。它们的大小依次是2.16kb、2.04kb、2.52kb、1.32kb、0.24kb、0.60kb、0.96kb、0.36kb、0.24kb、0.90kb、0.66kb、0.78kb、0.78kb、0.72kb、0,54kb、0.30kb、0.30kb、0.24kb、1.50kb、1.08kb、0.60kb、2.52kb、1.68kb、0.72kb;达载体pETEXba的构建过程示意图；图4:本发明构建的表达载体pETEXba的载体图谱；图5:是本发明构建的表达载体pGEMCM的构建过程示意图；图6:是本发明构建的表达载体pGEXMCM的载体图谱；图7:结核分枝杆齒基因PCR产物混合库克隆至pETEXba表达载体的电泳结果图。从左到右样品依次是DNAMarker、pETEXba-A、pETEXba-B、pETEXba-C、pETEXba-D、pETEXba-E、pETEXba-F、pETEXba-G。AG是指结核分枝杆菌编码基因的PCR产物按照大小分成7组混合后的编号；图8:举例说明结核分枝杆菌基因表达文库部分蛋白质的表达产物SDS-PAGE电泳图。从左到右样品编号依次是D284、D286、D288、D2恥、D291、D292、D293、D333、D363、D385;图9:举例说明结核分枝杆菌基因表达文库部分蛋白质的纯化产物SDS-PAGE电泳图。从左到右样品编号依次是D291、D293、D367、D334、D336、D363、D37Q、D379、D380、D390。具体实施例方式实施例l:结核分枝杆菌基因的PCR扩增以结核分枝杆菌H37Rv总基因组(登录号NC000962)DNA为模板，用根据GenBank提供的结核分枝杆菌H37Rv基因组核酸序列设计的引物扩增结核分枝杆菌的基因组编码基因。结核分枝杆菌编码基因的引物设计方法根据编码基因内部的酶切位点，选择基因内部没有的酶切位点组合(&oRI和Z&I、&<^1和/1%01、他rt和JSal、船fl和乃ol、及Mfll和i7o1),从编码基因的前后各取20bp设计引物，并通过末端保护碱基的改变调整上下游引物的GC含量达到一致，具体引物举例如下(以24对引物对为例)R1325cf:ATATGCGGCCGCAATGTCGTTTGTAATCGCCG，R1325cr:GCGCATCTAGAATCTACGACMCCCGGGTGAT;R1326cf:TAGAGCGGCCGCTATGAGTCGATCCGAGAMCT，R1326cr:TATATCTCGAGTACTAGGCGGGCGTCAGCCACA;R1327cf:AGTCGGATCCGTGAGTGGCCGGGCAATCGG，R1327cr:AGTCCTCGAGTCACCTCCTGCGCAGCAGCG;R1328f:AGTCGMTTCTAGTGAAAGCCCTTCGCCGGTT，R1328r:TATATATCTAGATCAGGCCAGGGTGACCAGGC;R1330cf:TATAGGATCCGTGGGGCCACCCCCAGCCGC，R1330cr:CGTCCTCGAGTCAGGCCGGGATCGTGCGTG;R1331f:AGTCGAATTCTAATGGCTGTTGTGTCAGCGCC，K1331r:TCTATATCTAGATCACCGGTCCTGCTGCATCG;R1332f:ATATGAATTCATATGCCGCCGGTTTGTGGGCG，R1332r:GCGTATTCTAGATCATCGAGACCCCATCAGCA;R1333f:CGTCGAATTCTAATGAACTCCATCACCGACGT，R1333r:TATATATCTAGATCAGGACCCGAATGCTCCGG;.R1334f:AGTCGAATTCTAGTGTTGCTTAGGAMGGMC，R1334r:TCTATATCTAGATCAGTACTGCTCGACGACAT;R1335f:GCGCGAATTCGCATGMCGTCACCGTATCCAT，R1335r:TATATATCTAGATCACCCACCGGCCACGGCGG;R1336f:AGTCGAATTCTAATGACACGATACGACTCGCT，7R1336r:TAGCTATCTAGATCATGCCCATAGTTGCCCTT;R1337f:TATAGAATTCTAATGGGCATGACCCCGCGCCG,R1337r:GCTAGCTCTAGATCATAACTTCGGATGCCCGG;R1338f:TATAGCGGCCGCTATGAATTCGCCGTTGGCGCC,R1338r:GCGCGTCTAGAGCCTAATGMTGCGCGATGGGT,R1339f:AGTCGAATTCGCATGCGTCGATGTATTCCGCA,R1339r:TATATATCTAGACTAGCCGGCTCGCCGGACTT:R1340f:TATAGCGGCCGCTGTGTCCMGCGAGAAGACGG,R1340r:GCTGCTCTAGAGCTCAGGTGCC嵐CGCCTTCG;R1341f:AGTCGMTTCTAGTGGCGCTTGTGACCAAGCT,R1341r:TCTATATCTAGATTAGCCTGTCGCCAGGGAGC;R1342cf:AGTCGAATTCTAATGACCGCACCCGAAACGCC，R1342cr:TAGCTATCTAGACTAAAGCCCGMGCGGGCCT;R1343cf:TATAGMTTCTAGTGTCCACTACCCGCCGTCG,R1343cr:TGCTGATCTAGATCATGCGGTGGTCCTGTTCT;R1344f:ATATGAATTCAGATGTGGCGATATCCACTMG,R1344r:ATATATTCTAGATCACTCATCGCGGTATTTGG;R1345f:ATATGAATTCATATGAGTGAGCTCGCGGCCGT,R1345r:ATATATTCTAGATCAGTCCGCCATCTCCAGGG;R1346f:ATATGMTTCATATGACGGCCGGCTCCGACCT,R1346r:AGCGATTCTAGACTACGCTTTGGAAGCTCCGA:R1347cf:AGTCGMTTCTAATGACCMACCCACATCCGC,R1347cr:TATATATCTAGATTACGCAGCCGTGGTCGGAG;R1348f:AGTCGMTTCTAATGGCACGCGGGTTGCAGGG,K1348r:TAGCTATCTAGATCATCGGGTGCCGTCCTGCG;R1349f:AGTCGAATTCTAATGATCCGCACCTGGATAGC，R1349r:TCTATATCTAGATTACTCGGCGAGGATCTGCC;R1350f:GAATGMTTCTTATGGCGTCATTGCTGAACGC，R1350r:ATATATTCTAGATCATATGAACCGGCCGCCAG。对应基因的PCR结果参见图2。PCR反应体系和反应条件如表1和表2:表lPCR反应体系反应组分体积(Hi)H37Rv基因组DNA2引物22XGCBuffer252.5mM譜Ps8d孤O13'Taq酶0.3总体积508表2PCR反应条件反应步骤时间循环次数96。C5min1邻。Clmin6crclmin3072。C3min72°C8min1实施例2:表达载体pETEXba的改造(1)通过末端补齐修饰的方法(具体方法参见Takara公司T4DMPolymerase使用方法)将商购的pET28a(购自Novagen公司)载体上的ZfeI酶切位点消除，获得一个中间载体，命名为pET28a-AX;(2)将步骤(1)获得的中间载体pET28a-AX用限制性内切酶Atfel和.ftoI进行消化；(3)利用极端嗜热古菌Ssolfafar/c"s的cc/c必基因(GenebankID:1455035)作为改造载体的第一个媒介基因。通过PCR的方法极端嗜热古菌Xso2/^an'CT^基因组中扩增(正向引物14bEcoR-f:GCGCGGCATATGAGAATTCATGAGTGATATAATTGATGAG，反向引物14bEcoR-r:ATATGACTCGAGTACTCCAGAGATCAGCAMCCT,下划线为酶切位点)从获得末端含有Atfel和Wol酶切位点的cA股基因片段；(4)将步骤(3)获得的媒介基因片段cofc&用限制性内切酶M/el和进行消化；(5)将通过步骤(2)和步骤(4)获得的载体和媒介基因在16'C进行连接过夜，得到中间载体，命名为pET28a-62;(6)将步骤(5)获得的中间载体pET28a-62用限制性内切酶fcoRI和Z力ot进行消化；(7)利用极端嗜热古菌5!so7/ater/c"s的微型染色体维持基因(mini-chromosomemaintenance-likegene,MCM，GenebankID:1455038)作为改造载体的第二个媒介基因。通过PCR的方法(正向引物TrgXcm-f:GAGCGMTTCGTTGGMATTCCTAGTAMC，反向引物Xcm-r:GGATGGCTCGAGTCTAGACTAGACTTTTTTGTMCAT，下划线为酶切位点)以在实施例3步骤(1)中获得的MCM媒介基因为模板扩增获得末端含有fcoRI和酶切位点的MCM媒介基因；(8)将步骤(7)获得的MCM媒介基因用限制性内切酶&oRI和通o[进行消化；(9)将通过步骤(8)和步骤(6)获得的媒介基因和载体在16'C进行连接过夜，得到改造成功的表达载体，命名为pETEXba(载体图谱见图3)，其大小为6526bp。实施例3:pGEX-4T-l表达载体的改造(1)利用极端嗜热古菌Sso/atar化os的微型染色体维持基因(mini-chromosomemaintenance-likegene,MCM，GenebankID:1455038)作为改造载体的原始媒介基因。通过PCR(正向引物Trgada-f:GAGCGAATTCGTTGGAAATTCCTAGTAMC，反向弓l物Adaptor-r:GGATGGCTCGAGTCTAGACTAGACTTTTTTGTMCAT,下划线为酶切位点)的方法从极端嗜热古菌sW/aterio/5基因组中扩增获得2.0kb的MCM基因。由于在MCM内部存在两个限制性内切酶识别位点，将该片段经充分酶切形成缺失844个碱基的片段。