专利名称：基于颜色的环介导逆转录等温扩增技术检测人甲型h1n1流感病毒基因的制作方法
技术领域：
本发明是用基于HNB颜色的环介导逆转录等温扩增技术检测人甲型Hmi流感病 毒HA基因。用于各级疾病预防控制机构，流感检测网络实验室，哨点医院对人甲型Hmi流 感病毒的检测和监测。
背景技术：
甲型Hmi流感(原称人感染猪流感病毒)是一种新的甲型Hmi病毒引起的急性 呼吸道传染病，具有较强的传染性，可通过近距离飞沫和接触传播，这种新型病毒是美国于 2009年4月在人体中首次检出的。目前，甲型Hmi流感疫情已在全球较大范围内传播，世 界卫生组织已将流感大流行预警级别提至5级。截止2009年5月21日，世界卫生组织共接 到41个国家累计报告甲型Hmi流感确诊病例11034例，死亡85人。我国内地累计报告甲 型Hmi流感确诊病例5例(北京2例，四川、山东、广东各1例)，均为输入性病例。鉴于我 国已出现输入型甲型Hmi流感病例，为有效阻止疫情的传入和发生疫情后的应急处置，根 据卫生部应对甲型Hmi流感疫情防控要求，我国已决定在各地增加病毒检测实验室和哨 点医院，扩大监测网络的覆盖范围。将网络实验室扩大到整个地市一级，目标是使全国300 多个地市都具备能够进行病毒检测的能力，及早发现可能出现的输入性病例和内地人传人 病例，切实做到早发现、早报告、早处置。本专利成功建立的基于颜色的RT-LAMP检测人甲 型Hmi流感病毒基因方法，将为提高我国流感监测网络实验室和哨点医院的监测能力，实 现对发热病人的快速筛查提供了有力的技术保障。基于颜色的RT-LAMP技术在RNA病毒的检测方面应该有着传统基因诊断方法无法 比拟的优势，与一些常规的基因检测手段相比，该技术在可操作性和检测时间及设备要求 方面具有更大的优势。这主要体现在以下几个方面。首先，它的检测时间可以缩短到两小时 以内，灵敏度可达到检测十个拷贝以上的病毒核酸分子。除了应用一些常用聚合酶外，对硬 件设备基本无特殊要求，在普通的生物实验室就可完成这项检测工作。在试验实施中只需 一步就可完成实验操作，减少了污染机会并方便了实验过程中的质控工作。第二，该技术省 略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，加之扩增反应在65°C等温条件下进行，没 有核酸的变复性过程，不但节省了大量的时间又减少了 RNA酶和扩增核酸的污染机会。第 三，扩增反应只有在六条引物完全与识别的靶序列中八个结合区匹配的情况下才能顺利进 行，所有这些特性都在很大程度上减少了扩增反应的背景，从而使检测特异性得到改善。第 四，RT-LAMP的扩增反应中可以形成可视的焦磷酸镁白色沉淀，HNB染料在扩增前加入，因 此肉眼也可观察到阳性反应管中的白色混浊物和反应管内颜色的变化，可以直接判定检测 结果。
发明内容
1.本发明是对目前对RNA病毒检测技术手段的改进和补充，它具有安全、特异、灵 敏、便捷的优势。这主要体现在以下几个方面。首先，扩增反应只有在六条引物完全与识别的靶序列中八个结合区匹配的情况下才能顺利进行，所有这些特性都在很大程度上减少了 扩增反应的背景，从而使检测特异性得到改善。第二，该技术省略了单独的逆转录和巢式 PCR的二次扩增步骤，只需一步就可完成实验操作，没有核酸的变复性过程，减少了 RNA酶 和扩增核酸的污染机会，提高了检测的敏感性和安全性。第三，所有的扩增过程都可在65°C 同温下完成，无需PCR仪，降低了对实验硬件的要求。第四，较RT-PCR缩短了检测所需的时 间。2.选择人甲型Hmi流感HA基因的756-956位的相对保守区设计相应的RT-LAMP 引物，其中包括两条外引物(F3、B3)和两条内引物(FIP、BIP)，两条环结合引物(Loopl、 Loop2)。所有引物的具体序列见表1。表1 :RT-LAMP检测人甲型Hmi流感HA基因的引物序列 3.建立了如下的检测过程，详见如下(1)合成探针使用北京英杰生命技术有限公司合成仪合成并纯化。 (2)将待测标本按Qiagen公司的病毒RNA提取试剂盒步骤处理，获得样本的RNA。(3) RT-LAMP 反应。(4)阳性反应结果用肉眼可观察到白色沉淀和颜色从紫色变成天蓝色，也可用 650nm的吸光值判定
