一种蔗糖异构酶基因及其高效表达方法

专利名称：一种蔗糖异构酶基因及其高效表达方法
技术领域：
本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种蔗糖异构酶基因及其高效表达 方法。
背景技术：
蔗糖异构酶(Sucrose isomerase，简称SIase)是生产功能性甜味剂异麦芽酮糖 (醇)和海藻酮糖的关键酶。异麦芽酮糖醇是近年来新兴的一种功能性糖醇，它是由异麦芽 酮糖经镍催化加氢制得。它除了具有一般糖醇的共同特点外，还具有木糖醇和麦芽糖醇等 功能糖醇无法比拟的极低的吸湿性和纯正的口感。由于其独特的性能，受到了食品界制取 无糖甜食品的欢迎，特别是近年来，随着人们对自身健康的重视，异麦芽酮糖醇的生产和开 发利用受到了广泛关注。在欧洲上市不到5年，销售量已经达到10万吨以上，国内市场刚 刚起步，预计其需求量年增长率在10%以上。目前国内外生产异麦芽酮糖普遍采用SIase催化蔗糖而进行的。该反应可 以同时生成异麦芽酮糖和海藻酮糖两种同分异构体，根据主产物的不同分为异麦芽 酮糖主产型和海藻酮糖主产型。所报道的SIase生产菌种中，大黄欧文菌(Erwinia rhapontici)，沙雷氏菌(serratia ρlymuthica),克雷伯氏菌(Klebsiella sp. LX-3) 和多源发散菌(Pantoeadi spera)可以生成70 85 %的异麦芽酮糖，而嗜中酸性 假单胞菌(Pseudomonasmesoacidophila MX-45),放身寸性 土 壤杆菌(Agrobacterium radiobacterMX-232)生成90%以上的海藻酮糖。目前，许多SIase酶已经得到了纯化，相应SIase的编码基因得到了克隆。由于分 泌SIase的野生菌株的生产能力普遍较低，为了克服野生菌的低生产能力，采用基因工程 菌高效表达SIase引起了人们极大的兴趣。在国内，SIase的克隆与表达迄今为止鲜有报 道，国内有限的研究仍主要致力于提高原始菌株的酶产量。因此构建高效的基因工程菌是 降低SIase生产成本的关键。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种优质的蔗糖异构酶基因。本发明还要解决的技术问题是提供上述蔗糖异构酶基因所编码的蛋白质。本发明还要解决的技术问题是提供包含上述蔗糖异构酶基因的表达载体。本发明还要解决的技术问题是提供包含上述表达载体的重组大肠杆菌。本发明还要解决的技术问题是提供利用上述重组大肠杆菌高效表达蔗糖异构酶 基因的方法。本发明还要解决的技术问题是提供上述重组大肠杆菌的应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种蔗糖异构酶基因(即pal I基因)，其核苷酸序列如SEQ ID NO=I所示。该 基因是从大黄欧文菌(Erwinia rhapontici) NX-5 (CGMCC NO 2222) (200710190755. 2)中提
3取获得，共1803bp。一种权利要求1所述基因的编码蛋白质(即蔗糖异构酶，缩写Slase)，其氨基酸序 列如SEQ ID NO 2所示，共601个氨基酸。一种表达载体，包含如SEQ ID NO 1所示的蔗糖异构酶基因。上述表达载体，优选为重组表达载体pET22b (+)。一种重组大肠杆菌，包含如SEQ ID NO 1所示的蔗糖异构酶基因。上述重组大肠杆菌，优选为包含有重组质粒pal I/pET22b⑴的E. coli BL21(DE3)。利用上述重组大肠杆菌细胞高效表达pal I基因的方法，即上述重组大肠杆菌细 胞自诱导产酶的方法，是以糖蜜水解液为诱导剂诱导培养重组大肠杆菌产酶。糖蜜水解液 即作为碳源又作为诱导剂。利用上述重组大肠杆菌细胞高效表达pal I基因的方法，具体为将重组大肠杆 菌在含有50 μ g/mL氨苄青霉素的LB培养基中30 40°C液体培养8 20h，转接至发酵培 养基培养5 7h后降温至25 30°C再诱导培养6 12h ；所述的发酵培养基为糖蜜水 解液 10 50mL/L, (NH4)2SO4 5 10g/L, NaCl 5 10g/L, KH2PO4 1 3g/L, MgSO4 0. 