随后将该片段经末端补齐修饰方法(具体方法参见Takara公司T4DNAPolymerase使用方法)处理形成末端含有￡coRI和Z/wI酶切位点，大小为1.2kb的MCM媒介基因；(2)将商购的pTRG载体(购自Stratagene公司)用限制性内切酶&oRI和v仿ol进行消化；(3)将通过步骤(1)获得的片段与步骤'(2)获得的载体在16'C进行连接过夜'得到中间载体，命名为pTRGMCM;9(4)将商购的pGEX-4T-l载体(购自上海捷瑞生物工程有限公司)用限制性内切酶Aa/zfll和J力ol进行消化；(5)将通过步骤(3)获得的中间载体用限制性内切酶feMII和J力ol进行消化；(6)将通过步骤(4)和步骤(5)获得的载体和片段在16'C进行连接过夜，得到改造成功的表达载体，命名为pGEXMCM(载体图谱见图5)，其大小为6190bp。实施例4:将结核分枝杆菌'编码基因的PCR产物克隆至改造的表达载体(1)结核分枝杆菌编码基因PCR产物的混合根据结核分枝杆菌编码基因的大小以及酶切位点的组合方式进行分类，获得AG7组(每组又包含按照不同酶切位点进行组合的小组)基因大小不同的PCR混合物；(2)将通过步骤(1)获得的PCR混合物分别经对应限制性内切酶消化；(3)将通过实施例2和实施例3获得的表达载体分别用于PCR混合物对应的限制性内切酶酶切消化；(4)将通过步骤(2)获得的PCR混合物酶切产物和步骤(3)获得的载体在16。C进行连接过夜；连接反应的体系见表3:表3连接反应的体系反应组分体积(nl)载体2PCR混合物2连接酶缓冲液0.5连接酶0.5(5)将通过步骤(4)获得的连接产物转化大肠杆菌菌株DH5a(购自上海超研生物科技有限公司)；(6)分别将得到的转化子接种至LB培养基培养，制备质粒，即得到结核分枝杆菌的基因表达文库混合质粒。混合质粒的电泳图谱详见图4。实施例5:蛋白质的小量诱导表达本实施例中使用的通用LB培养基和附加的抗生素卡那霉素(见具体步骤所示)配方参见J.萨姆布鲁克，ER弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002年。(1)将通过实施例3获得的表达文库的混合质粒分别转化BL2纟(DE3)菌株(购自上海超研生物科技有限公司〉，使其转化子数目达到所含基因数目的3倍左右；(2)从步骤(1)转化得到的平板上挑取单菌落接入lml含有卡那霉素(30ng/ml)的LB培养基中。于37'C摇床培养过夜；'(3)向步骤(2)获得的过夜培养物中加入lml含有卡那霉素(30ug/ml)以及IPTG(异丙基-e-D-硫代半乳糖苷，终浓度1.OmM)的LB培养基。于37'C摇床继续培养12个小时；(4)将通过步骤(3)获得的培养物转移至1.5ml离心管中，12000转每分钟离心1分钟收集菌体'倒去上清，将菌体于一20。C保存。剩余培养物作为菌种保存于一20'C;(5)部分结核分枝杆菌编码基因的诱导表达结果详见图5。实施例6:蛋白质的变性纯化本实施例中使用的缓冲液B、C和E配方参见下表l_表4实施例5中使用的缓冲液B、C和E的组分及其配比_缓冲液_^_磷酸二氢钠.Tris-Cl_PHBufferB柳.0.1M0.01M__§^_BufferC8M0.1M0.01M6.3BufferE__2J^J_0,01M_￡^_(1)向在实施例4中收集的菌体中加入lmlBufferB,于37'C摇床孵育过夜，使菌体裂解；(2)将步骤(1)裂解后的菌体于4'C，16000转/分钟离心1小时，将上清取出到1.5ml离心管；(3)取20u1镍亲和层析胶珠(购自GE公司)到一个1.5ml离心管，加入lml磷酸缓冲液(PBS，配方参见上述《分子克隆技术实验指南》，2002年，科学出版社，pH7.4),轻柔混匀，2000转/分钟离心10秒，小心吸出上清，重复二次；(4)向步骤(3)的胶珠里加入O.5ml50mMNiSO"轻柔混匀，2000转/分钟离心10秒，小心吸出上清；(5)向步骤(4)的胶珠里加入lmlPBS，轻柔混匀，2000转/分钟离心10秒，小心吸出上清，重复三次；(6)向步骤(5)的胶珠里加入lralBufferB，轻柔混匀，2000转/分钟离心10秒，小心吸出上清；(7)将步骤(2)获得的上清与步骤(6)获得的胶珠在一个1.5ml离心管中室温混匀1小时，2000转/分钟离心10秒，小心吸出上清；(8)向步骤(7)的胶珠里加入lmlBufferC，轻柔混匀，2000转/分钟离心10秒，小心吸出上清；(9)向步骤(8)的胶珠里加入50ulBufferE,轻柔混匀，2000转/分钟离心10秒，小心吸出上清；(10)通过步骤9获得的上清中即包含结核分枝杆菌编码基因的表达产物，经SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测纯化的结果。部分结核分枝杆菌编码基因表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果见图6。