专利名称：半连续发酵生产微生物凝乳酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵生产凝乳酶的方法。
背景技术：
凝乳酶属于酸性蛋白酶，又称天冬氨酸蛋白酶，是生产干酪不可缺少的制剂。凝乳 酶的传统来源是哺乳期期小牛的皱胃，动物凝乳酶及其凝乳活力与蛋白水解能力的高比值 成为制作奶酪的首选酶，但是动物生长缓慢且价格昂贵，容易增加企业成本，并且从动物中 提取酶液程序和工艺较复杂。木瓜、无花果、菠萝、难关、合欢树、银杏等植物中都含有能使 乳凝固的蛋白酶，植物来源的凝乳酶因有太高的蛋白水解活力或本身有毒，因此很多植物 性凝乳酶没有得到大规模商业化应用。微生物凝乳酶来源广泛，目前发现有40余种微生物 可发酵生产凝乳酶，这些微生物主要是放线菌、细菌和真菌等，由于微生物发酵的方法控制 容易，成本低，且安全无毒，而被广泛使用，但是现有的微生物发酵生产方法多采用的是批 次发酵的方法，该方法一个发酵周期为80 96小时，发酵周期长，发酵产能低，产量较低。
发明内容
本发明的目的是为了解决微生物发酵生产发酵周期长、发酵产能低、产量低的问 题，而提供了半连续发酵生产微生物凝乳酶的方法。本发明半连续发酵生产微生物凝乳酶的方法按照以下步骤进行一、米黑根毛 霉接种到种子罐中进行种子培养，得到种子发酵液，种子培养温度为35 37°C，米黑根 毛霉的接种量为89Γ12%，培养时间为2(Γ24小时；二、种子发酵液接种到发酵罐中发酵培 养7(Γ74小时得到发酵液，发酵培养温度为38 39°C ；三、放掉占发酵液体积百分比为 309Γ50%的发酵液，再向发酵罐中补入占发酵液体积百分比为309Γ50%的发酵培养基后发 酵培养22 26小时，而后再一次放掉发酵液再补入发酵培养基发酵培养22 26小时，直至凝 乳酶活力低于158IMCU/ml后放掉全部的发酵液；四、收集步骤三中每次发掉的发酵液和最 后放掉的全部发酵液，即得到了凝乳酶；其中步骤一种子罐使用的培养基、步骤二发酵罐使 用的培养基和步骤二中的补入的发酵培养基均按照重量份数比由3飞份的大豆组织蛋白、 4飞份的玉米粉、0. 7 0. 9份的Na2HPO4、广3份的葡萄糖、0. Γθ. 3份的消泡剂和85 90份的 水组成。本发明的方法通过补料连续发酵，可以提高将近一倍的产能，产量提高将近一倍， 现有的凝乳酶发酵工艺发酵周期为80 96小时放一罐发酵液，通过本发明的方法发酵72 小时后，可以达到48小时放一罐料，本发明不但提高了产量，而且减少了种子培养的时间， 本发明的方法有效的控制了发酵液的排放和补料，保证整个发酵过程中发酵液中的营养成 分破坏少，且整个发酵过程容易控制，本发明方法与现有的微生物发酵的方法相比较周期 缩短了 1(Γ40小时，产量提高了 50%左右，本发明的发酵生产发酵周期短、产量高、发酵产能 尚ο
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式半连续发酵生产微生物凝乳酶的方法按照以下步 骤进行一、米黑根毛霉接种到种子罐中进行种子培养，得到种子发酵液，种子培养温度为 35 37°C，米黑根毛霉的接种量为89Γ12%，培养时间为2(Γ24小时；二、种子发酵液接种到 发酵罐中发酵培养7(Γ74小时得到发酵液，发酵培养温度为38 39°C ；三、放掉占发酵液体 积百分比为309Γ50%的发酵液，再向发酵罐中补入占发酵液体积百分比为309Γ50%的发酵 培养基后发酵培养22 26小时，而后再一次放掉发酵液再补入发酵培养基发酵培养22 26 小时，直至凝乳酶活力低于158IMCU/ml后放掉全部的发酵液；四、收集步骤三中每次发掉 的发酵液和最后放掉的全部发酵液，即得到了凝乳酶；其中步骤一种子罐使用的培养基、步 骤二发酵罐使用的培养基和步骤二中的补入的发酵培养基均按照重量份数比由3飞份的 大豆组织蛋白、4飞份的玉米粉、0. 