1 lg/L。上述宿主细胞自诱导产酶的方法优选为将重组大肠杆菌细胞在含有50 μ g/mL 氨苄青霉素的LB培养基中37°C液体培养12h，转接至发酵培养基培养5 7h后降温至 25 30°C再诱导培养6 IOh ；所述的发酵培养基为糖蜜水解液40mL/L(50g糖蜜溶解于 IOOmL水中，调pH至1. 8，90°C酸水解3h，KOH回调pH至7. 0制得糖蜜水解液)，(NH4)2S04 8g/L, NaCl 10g/L, KH2PO4 2g/L, MgSO4 0.5g/L。本发明所述的糖蜜按如下方法制备对于每IOOmL水，加入20 80g糖蜜溶解，在 酸性条件下80 100°C水解1 5h，水解结束后加碱调至中性，即为糖蜜水解液。具体来 说，对于每IOOmL水，加入20 80g糖蜜溶解，混勻后离心去除不溶物，室温下用盐酸调pH 值至1 3左右，于80 100°C水解1 5h，水解结束后用浓碱回调pH至7. 0，即为糖蜜水 解液。糖蜜主要成分蔗糖水解为等摩尔的葡萄糖和果糖，少量(1-2% )棉子糖水解为等摩 尔的半乳糖、葡萄糖和果糖。常规的诱导方法是将含有质粒pal I/pET22b(+)的Ε. coli BL21(DE3)，在含 有50 μ g/mL氨苄青霉素的LB培养基中37°C液体培养过夜，转接一次，37°C液体培养至 OD达0.5 0.8后用终浓度为0.2 l.Ommol/L的异丙基硫代-β _D_半乳糖苷(或 0. 2-1. Ommol/L乳糖)在25 30°C条件下诱导10 20h，产SIase酶活为10 15U/mL。通过本发明自诱导产酶的方法(即pal I基因高效表达方法)，重组大肠杆菌产 SIase酶达20 30U/mL。而以常规诱导方法即以外加异丙基硫代_ β -D-半乳糖苷或乳糖 为诱导剂，则宿主细胞产SIase酶活为10 15U/mL。上述宿主细胞在发酵生产异麦芽酮糖中的应用。具体为将游离的或固定化后 的宿主细胞填充至反应罐中，加入450 600g/L的蔗糖溶液，进行酶转化反应，反应温度 25 35°C，转化时间2 IOh ；或者将固定化后的宿主细胞装入填充床式柱反应器中，该反 应器以0. 5 5mL/min的流速单向流加或循环连续流加400 600g/L的蔗糖溶液，进行酶 转化反应，反应温度25 35°C，每批转化时间2 10h。
有益效果本发明方法与现有技术相比具有如下优势1、本发明提供了 pal I基因的高效表达方法。以质粒pET22b(+)为表达载体，以 E. coli BL21(DE3)为表达宿主，可实现pal I的高效表达，发酵液酶活达20U/mL以上，而野 生菌(Erwinia rhaponticiNX-5)的发酵液酶活仅为1. 3U/mL，重组酶具有转化蔗糖生成异 麦芽酮糖的能力。2、本发明提供了一种适合于重组大肠杆菌(含pET系统)的以糖蜜水解液为碳 源的自诱导产酶体系，糖蜜经酸水解后，主要成分为葡萄糖和果糖，可以作为菌体生长的 碳源，糖蜜中还含有少量的棉子糖(1-2% )，经酸水解后分解为等量的半乳糖、葡萄糖和果 糖，其中的半乳糖可充当PET系统中T7启动子的诱导剂，该体系免去了昂贵的诱导剂(异 丙基硫代-β-D-半乳糖苷，IPTG)的加入环节，诱导时间短，使用方便廉价。


图1用于生产重组SIase的pal I/pET22b (+)示意图。图2SIase纯化过程电泳图。其中1 标准蛋白，2 重组菌超声破碎后的上清液，3 经过Ni亲合层析后的SIase。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、实验操作条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不 会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1 大黄欧文菌(Erwinia rhapontici)NX-5总DNA的提取。