专利名称：一种提高脂肪酶活性的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程领域，特别涉及一种在酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)细胞壁外表面展露表达脂肪酶以提高该酶活性的方法。
背景技术：
酯是一大类在化工、食品、医药等领域广泛应用的重要产品或中间体，仅用作食用香料的酯即达数百种。各种酯的合成路线相同，均以羧基供体(如酸、酸酐)和羟基供体 (如醇、淀粉等)为原料，通过酯化反应制备。用产脂肪酶的微生物细胞已能进行许多种酯的生物合成。与酯的化学合成相比， 酯的生物合成具有效率更高、反应条件温和、能耗低等优点。但目前应用的脂肪酶主要存在以下问题酶的重组表达方式一般是细胞内表达和分泌表达。细胞内表达时由于酶不能与细胞外底物接触，从而极大地影响酶的催化效率，而且酶分子集聚在细胞内形成反馈抑制， 也影响表达效率。分泌表达的主要缺点是表达效率不高，而且也不能实现完全分泌表达，总有相当一部分表达产物滞留于细胞内，从而也不能实现酶与细胞外底物的完全接触。这两种表达方式都导致酶催化效率不高。本发明开发一种将脂肪酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面的技术，实现酶与细胞外底物的完全接触，从而显著提高脂肪酶活性。
发明内容
针对现有的脂肪酶催化效率低的问题，本发明提供一种将脂肪酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面的技术，实现酶与细胞外底物的完全接触，从而显著提高脂肪酶活性。本发明的一种提高脂肪酶活性的方法，包括以下步骤将脂肪酶基因(Genbank 号AF229435)连接在酿酒酵母细胞壁成份α凝集素序列(Genbank号164)的N端， 然后插入酿酒酵母表达载体GALl启动子(Genbank号AY428072)下游MF α 1信号肽序列 (Genbank号Μ17301)的C端，构建成表达框，表达框从N端到C端=GALl启动子+MF α 1信号肽序列+脂肪酶基因+ α凝集素序列；将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞。将包含上述表达框的酿酒酵母细胞培养于添加有6. 5% (重量百分比)半乳糖和 5-8%乳糖(重量百分比)的YPD培养基中。本发明的优点将亚油酸异构酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面，实现酶与细胞外底物的完全接触，从而显著提高亚油酸异构酶活性。
具体实施例方式以下通过实施例进一步对本发明进行描述本发明开发一种将脂肪酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面的技术，实现酶与细胞外底物的完全接触，从而显著提高脂肪酶活性。
三种酶分子表达方式如下
权利要求
1.一种提高脂肪酶活性的方法，其特征在于包括以下步骤将脂肪酶基因连接在酿酒酵母细胞壁成份α凝集素序列的N端，然后插入酿酒酵母表达载体GALl启动子下游MFa 1 信号肽序列的C端，构建成表达框，表达框从N端到C端GAL1启动子+MFa 1信号肽序列+ 脂肪酶基因+ α凝集素序列；将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于将包含“权利要求1”所述表达框的酿酒酵母细胞培养于添加有重量百分比6. 5 %半乳糖和重量百分比5-8 %乳糖的YPD培养基中。
全文摘要
本发明的一种提高脂肪酶活性的方法，包括以下步骤将脂肪酶基因(Genbank号AF229435)连接在酿酒酵母细胞壁成份α凝集素序列(Genbank号M28164)的N端，然后插入酿酒酵母表达载体GAL1启动子(Genbank号AY428072)下游MFα1信号肽序列(Genbank号M17301)的C端，构建成表达框，表达框从N端到C端GAL1启动子+MFα1信号肽序列+脂肪酶基因+α凝集素序列；将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞。本发明的优点将亚油酸异构酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面，实现酶与细胞外底物的完全接触，从而显著提高亚油酸异构酶活性。
文档编号C12N15/81GK102242089SQ20101017284
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者何国庆, 周陈伟, 廖文艳, 徐娟, 王睿之, 阮晖, 陈美龄, 陈赟, 马风兰 申请人:浙江大学