实施例7:间接ELISA检测结核分枝杆菌编码基因表达产物的免疫原性本实施例中使用的缓冲液配方如下包被液0.05M、p朋.6的碳酸盐缓冲液(Na2C03:1.59g;NaHC03:2.93g;用蒸馏水定容到1L);洗涤液含0.05%吐温-20的PBS溶液(PBS配方参见《分子克隆技术操作指南》)；封闭液含5%脱脂牛奶的洗涤液；终止液2MH2S04;具体实施步骤(l)包被用包被液将通过实施例5纯化得到的蛋白质溶液稀释50倍，用微量移液器吸取稀释好的样品加入ELISA板内'，每孔100ul，4'C过夜;根据己有文献报道(RosenkrandsIetal.IdentificationofjPK您i^froinRD4asanovelserodiagnostictargetfortuberculosis.7i;6e_ra//as/s，2008,88,335-343)包被结核分枝杆菌编码基因iV^2W的表达产物作为间接法ELISA的正对照。包被样品顺序如表5所示'表5包被样品顺序设计<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(2)洗涤次日从4。C取出步骤(1)的ELISA板，甩干内容物，向孔内加入洗涤液'每孔200ul，静置3分钟，甩干，再加洗涤液，如此泡洗三次，最后一次甩干后'将ELISA板朝下放在滤纸上反复拍打干净；(3)封闭向步骤(2)的ELISA板中加入封闭液，每孔200yl，37。C温育30min。(4)洗涤同步骤(2)的方法；(5)加入一抗反应向步骤(4)的ELISA板中加入结核病人血清(湖北省武汉市结核病防治所惠赠)稀释液，每孔100ul，37。C温育30rain;(6)洗涤同步骤(2)的方法；(7)加入二抗反应向步骤(6)的ELISA板中加入二抗(购自武汉意德生物技术有限公司)稀释液，每孑LlOOul，37。C温育30min;(8)洗涤同步骤(2)的方法；(9)显色向步骤(8)的ELISA板中加入TMB底物显色(购自武汉意德生物技术有限公司)，每孔100ul，避光30min;.(10)终止反应向步骤(9)的ELISA板中加入终止液终止显色反应；(11)结果读取利用酶标仪读取0045。的值。ELISA结果(0D45。)如表6所示表6ELISA检测结果(OD柳)123456789101112A0.700.820.630.670.680.390.570.610.660.380.540.62B0.550.830.490.900.850.610.520.530.650.310.690.32C0.730.420.410.460.300.330.360.360.370.320.120.94根据上表的结果，挑选出OD咖〉0.65的蛋白质的对应菌体进行测序(由INVITROGEN公司完成)，根据测序结果对结核分枝杆菌基因组序列进行BLAST分析，发现这些基因分别属于表7所述的基因表7ELISA检测结果0D45。>0.65的样品号及其对应的基因号样品号基因号样品号基因号样品号基肉号样品号基因号样品号基因号El新抗原E2E4新抗原E5附娜E9新抗原E14新抗原E16歸IE17M鄉E23新抗原E25M微在这些基因中/Wi"i^(RosenkrandsIetal.Identificationof/PkA2^2fromRD4asanovelserodiagnostictargetfortuberculosis.7i;力ercw7o57.s,2008,88，335-343)、j^k。做(MalenH,SoftelandT，WikerHG.Antigenanalysisof妙co》acferj'咖f"Z)arcu7os7's1H37Rvculturefiltrateproteins.6"ca/^/i"孤肌/707,2008，67:245—252.)、yWA4(MalenH，SoftelandT，WikerHG.Antigenanalysisof妙c0Z7a"eri鹏励erctJcisis1H37Rvculturefiltrateproteins.5caW//鹏""o/,2008,67:245-252.)、/PW675c(SiddersBetal.Screeningofhighlyexpressedmycobacterialge加sidentifiesRv3615casausefuldifferentialdiagnosticantigenfortheMycobacteriumtuberculosiscomplex,i/2/ec"/鹏叫2008，76:3932-9.)以及yi^75"(Buddle，B.M.etal.DifferentiationbetweenJZ/coAscter/iw6oyisBCG—vaccinatedand力01a'5^infectedcattlebyusingrecombinantmycobacterialantigens.,ZVagT.i/z朋朋o7，1999，6:1-5.)均是已有文献报道的结核分枝杆菌抗原。本实施例不仅成功鉴定到以上5个已经报道的结核分枝杆菌抗原，另外还成功的鉴定和筛选到5个新型的候选抗原(即表7中标注的"新抗原")。这5个候选抗原均能够与结核发病人血清发生强烈反应，有些甚至比现有的用于诊断结核病的抗原信号还要强烈，在结核病的血清学诊断中具有潜在的应用价值。