E. rhapontici NX-5 菌株(CCTCC NO 2222)在 SB液体培养基(蛋白胨 10g/L，酵母 膏5g/L，NaCl 10g/L)中培养12h，SOOOr/min离心收集菌体，无菌水洗涤，收集沉淀悬浮于 500 μ L Tris-EDTA(三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸)缓冲液，加入5 μ LRNA酶，37°C下 保温30min，加入30 μ L 10% SDS (十二烷基硫酸钠)和15 μ L蛋白酶K，37°C下保温60min， 加入100 μ L 5Μ的NaCl溶液和80 μ L CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)，65°C下保温20min， 用700 μ L的酚氯仿异戊醇体积比25 24 1混合溶液抽提，10000r/min离心，上 清液用700 μ L的氯仿异戊醇体积比24 1混合溶剂抽提，10000r/min离心，上清液与 1400 μ L的冰异戊醇混合，_20°C沉淀30min，10000r/min离心，沉淀加200 μ L 70%乙醇清 洗，10000r/min离心，沉淀用Tris-EDTA缓冲液溶解，即得到Erwinia rhapontici NX-5总 DNA。实施例2 =SIase编码基因的克隆。以实施例1得到的E. rhapontici NX-5总DNA为模板，以下列核苷酸序列作为引 物引物 1 :TTAAGCTT CCATGGATTCTCAAGGATT，分别弓丨入 HindIII、Nco I 酶切位点(下 划线部分)。引物 2 GTAAATATTTGAATTAGGCGAGCTC CCTAGGTT，分别引入 BamH I 和 Xho I 双酶 切位点(下划线部分)。PCR 反应在 20 μ L 体系中进行10XPCR 缓冲液 2 μ L、2. 5mmol/LdNTP 2 μ L、ΙΟμ θΙ/L 弓ι物 1 禾口弓ι物 2 各 2μ L、模板 DNA 2 μ L、25mmol/LMgCl2 2 μ L、TaqDNA 聚合酶 1 μ L，补加双蒸水至20 μ L0PCR 反应条件95°C变性 3min，后开始循环，(94°C 30s ；45°C 30s ；72°C 2min ； 72°C 5min)，共25次循环，扩增得到1800bp的PCR片段，切胶回收，回收片段经HindIII和 BamH I双酶切，采用DNA片段纯化试剂盒纯化，与经同样双酶切的pUC18载体连接。转化 至E. coli DH5 α，转化产物涂布含100 μ g/ml氨苄青霉素的LB平板，经37 °C培养过夜，平 板上长了约30个菌落，挑选阳性转化子，接入LB液体培养基，IOh后提取质粒并进行酶切 验证后测序。结果表明插入片段含有一个长1803bp (如SEQ ID N0:1所示)的开放阅读框 (ORF)，编码一个由601个氨基酸编码的蛋白质(如SEQ ID NO 2所示)。实施例3 :pal I基因在表达载体上的构建。用于构建表达载体的质粒是pET22b(+)，带有pelB信号肽和His-tag标记。将 pET22b(+)质粒和pal I基因进行Xho I和Nco I双酶切，切胶回收pal I后经T4连接 酶16°C连接过夜，连接产物转化E. coli BL21(DE3)感受态细胞，经37°C培养过夜，挑选 转化子于100 μ g/mL氨苄青霉素的LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的pal I/ pET22b (+)质粒(图 1)。实施例4 大肠杆菌宿主转化。E. coli BL21(DE3)宿主菌在LB液体培养基中培养12h，按5%的接种量转移至 新鲜的LB液体培养基中，37度培养2h，取ImL培养液加入1. 5ml离心管中，5000r/min离 心5min(4°C )，倾去上清液加入用冰遇冷的0. lmol/L CaCl2500 μ L振荡混勻，低温离心 5min(5000r/min)，倾去上清，再加CaCl2500 μ L振荡混勻，低温离心5min (5000r/min)，收 集菌体加200 μ 1 CaCl2混勻，分装成两管(IOOyL)，制成感受态细胞。