专利名称：一种快速检测转基因烟草外源基因拷贝数的方法
技术领域：
本发明涉及一种快速检测转基因烟草外源基因拷贝数的方法，属于基因工程领域。
二背景技术：
在转基因植物中，外源基因是被随机地插入到植物基因组中的，而插入到不同或 相同位置染色体的多个转基因拷贝经常会导致基因沉默。只有插入单拷贝或双拷贝的外源 基因的植物才能产生高水平的表达，所以检测转基因拷贝数，选择单拷贝或双拷贝转基因 株系进行后期功能鉴定至关重要。 目前判断基因拷贝数的方法主要有Southern杂交、实时荧光定量PCR，还包括荧 光原位杂交、比较基因组杂交，对于Southern杂交，该方法通过基因组酶切、电泳、转膜、杂 交等步骤，可判断拷贝数；对于实时定量PCR，该方法通过监测PCR过程中产物的实时变化， 可判断基因拷贝数；而对于荧光原位杂交、比较基因组杂交该两种技术，其工作量、费用和 困难程度比之Southern杂交有过之而不及。 烟草是一种转基因研究的模式植物，转化体系成熟，易于获得阳性植株。本发明的 成功运用，将给今后运用转基因技术研究基因功能带来极大的便利。
三、
发明内容
技术问题 本发明的目的是公开一种快速检测转基因烟草外源基因拷贝数的方法，为广大转 基因工作者提供一种快速而成本低廉的转基因拷贝数检测的方法，尤其是对单拷贝和双拷 贝基因的鉴定。
技术方案 烟草纯合微卫星(SSR)位点的获得一人工合成短截SSR核苷酸片段一将合成片段 插入含有欲转入基因的植物双元表达载体一采用农杆菌介导叶盘法转化烟草一烟草抗性 苗的获得一烟草抗性苗DNA的提取一PCR扩增一判断转入外源基因拷贝数。
1、快速检测转基因烟草外源基因拷贝数的方法，其具体步骤如下
1)人工合成序列'SSR-95'并加入HindIII、 Sphl酶切位点； 2)将步骤1)所述序列'SSR-95'插入到含有目的基因的植物双元表达载体 pCAMBIA-1301的相应酶切位点，转化至大肠杆菌DH5a菌株，PCR检测后，提取阳性菌液质 粒，将其转化至农杆菌EHA105菌株，PCR检测后获得阳性菌株；
3)将步骤2)所述阳性农杆菌EHA105菌株采用叶盘法转化至烟草'K326';
4)将步骤3)所述烟草进行GUS染色，获得GUS阳性株系； 5)采用常规CTAB法提取步骤4)所述GUS阳性株系的DNA，将其稀释至50-100ng/ y 1 ，用引物P-F : 5' -TCGGGTCGTTACAACTGATG-3'禾P P-R : 5' -CCACGTCATTCGGAGTTGTT-3'进行 PCR扩增，经2X琼脂糖凝胶电泳检测，发现两条条带，其中一条为内源SSR片段'SSR-168'，另一条为外源合成的短截片段'SSR-95';当'SSR-95'亮度低于'SSR-168'时，则表示与片 段'SSR-95' —同转入烟草基因组的目的基因为单拷贝； 当'SSR-95'亮度高于'SSR-168'时，则表示转入的目的基因为多单拷贝；当两者 亮度一致时，则表示所转入的目的基因为双拷贝。
有益效果 使用Southern杂交检测转基因株系的拷贝数，DNA的需求量较大，同时也要花费 较长的时间，而采用实时荧光定量PCR检测转基因株系的拷贝数，则需要昂贵的荧光定量 PCR仪，但本发明只需采用一对SSR特异引物对转基因植物进行PCR检测，就可以快速检测 转基因株系的拷贝数，简单易行，尤其是对插入单拷贝和双拷贝外源基因株系的检测。
四
图1为植物双元表达载体'pSSR-C0PY' T-DNA区域结构示意图
图2为拷贝数检测原理示意图 图3为转基因烟草拷贝数2%琼脂糖凝胶电泳检测图 M :DNA分子量Marker ;1 :阳性外源SSR质粒对照；2 :阴性内源SSR片段对照；3-6 : 转基因株系A-D 图4为转MdCAXl基因烟草生根苗
五具体实施例方式
1、烟草品种'K326'纯合微卫星(SSR)位点'PT1199'的获得 Bindler等(Bindler G，van der Hoeven R，Gunduz I et al. A microsatellite
marker basedlinkage map of tobacco [J]. Theor. Appl. Genet. ， 2007， 114 :341-349)获得
一个一.倍体烟草品种'K326'纯合微卫星(SSR)位点'PT1199'，合成该位点的特异引物如下P-F :5' -TCGGGTCGTTACAACTGATG-3'
P-R:5' -CCACGTCATTCGGAGTTGTT-3'
进行PCR扩增，反应体系(25 ii 1)如下
