专利名称：特异性体外干扰人T细胞中LAT蛋白表达的SiRNA及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及三对特异性体外干扰人T细胞中 LAT (Linkerfor activation of T cell)蛋白表达的SiRNA，另外本发明还涉及此SiRNA的用途。
背景技术：
T 细胞活化衔接蛋白(Linker for the activation of T cells, LAT)是一个分子量大约为36-38kDa，并在TCR发生交联后被迅速磷酸化的蛋白。LAT属于完整的跨膜衔接蛋白，并通过近膜的两个棕榈酰化序列定位于T细胞上富含糖脂的脂筏区域，是T细胞信号转导中ZAP-70的主要作用底物之一，并可招募和活化许多下游信号分子诸如fedS，Grt2 以及PLC- γ 1等，参与TCR介导的信号转导，并在T细胞发育和活化过程中起重要作用。LAT在T细胞信号转导中发挥重要作用的分子机制在于被磷酸化的LAT分子可以招募和结合与T细胞活化信号相关的多个含有SH2基序的胞浆分子，如Gads，Grb2以及 PLC-yl等，这些游离于胞浆中的分子一旦和LAT分子结合后，一方面在空间上可以形成区域化的复合物，同时这些在空间上相互靠近的分子可以进一步相互作用，或者是被磷酸化， 或者可以结合更多的分子，如和LAT结合的PLC-γ 1在结合的同时也被进一步激活，水解胞内PIP2(磷脂酰肌醇二磷酸)产生两种第二信使即DAG和IP3。IP3引发钙离子内流提高胞内的钙离子量，这条通路最终激活转录因子NF-AT，并进而进入细胞核内；DAG则通过 Ras-MAPK途径和PKC途径分别激活转录因子AP-I和NF- κ B,促使其进入细胞核内后，上述三个转录因子通过和IL-2基因的启动子区结合最终导致IL-2的分泌；和磷酸化的LAT分子结合的另一个重要的分子则是胞浆中的衔接蛋白feds，通过(iads可以将TCR信号转导中的另一个关键蛋白SLP-76招募至TCR分子附近，最终介导细胞骨架重组和黏附分子表达的改变等，从而导致T细胞的完全活化。由此可见LAT在T细胞信号转导中的重要性在于作为TCR受到外界抗原信号后发生系列酶学催化反应的早期阶段，LAT分子作为参与的膜分子起着承上启下的作用，并最终将TCR在胞外接受到的刺激信号转化为胞浆内的各个信号转导通路，并进而导致T细胞的活化和分化。尽管目前对TCR受到的抗原信号是如何决定 T细胞活化和分化的命运的分子机制还不甚了解，但是可以推断无论是何种结局，LAT分子在其中发挥着关键作用。LAT在T细胞信号转导中的关键作用在体外细胞系统和小鼠体内系统中都得到印证LAT分子基因敲除的小鼠外周表达⑶3，⑶4，⑶8的α β T或γ δ T细胞均缺失，分析胸腺中胸腺细胞的发育，发现胸腺细胞的发育被阻滞在CD4XD8—阶段，大多数的胸腺细胞被阻滞在⑶25+⑶44-的DN3阶段(在T细胞分化为⑶4+CD8+之前经历了⑶25XD44+-⑶25+CD 44+-CD25+CD4C-CD25XD4C四个阶段)，而DN3阶段正是由LAT参与的preTCR介导的信号对胸腺细胞的发育和选择起关键作用的阶段，而LAT分子的缺失导致preTCR信号的缺失，从而导致胸腺细胞的发育受阻；而在T细胞系细胞株中LAT分子的缺失则直接导致TCR对外界刺激的无应答。鉴于LAT在TCR信号转导中的关键作用，而在自身免疫病或是移植排斥中T细胞应答存在异常增高，如果能够特异性减低或是减少这些病理状态下T细胞中LAT分子的表达，则有望可以降低病理状态下的免疫应答，从而达到缓解疾病的目的。为此，通过建立体外干扰LAT分子表达的方法(如SiRNA)，为进一步研究LAT在T 细胞信号通路中的分子机制和临床应用前景提供了有效的新手段。siRNA 干扰RNA干扰(RNAi)的基本原理是利用具有同源性的双链RNA (dsRNA)迅速阻断序列特异的目标基因的表达活性，是实验室中是一种有效的阻断基因表达的工具。siRNA有如下特点1. SiRNA长度一般在22nt左右，结构上属于双链RNA。2. SiRNA 一般是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干扰的中间产物。3.在作用位置上，siRNA可作用于mRNA的任何部位，并与mRNA完全互补。4.在作用方式上，siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供特异性体外干扰人T细胞中LAT(Linker foractivation of T cell)蛋白表达的 SiRNA。本发明要解决的技术问题之二是提供了上述SiRNA在体外干扰人T细胞的LAT蛋白表达中的应用。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案在本发明的内容之一，是提供一种特异性体外干扰人T细胞中LAT蛋白表达的 SiRNA，选自以下三对SiRNA序列的任意一对序列由编码SEQ ID NO. 1所示序列和编码SEQ ID NO. 2所示序列构成的SiRNAl，由编码SEQ ID N0. 3所示序列和编码SEQID N0. 4所示序列构成的SiRNA2，或者由编码SEQ ID N0. 5所示序列和编码SEQ ID N0. 6所示序列构成的 SiRNA3 (见表1)。本发明通过应用计算机软件设计了以上三对针对LAT蛋白不同位点的特异SiRNA序列(SiRNAl、SiRNA2、SiRNA3)，经公司合成后，通过优化实验条件，在体外特异高效地敲除LAT蛋白。表1 特异性针对LAT蛋白的SiRNA序列
权利要求
1.一种特异性体外干扰人τ细胞中LAT蛋白表达的SiRNA，其特征在于，选自以下三对 SiRNA序列的任意一对序列由编码SEQ ID NO. 1所示序列和编码SEQ ID NO. 2所示序列构成的SiRNAl，由编码SEQ ID NO. 3所示序列和编码SEQ ID NO. 4所示序列构成的SiRNA2， 或者由编码SEQ ID NO. 5所示序列和编码SEQ ID NO. 6所示序列构成的SiRNA3。
2.如权利要求1所述的SiRNA在体外干扰人T细胞的LAT蛋白表达中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种特异性体外干扰人T细胞中LAT蛋白表达的SiRNA，选自以下三对SiRNA序列的任意一对序列由编码SEQ ID NO.1所示序列和编码SEQ ID NO.2所示序列构成的SiRNA1，由编码SEQ ID NO.3所示序列和编码SEQ ID NO.4所示序列构成的SiRNA2，或者由编码SEQ ID NO.5所示序列和编码SEQ ID NO.6所示序列构成的SiRNA3。此外，本发明还公开了上述SiRNA在体外干扰人T细胞的LAT蛋白表达中的应用。本发明的特异性体外干扰人T细胞中LAT蛋白表达的SiRNA能够特异高效地体外敲除人T细胞的LAT蛋白，对LAT蛋白具有明显的干扰效果。
文档编号C12N15/63GK102337262SQ20101023343
公开日2012年2月1日 申请日期2010年7月22日 优先权日2010年7月22日
发明者李昊文, 王颖, 葛海良, 谢国化 申请人:上海市免疫学研究所