7 0. 9份的Na2HPO4、广3份的葡萄糖、0. Γθ. 3份的消泡 剂和85 90份的水组成。本实施方式步骤一中的米黑根毛霉可采用MucormieheiCooney&Emerson，该菌从 土壤分离得到的，现可从市场上购买得到。本实施方式步骤二中发酵培养后的发酵液中凝乳酶活力为16(T220IMCU/ml。本实施方式与现有的微生物发酵的方法相比较周期缩短了 1(Γ40小时，产量提高 了 50%左右，本实施方式的发酵生产发酵周期短、产量高、发酵产能高。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中种子培养温 度为36°C，凝乳酸产生菌的接种量为10%，培养时间为22小时。其他步骤及参数与具体实 施方式一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一至二之一不同的是步骤二中培 养时间为72小时得到发酵液，发酵培养温度为38. 5°C。其他步骤及参数与具体实施方式
一
至二之一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤三中每 次放掉的发酵液中凝乳酶活力为16(T220IMCU/ml。其他步骤及参数与具体实施方式
一至三 之一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至四之一不同的是步骤一种子 罐使用的培养基、步骤二发酵罐使用的培养基和步骤二中补入的发酵培养基均按照重量份 数比由4份的大豆组织蛋白、5份的玉米粉、0. 8份的Na2HP04、2份的葡萄糖、0. 2份的消泡 剂和88份的水组成。其他步骤及参数与具体实施方式
一至四之一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤一种子 罐使用的培养基、步骤二发酵罐使用的培养基和步骤二中补入的发酵培养基中所使用的消 泡剂为食用消沫剂。其他步骤及参数与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
七本实施方式半连续发酵生产微生物凝乳酶的方法按照以下步 骤进行一、米黑根毛霉接种到种子罐中进行种子培养，得到种子发酵液，种子培养温度 为36°C，米黑根毛霉的接种量为10%，培养时间为22小时；二、种子发酵液接种到发酵罐 中发酵培养72小时得到发酵液，发酵培养温度为38. 5°C ；三、放掉占发酵液体积百分比为30%的发酵液，再向发酵罐中补入占发酵液体积百分比为30%的发酵培养基后发酵培养24 小时，而后再一次放掉发酵液再补入发酵培养基发酵培养24小时，直至凝乳酶活力低于 158IMCU/ml后放掉全部的发酵液；四、收集步骤三中每次发掉的发酵液和最后放掉的全部 发酵液，即得到了凝乳酶；其中步骤一种子罐使用的培养基、步骤二发酵罐使用的培养基和 步骤二中补入的发酵培养基均按照重量份数比由4份的大豆组织蛋白、5份的玉米粉、0.8 份的Na2HP04、2份的葡萄糖、0. 2份的消泡剂和85 90份的水组成。本实施方式步骤一中的米黑根毛霉可采用MucormieheiCooney&Emerson，该菌从 土壤分离得到的，现可从市场上购买得到。本实施方式步骤一种子罐使用的培养基、步骤二发酵罐使用的培养基和步骤二中 的发酵培养基中使用的消泡剂为消沫剂。