烟草DNA(100ng/ii 1)1 ii 1HiFi Taq(5U/ii 1)0. 2ii 1上游引物(lOiiM)1 ii 1下游引物(lOiiM)1 ii 1Buffer I(IOX)2. 5ii 1d證(10mM)0. 5ii 1无菌ddH2018. 8ii 1反应程序如下94°C 5min ;35个循环:94°C 30s，54。C 30s，72。C 30s ;72。C 5min ;10。C 20min将扩增片段于2%的琼脂糖凝胶电泳检测后，使用凝胶回收试剂盒(爱思进生物技术有限公司生产)回收该片段，继而连接到PMD18-T(购自大连宝生物有限公司)克 隆载体中，转化大肠杆菌DH5 a菌株(购自全式金生物技术有限公司)，经蓝白斑筛选，
4挑取白色菌落进行培养，PCR鉴定阳性克隆，交由上海英俊生物技术有限公司测序，获得长度为168bp预期片段'SSR-168' (Bindler G， van der Hoeven R， Gunduz I etal. Amicrosatellite marker based linkage map of tobacco[J]. Theor. Appl. Genet. ，2007，114 :341-349)。 2、烟草品种'K326，纯合微卫星(SSR)位点'PT1199'短截片段'SSR-95'的获得
根据测序获得的片段'SSR-168'，从其中间截去长度为73bp序列，获得片段'SSR-95'，在其两端加入Hind III、 Sph I酶切位点，将该序列交由金斯特生物技术有限公司人工合成，获得一个'PUC57-SSR'克隆载体质粒(PUC57克隆载体，金斯特生物技术有限公司)。 3、载体构建 将上述获得的含有SSR短截片段的'PUC57-SSR'克隆载体质粒，使用内切酶HindlII、Sph I(购自大连宝生物有限公司)进行双酶切，反应体系(50iU)如下
PUC57-SSR质粒(50ng/ ii 1)38 ii 1 HindlII(15U/ii 1) 1 ii 1 Sphl(15U/ii 1) K Buffer (10 X) 5 ii 1 无菌ddH20 5 ii 1 将上述样品混匀后，于37°C的水浴锅中，酶切2-3h后，在2 %的琼脂糖凝胶中进行检测。使用凝胶回收试剂盒(爱思进生物技术有限公司生产)回收切下的小片段，将回收的该片段亚克隆到含有目的基因MdCAXl(NCBI登录号为FJ008870)植物双元表达载体pCAMBIA-1301的相应酶切位点(图l)，连接体系(20iU)如下 pCAMBIA-1301 (50ng/ ii 1) 1 ii 1 片段'SSR-95， (10ng/ii 1) 15 iU T4-连接酶(350U/ ii 1) 1 ii 1 Buffer (10 X) 2 ii 1 无菌ddH20 1 ii 1 将上述样品混匀后，于PCR(型号为PTC-100)仪上16。C连接2h，转化至大肠杆菌DH5 a菌株，PCR检测后，提取阳性菌液质粒，进行酶切验证，将该质粒命名为'pSSR-COPY'。应用冻融法将其转化至农杆菌EHA105菌株，挑取阳性克隆进行PCR检测检测，获得阳性菌株。 4、农杆菌介导'pSSR-COPY'转化烟草'K326' 接种含有质粒'pSSR-COPY'的农杆菌EHA105单菌落于40ml含Km 50mg L—1的YEB液体培养基中，28。C培养至0D600约0. 5，5000rpm离心10min，菌体用40ml MS液体培养基(不含激素，不调PH)重新悬浮；将烟草叶片剪成l-2cm2的叶块，放入上述用无菌液体MS培养基稀释过的农杆菌中，浸泡3min，其间不断轻摇几次；取出材料，放在无菌滤纸上吸去多余菌液，接种于共培养培养基(MS+BA 1. Omg L—丄+NAA 0. 2mg L-、 pH 5. 8)中，28t:共培养2-3d ;共培养结束后，将烟草叶片转入筛选培养基(MS+BA 1. Omg L—^NAA0. 2mg L—'+hyg. 30mg L—、b 500mg L-、 pH 5. 8)中，直接置于25。C下光照培养，每天光照16小时，光强为40-50 ii mol *m—2 s—、经过20-30天培养，在叶片边缘出现抗性芽，将抗性芽转入新鲜的筛选培养基，待抗性芽长至3-5cm时，剪下，转入生根培养基(1/2MS+IBA
0. 2mg L—丄+hyg. 30mg L—丄+cb 200mg L—、 pH5. 8) ， 15-20天即可生根，共获得了 48棵潮霉
素抗性植株。 5、GUS染色检测 从抗性植株和非转基因对照的顶端幼叶上剪取l-2cm2的叶块，放入装有GUS染色液的离心管中，37t:培养箱中进行GUS组织染色，6-10h后取出叶片，用70X的乙醇脱色，结果表明，在48棵潮霉素抗性植株中，共有4棵烟草潮霉素抗性苗呈GUS组织染色阳性，分别命名为A、B、C、D。