吸取5 μ Lpal I/ pET22b (+)，加入100 μ L感受态细胞溶液中，冰浴30min，42°C水浴90s，迅速将离心管转移 至冰浴中，使细胞冷却l-2min，然后加入Iml LB培养基，37°C培养45min后，吸取200 μ L已 转化的感受态细胞转移至含氨苄抗性的LB平板上，37°C培养24-36h。挑选转化子进行酶切 鉴定。实施例5 含pal I/pET22b (+)的Ε. coli BL21 (DE3)经常规方法诱导产酶。将含有质粒pal I/pET22b(+)的 Ε. coli BL21 (DE3)，在氨苄青霉素(100 μ g/mL) LB平板上经37°C培养过夜，挑选转化子(含pal I/pET22b (+)的Ε. coli BL21 (DE3))在LB 液体培养基中37°C培养过夜，后转接至LB发酵培养基中37°C培养至OD 0. 6后用终浓度为 0. 8mmol/L的IPTG (异丙基硫代-β -D-半乳糖苷)在20°C条件下诱导14h，SIase酶活力 为10U/mL ；或采用0. 5mmol/L乳糖，在24°C条件下诱导12h，SIase酶活力为12U/mL。酶活 的检测方法为取经诱导表达后的细胞培养液lmL，8000r/min离心5min收集菌体，生理盐 水洗涤一遍，用200 μ 1磷酸钾缓冲液(ρΗ 5.8,0. 025mmol/L)重悬，加入800 μ L蔗糖溶液 (500g/L)作为底物，30°C下转化lh，100°C沸水浴IOmin终止反应，12000r/min离心lOmin， 取上清，使用高效液相色谱测定异麦芽酮糖在产物中的含量，(HPLC条件Agilentl200型 HPLC系统，ShodexRlOl示差折光检测器，色谱柱Rezex RCM-Monosaccharide Ca2+柱，流动 相为纯水，流速0. 5ml/min，柱温80°C )以30°C条件下ImL培养液中的细胞每分钟催化蔗糖 生成1 μ mol异麦芽酮糖为1个酶活单位(U)，以下相同。实施例6 糖蜜水解液的制备方法。
称取50g糖蜜溶解于IOOml蒸馏水中，混勻后于8000r/min离心20min，去除不溶 物，室温下用37% (ν/ν)的盐酸调ρΗ值至1.8左右，于90°C水解3h，水解结束后用5mol/ LKOH回调ρΗ至7. 0，即为糖蜜水解液。糖蜜主要成分蔗糖水解为等摩尔的葡萄糖和果糖， 少量(1-2% )棉子糖水解为等摩尔的半乳糖、葡萄糖和果糖。糖蜜水解液具体成分葡萄 糖18 20% (即IOOg糖蜜中含18 20g葡萄糖，以下定义相同)，果糖23 25%，半乳 糖0. 4 0. 6%，检测方法HPLC法，具体条件同实施例5。实施例7 含pal I/pET22b⑴的E. coli BL21 (DE3)以糖蜜水解液为碳源，形成 SIase的自诱导表达体系。将含有质粒palI/pET22b(+)的 Ε. coli BL21(DE3)，在含有 50μ g/mL氨苄青霉素 的LB培养基中37°C液体培养过夜，转接至发酵培养基(糖蜜水解液40mL/L，(NH4)2SO4Sg/ L，NaCl 10g/L,KH2PO4 2g/L,MgSO4 0. 5g/L，自然 ρΗ)，培养 5_7h 后降温至 25°C诱导培养，8h 产 SIase 酶达 23U/mL。实施例8 SIase的纯化和特性。将上述SIase发酵液于4°C、lOOOOr/min离心20min收集菌体，生理盐水洗涤一 遍，重新悬浮于缓冲液中，冰浴条件下超声破碎菌体(400W，20min)。缓冲液组成为25mmol/ L磷酸钠(ρΗ = 5. 8)，超声后离心(10000r/min, 40min)，取上清液，得SIase粗酶液。Ni亲 和柱用缓冲液A(25mmol/L的磷酸钠缓冲液，ρΗ 5. 8)平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完 全吸附后，分别用缓冲液A、含20mmol/L咪唑的缓冲液A、含250mmol/L咪唑的缓冲液A洗 脱，流速lmL/min，检测波长为280nm，收集SIase酶活洗脱液液，活力组分在pH5. 8、25mmol/ L磷酸钠缓冲液中透析过夜后，得纯化SIase酶制品。