本实施方式中采用的是IOL罐发酵72小时，活力为198IMCU/ml，放掉3000ml发酵 液，补入灭菌的培养基3000ml，继续发酵24小时(连续发酵96小时)后活力为212IMCU/ml， 再放掉3000ml发酵液，补入灭菌的培养基3000ml，继续发酵24小时(连续发酵120小时) 后活力为228IMCU/ml，放掉3000ml发酵液，补入灭菌的培养基3000ml，24小时后(连续发酵 144小时)活力为236IMCU/ml，放掉3000ml发酵液，补入灭菌的培养基3000ml，24小时后 (连续发酵168小时)活力为247IMCU/ml，放掉3000ml发酵液，补入灭菌的培养基3000ml， 发酵24小时后(连续发酵192小时)活力为205IMCU/ml，放掉3000ml发酵液，补入灭菌的 培养基3000ml，发酵24小时后(连续发酵216小时)活力为196IMCU/ml，放掉3000ml发酵 液，补入灭菌的培养基3000ml，发酵24小时后(连续发酵240小时)活力为156IMCU/ml，发 酵活力增长缓慢，凝乳酸产生菌开始老化，产能降低，发酵全部放掉。本批次实验连续发酵 240小时，共放发酵液27000ml，如果为批次发酵放发酵液为18000ml，多增加了 1/3的产量。本实施方式的方法有效的控制了发酵液的排放和补料，保证整个发酵过程中发酵 液中的营养成分破坏少，且整个发酵过程容易控制，本实施方式的发酵生产发酵周期短、发 酵产能高、产量高。
权利要求
半连续发酵生产微生物凝乳酶的方法，其特征在于半连续发酵生产微生物凝乳酶的方法按照以下步骤进行一、米黑根毛霉接种到种子罐中进行种子培养，得到种子发酵液，种子培养温度为35～37℃，米黑根毛霉的接种量为8%～12%，培养时间为20～24小时；二、种子发酵液接种到发酵罐中发酵培养70～74小时得到发酵液，发酵培养温度为38～39℃；三、放掉占发酵液体积百分比为30%～50%的发酵液，再向发酵罐中补入占发酵液体积百分比为30%～50%的发酵培养基后发酵培养22～26小时，而后再一次放掉发酵液再补入发酵培养基发酵培养22～26小时，直至凝乳酶活力低于158 IMCU/ml后放掉全部的发酵液；四、收集步骤三中每次发掉的发酵液和最后放掉的全部发酵液，即得到了凝乳酶；其中步骤一种子罐使用的培养基、步骤二发酵罐使用的培养基和步骤二中的补入的发酵培养基均按照重量份数比由3～5份的大豆组织蛋白、4～6份的玉米粉、0.7～0.9份的Na2HPO4、1～3份的葡萄糖、0.1～0.3份的消泡剂和85～90份的水组成。
2.根据权利要求1所述的半连续发酵生产微生物凝乳酶的方法，其特征在于步骤一中 种子培养温度为36°C，凝乳酸产生菌的接种量为10%，培养时间为22小时。
3.根据权利要求1或2所述的半连续发酵生产微生物凝乳酶的方法，其特征在于步骤 二中培养时间为72小时得到发酵液，发酵培养温度为38. 5°C。
4.根据权利要求3所述的半连续发酵生产微生物凝乳酶的方法，其特征在于步骤三中 每次放掉的发酵液中凝乳酶活力为160 220IMCU/ml。
5.根据权利要求1、2或4所述的半连续发酵生产微生物凝乳酶的方法，其特征在于步 骤一种子罐使用的培养基、步骤二发酵罐使用的培养基和步骤二中补入的发酵培养基均按 照重量份数比由4份的大豆组织蛋白、5份的玉米粉、0. 8份的Na2HP04、2份的葡萄糖、0. 2份 的消泡剂和88份的水组成。
全文摘要
半连续发酵生产微生物凝乳酶的方法，它涉及一种发酵生产凝乳酶的方法。本发明解决了微生物发酵生产发酵周期长、发酵产能低、产量低的问题。方法1.种子培养；2.发酵培养；3.补料培养；4,收集记得到了凝乳酶。本发明的方法有效的控制了发酵液的排放和补料，保证整个发酵过程中发酵液中的营养成分破坏少，且整个发酵过程容易控制，本发明的发酵生产发酵周期短、发酵产能高、产量高。
文档编号C12N9/58GK101870967SQ201010233659
公开日2010年10月27日 申请日期2010年7月22日 优先权日2010年7月22日
发明者张钦革, 王贵元, 郭坤, 马之霄, 黄亦存 申请人:安泰生物工程股份有限公司