6、拷贝数检测 图2为拷贝数检测原理示意图，本文中转入到烟草基因组中的SSR片段比内源SSR片段短73bp，通过SSR片段两侧的引物PCR扩增后，转基因阳性植株应该有两条片段出现，内源SSR片段长度为168bp，外源SSR片段长度为95bp。因为本文中选择的二倍体烟草品种'K326'的SSR位点是纯和的，即该烟草染色体中有两个相同的该SSR位点，在基因组中该位点是双拷贝的，所以根据内外源片段PCR扩增产物的亮度对比，即可判断与其一同转入烟草基因组的外源目的基因MdCAXl的拷贝数。当'SSR-95'亮度低于'SSR-168'时，则表示所转入的目的基因MdCAXl为单拷贝；当'SSR-95'亮度高于'SSR-168'时，则表示所转入的目的基因MdCAXl为多单拷贝；当两者亮度一致时，则表示所转入的目的基因MdCAXl为双拷贝。 采用常规CTAB法提取步骤5所述GUS染色阳性株系的DNA，将其稀释至50-100ng/iiL，进行PCR扩增，引物与反应体系同步骤1，反应程序如下94 °C 5min ;25个循环94。C 30s，54。C 20s，72。C 15s ;72。C 5min ;10。C 20min。结果如图3所示，株系A、 C、 D中'SSR-95'扩增片段亮度弱于内源SSR片段'SSR-168'，因此该3个株系中插入的目的基因MdCAXl为单拷贝；而株系B的'SSR-95'扩增片段亮度要远远高于内源SSR片段'SSR-168'，这说明基因组中整合了多个拷贝的目的基因MdCAXl。序列表〈110〉南京农业大学〈120〉 一种快速检测转基因烟草外源基因拷贝数的方法〈130〉说明书〈160>3〈170>PatentIn version 3. 1〈210>1〈211>20〈212>DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221〉引物P-F左端〈222〉 (1) (20)〈223〉〈400>1
tcgggtcgtt acaactgatg20〈210>2〈211>20〈212>DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221〉引物P-R右端〈222>(1).. (20)〈223〉〈400>2ccacgtcatt cggagttgtt 20〈210>3〈211>95〈212>DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221>SSR-95〈222>(1). . (95)〈223〉〈400>3tcgggtcgtt acaactgatg gttgtcttgt ggtcagaaca ggtccccaac accacacactc朋朋3ccte gacate3C3a ctccg朋tg3 cgtgg
权利要求
快速检测转基因烟草外源基因拷贝数的方法，其具体步骤如下1)人工合成序列‘SSR-95’并加入HindIII、SphI酶切位点；2)将步骤1)所述序列‘SSR-95’插入到含有目的基因的植物双元表达载体pCAMBIA-1301的相应酶切位点，转化至大肠杆菌DH5α菌株，PCR检测后，提取阳性菌液质粒，将其转化至农杆菌EHA105菌株，PCR检测后获得阳性菌株；3)将步骤2)所述阳性农杆菌EHA105菌株采用叶盘法转化至烟草‘K326’；4)将步骤3)所述烟草进行GUS染色，获得GUS阳性株系；5)采用常规CTAB法提取步骤4)所述GUS阳性株系的DNA，将其稀释至50-100ng/μl，用引物P-F5’-TCGGGTCGTTACAACTGATG-3’和P-R5’-CCACGTCATTCGGAGTTGTT-3’进行PCR扩增，经2％琼脂糖凝胶电泳检测，发现两条条带，其中一条为内源SSR片段‘SSR-168’，另一条为外源合成的短截片段‘SSR-95’；当‘SSR-95’亮度低于‘SSR-168’时，则表示与片段‘SSR-95’一同转入烟草基因组的目的基因为单拷贝；当‘SSR-95’亮度高于‘SSR-168’时，则表示转入的目的基因为多单拷贝；当两者亮度一致时，则表示所转入的目的基因为双拷贝。
全文摘要
本发明涉及“一种快速检测转基因烟草外源基因拷贝数的方法”，属于基因工程领域。人工合成一条95bp中间短截片段，克隆到含有目的基因的植物双元表达载体pCAMBIA-1301，转化至大肠杆菌DH5α菌株，再转化至农杆菌EHA105菌株，PCR检测后获得阳性菌株再转化至烟草‘K326’。将获得的阳性植株，进行PCR扩增，根据扩增获得的片段‘SSR-168’和‘SSR-95’电泳条带的亮度比较就可以确定与片段‘SSR-95’一同转入的外源基因的拷贝数。本发明只需采用一对SSR特异引物对转基因植物进行PCR检测，就可以快速检测转基因株系的拷贝数，简单易行，尤其是对插入单拷贝和双拷贝外源基因株系的检测。
文档编号C12N15/84GK101717825SQ20091023438
公开日2010年6月2日 申请日期2009年11月24日 优先权日2009年11月24日
发明者乔玉山, 徐长宝, 渠慎春, 王三红, 章镇, 蔡斌华, 许宽勇, 陶建敏, 高志红 申请人:南京农业大学