具体实施例方式实施方案1 基于颜色的RT-LAMP检测人甲型Hmi流感的特异性按Qiagen试剂盒说明提取不同来源和亚型的流感病RNA。建立如下扩增反应体 系1μ1 RNA 样品、2. 5 μ IBst DNA 聚合酶缓冲液(10X)、1 μ 1 Bst DNA 聚合酶(8U/μ L)、 1 μ 1 AMV 反转录酶(lOU/μ L)、2· 5μ ldNTP(lOmmo 1/L)、8μ 1 Betaine (250mmol/L)、1 μ 1 MgSO4 (150mmo 1/L)Uy 1 HNB (3mmol/L)，对应于HA基因的六条引物各1 μ 1 (引物浓度为F3 与 Β3 :5pmol/ μ L、BIP 与 FIP :40pmol/ μ L、Loop-l 与 Loop-2 :20pmol/ μ L)、1 μ 1 dH20o 混勻，65°C，水浴1. 5h，85°C，2min终止反应，，观察颜色变化和白色沉淀。只有此次流行的人 甲型Hmi流感病毒有特异性扩增。实施方案2 基于颜色的RT-LAMP检测人甲型Hmi流感病毒的灵敏度系列稀释纯化和定量后的体外转录的人甲型Hmi流感HA全基因的RNA至10，20， 40，60，80，100，1000和10000拷贝，RT-LAMP检测的体系同实施方案1。检测的灵敏度可达 到60拷贝RNA的水平。实施方案3 基于颜色的RT-LAMP检测人甲型Hmi流感病毒的结果可用肉眼(观 察颜色变化和白色沉淀)或比色值判定RT-LAMP反应完成后，用肉眼观察颜色的变化和管底的白色沉淀，也可取20 μ 1测 定650nm的吸收值。阳性反应管用肉眼可在管底观察到白色沉淀，管内颜色从反应前的紫 色变成了反应后的天蓝色，650nm的吸光值彡0. 31。
权利要求
一种用于人甲型H1N1流感病毒HA基因检测的基于HNB颜色的环介导逆转录等温扩增技术(RT LAMP)，其中包括用于人甲型H1N1流感病毒HA基因检测的6条寡核苷酸引物和HNB(羟基萘酚蓝)染料。
2.权力要求1所述的人甲型Hmi流感病毒检测的环介导逆转录等温扩增技术 (RT-LAMP)的引物包括表1所列的基因序列及其每种序列的互补序列或变体。
3.权力要求1所述的人甲型Hmi流感病毒检测的环介导逆转录等温扩增技术 (RT-LAMP)包括人甲型Hmi流感病毒及其变异株。
4.权力要求3所述的本发明的应用范围包括各级疾病预防控制机构，流感检测网络实 验室，哨点医院用于人甲型Hmi流感病毒HA基因的检测和监测。
5.权力要求1所述的人甲型Hmi流感病毒HA基因检测的基于HNB颜色的环介导逆转 录等温扩增技术(RT-LAMP)的反应程序和检测程序。
全文摘要
本发明属于生物技术应用领域，涉及各级疾病预防控制机构，流感检测网络实验室，哨点医院等用于对发热病人咽拭子等标本的人甲型H1N1流感病毒HA基因的检测和监测。具体是应用基因颜色的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)，通过计算机软件分析人甲型H1N1流感病毒HA基因的保守序列，设计出六条引物完全与识别的HA靶序列中八个结合区匹配，省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，反应前加入HNB(羟基萘酚蓝)染料，只需一步就可完成在65℃等温环境中扩增1.5小时，最后用肉眼观察颜色变化和管底的白色沉淀判定检测结果，与传统的RT-PCR方法比较，它具有更安全、特异、灵敏、便捷的优势。
文档编号C12Q1/68GK101899529SQ200910143718
公开日2010年12月1日 申请日期2009年5月26日 优先权日2009年5月26日
发明者李德新, 聂凯, 舒跃龙, 董小平, 马学军 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所