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>ttccaagaattctcatatggctgccgcgcggcaccaggccgctgctgtgatgatgatgat1440ggitggctgctgcccatggtatatctccttcttsaagtt犯acaaaattatttct卿ggg1500g犯ttgttatccgctcacaattcccctatagtgagtcgtattaatttcgcggg3tcg卿1560tctcgatcctctacgccggEtcgcatcgtggccggcatcacCggCgCC3C3ggtgcggttg1620ctggcgcctatatcgccgac3tC8CCg3tgggg3卿tcgggctcgccacttcgggctca1680tgagcgcttgtttcggcgtgggta^tggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcg1740ccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactac1800tgggctgcttg3gtcgcaJ:33ggg卿gCgtcgagatcccggacaccatc1860gaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgstagcgcccgg卿卿g,tcaattcagg1920gtggtg犯tgtga犯ccagtaacgttetacgatfetcgcagagta_tgccggtgtctcttat1980cagaccgtttcccgcgtggtg犯ccaggccagccacgtttctgcgseia^c2040gtgg鄉cggcgeitggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcaca3C犯CtggCg2100ggc朋acagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcg2160caaattgtcgcggcgatt朋atctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcg2220atggtag3acg卿cggcgtcgaagcctgt犯鄉ggcggtgcacaatcttctcgcgc犯2280cgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtgg肌2340gctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacaxxcal:caac2400agtattattttctcccatga卿cggtacgcgactgggcgtgg3gC3tCtggtcgcattg2460ggtcaccagcaaMcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgt2520ctggctggctggcat肌atatctcactcgcaatcaaattc3gCCg3t3gCgg犯cggg犯2580ggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgc犯3tgCtg犯,tgagggcatc2640gttcccactgcgatgctggttgccaacgatC3g3tggCgCtgggcgc犯tgcgcgccatt2700accgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataxxgaa2760gacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaac8gg3"tt"ttCgcctgctgggg2820caaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtg33gggcaatcag2880ctgttgcccgtctcactggtgaaaagaa犯accaccctggcgcccaatacgcaaaccgcc2940tctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaa3000柳gggcagtgagcgc^cgc^ttaatgtaagttagctcactcattaggC3CCggg3tC3060tcgaccgatgcccttgagagccttc犯cccagtcagctccttccggtgggcgcggggcat3120gactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgcc3180ggcagcgctctgggtcattttCggCg3gg3ccgctttcgctggagcgcgacgatgstcgg3240