纯化过程电泳图见图2。实施例9:按实施例6所述方法，将成功表达SIase基因的E. coli BL21 (DE3)细胞收集， 25mM的磷酸钠缓冲液(pH5. 8)洗涤两次，离心收集进行游离细胞转化，称取IOg的细胞加 入500mL 500g/L的蔗糖溶液中，在30°C的条件下，于摇瓶中振荡转化生产异麦芽酮糖，反 应时间2h，反应中止后测底物转化率和产物浓度。蔗糖转化率为99. 5%，异麦芽酮糖转化 率达90%。对比例1 斜面培养基蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaC15g/L，琼脂20g/L，pH7. 0。摇瓶培养基蔗糖50g/L，酵母膏 10g/L，Na2HPO4. 12H20 5g/L，pH7. 0。把大黄欧文氏菌NX-5CGMCC No. 2222在斜面培养基上30°C培养24h，然后接一环 此菌于摇瓶培养基中，30°C培养10h，摇瓶转速200r/min，得到的发酵液中菌体的含量为 20g/L，产酶达2. 5 5. 0U/ml，以游离细胞转化，称取IOg的细胞加入500mL 500g/L的蔗糖 溶液中，在30°C的条件下，于摇瓶中振荡转化生产异麦芽酮糖，反应时间20h，反应中止后 测底物转化率和产物浓度。蔗糖转化率为90 %，异麦芽酮糖转化率达80 %。
权利要求
一种蔗糖异构酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.—种权利要求1所述基因的编码蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.—种表达载体，其特征在于包含权利要求1所述的蔗糖异构酶基因。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述表达载体为pET22b(+)。
5.一种大肠杆菌细胞，其特征在于包含权利要求1所述的蔗糖异构酶基因。
6.根据权利要求5所述的大肠杆菌细胞，其特征在于所述大肠杆菌细胞为包含有重组 质粒 pal I/pET22b (+)的 Ε. coli BL21 (DE3)。
7.一种利用权利要求6所述的大肠杆菌高效表达权利要求1所述基因的方法，其特征 在于以糖蜜水解液为诱导剂诱导培养重组大肠杆菌细胞产酶。
8.根据权利要求7所述的高效表达基因的方法，其特征在于将重组大肠杆菌细胞在含 有50 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中30 40°C液体培养8 20h，按2 10 (ν/ν) % 的接种量转接至发酵培养基培养5 7h后降温至25 30°C再诱导培养6 12h ；所述的发 酵培养基为糖蜜水解液 10 50mL/L, (NH4)2SO4 5 10g/L, NaCl 5 10g/L，KH2PO4 1 3g/L, MgSO4 0.1 lg/L。
9.根据权利要求7或8所述的高效表达基因的方法，其特征在于所述的糖蜜水解液按 如下方法制备对于每IOOmL水，加入20 80g糖蜜溶解，在酸性条件下80 100°C水解 1 5h，水解结束后加碱调至中性，即为糖蜜水解液。
10.权利要求6所述的重组大肠杆菌在生物催化生产异麦芽酮糖中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种蔗糖异构酶基因，pal I基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。本发明还公开了上述基因的编码蛋白质，SIase酶。本发明还公开了包含上述基因的表达载体及宿主细胞，以及该基因的高效表达方法。包含上述蔗糖异构酶基因的重组菌具有异构的活性，能转化蔗糖生成异麦芽酮糖。该重组菌稳定性好，催化效率高，产物特异性明显改善，可应用于异麦芽酮糖的工业生产中。
文档编号C12N15/63GK101906430SQ20101010576
公开日2010年12月8日 申请日期2010年2月2日 优先权日2010年2月2日
发明者任贲, 徐虹, 李莎, 汪晨, 蔡恒 申请人:南京工业大学