cctgtcgcttgcggtattcgg犯tcttgcaicgccctcgctcaagccttcgtcactggtcc3300cgtttcggcgcattatcgccggCEltggCgg.ccccacgggt3360gCgC8tg8tCgtgctcctgtcgttg娜acccgjgctaggctggcggggttgccttactgg3420ttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcg33Cgtg8￡lgCgactgctgctgcaaaacgtc3480tgcgacctgagcaacaaceitgaatggtcttcggtttccgtgtttcgta犯gtctgga犯c3540gcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggct3600accctgtggaacacctecatctgtattaacg卿cgctggcattgaccctgagtgatttt3660tctctggtcccgccgcatccatsccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccg3720ggcatgttcatcatcagtaacccgtstcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcat3780tacccccatg犯cageiafitcccccttacacggaggcatcaeiggaaaa犯c3840cgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaa3900cgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgacc3960gctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtg肪aacctct4020gctcccggagacggtcacagcttgtctgta3gCgg3tgCCgggagcagacaagcccgtca翻鹏cgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgaxxc3gtcacgtagcga4140tagcggagtgtatactggctt犯Ct3tgCggcatcagagc8g8ttgt3Ctg卿gtgC8C4200catatatgcggtgtga^aitdccgcscagatgcgt肌ggag犯aataccgcstcaggcgct4260cttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggCg￡lgCggt8t4320cagctcactc,ggcggtsatscggttatCC3C3g33tC鄉gg3t犯C4380acatgtgagcaaetaggccagcaB犯ggcc3gga^LCCgt肌3卿gCCgCgttgctggcgt4440ttttccataggctccgccccCCtgaCg6LgCtcgacgctca8gtC卿ggt4500ggcga犯cccgscaggactaaggcgtttccccctggaagctccctcgtgc4560gctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcggg犯4620gcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgct4680cc卿ctgggctgtgtgcacg犯ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggta4740actatcgtcttgagtccaacccggt肌gacacgacttatcgccactggcagcagccact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技术领域：
，具体涉及一种结核分枝杆菌基因表达文库的构建方法及应用。发明的特征是，制备获得了两个适用于构建结核分枝杆菌基因表达文库的表达载体pETEXba和pGEXMCM，利用PCR反应获得结核分枝杆菌的全部编码基因，进而通过将结核分枝杆菌的全部编码基因精确克隆到构建的表达载体中，通过转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，最后得到结核分枝杆菌基因表达文库。对该文库进行了初步应用，证明该文库可以有效地筛选到新型保护性抗原。所构建的表达载体pETEXba和pGEXMCM的核苷酸序列如SEQIDNO1和SEQIDNO2所述。本发明的方法成本低、高通量、覆盖率高。可用于新型保护性抗原及药物靶标的筛选。文档编号C12N15/70GK101487018SQ20091006095公开日2009年7月22日申请日期2009年3月4日优先权日2009年3月4日发明者何正国,李雨庆申请人:华中农业大学