专利名称：提高固定化纤维素酶活性的方法
技术领域：
本发明涉及超声波对固定化酶活性的影响，属于生物工程技术领域。
背景技术：
纤维素是由β-1，4_D-吡喃葡萄糖残基组成的纤维状、不可溶的晶体多糖，是组 成植物细胞壁的主要结构物质和地球上最丰富的多聚物。对纤维素加以充分利用可以为人 类解决食品、环境和能源危机提供重要途径。在纤维素酶的作用下，纤维素可以分解成容易 被进一步发酵为乙酸、乳酸和乙醇等的小分子纤维素、纤维寡糖、纤维二糖和葡萄糖。目前纤维素酶解技术已基本成熟。但是在生产过程中，纤维素酶价格高、用量大， 导致生产成本高，阻碍了该技术的转化，因此降低纤维素酶的生产和使用成本成了纤维素 酶解技术产业化的关键。目前针对这个问题也有很多研究，一方面是采用分子生物学技术 选育纤维素酶的高产菌株，另一方面是通过酶固定化技术提高酶的利用率。虽然固定化酶可以重复利用，但是由于部分酶分子被载体包埋，使得固定化酶活 性降低，所以提高固定化酶活性的研究是当今研究的一个热点。超声波在生物工程中提高 生物产量和活性应用研究开始于八十年代后期，近年来已开始应用于酶的研究，并取得了 一些研究成果。目前超声波对酶活影响的研究主要集中在(1)在酶解过程中施加超声波， (2)对底物施加超声进行的预处理，(3)对酶施加超声进行预处理。
发明内容
针对固定化纤维素酶的活性活性较低的不足，本发明的目的是提供一种技术使固 定化纤维素酶的活性增强，为推动纤维素酶解技术的发展提供理论依据。本发明的目的是这样实现的超声波预处理提高固定化纤维素酶活性的方法，包 括如下步骤(1)固定化纤维素酶的制备准确量取壳聚糖与体积分数为2%醋酸溶液，其质量 与体积比为1 100，用玻璃棒不断搅拌，最后溶解成透明胶体溶液，取上述一定量的壳聚 糖胶体溶液，加入质量浓度5% NaOH水溶液，其与胶体溶液的体积比为3 4，得絮凝状物 质，离心得沉淀，水洗沉淀至中性，然后加入体积分数为5 %的戊二醛水溶液，其与胶体溶 液体积比为1 2，室温下用恒温水浴搅拌器搅拌2h，静置过夜，离心弃去上清液，水洗3-4 次，除去残余戊二醛，离心得到交联后的壳聚糖固体；向上述交联后的壳聚糖中加入与壳聚 糖胶体溶液体积比为1 2的3g/mL液态纤维素酶制剂，每隔一定时间搅拌一次，放入冰箱 中于4°C静置过夜，第二天水洗3-4次，除去游离酶，冻干得固定化纤维素酶；(2)超声波预处理固定化纤维素酶采用超声波发生器，其功率为10-80W，频率为 18-29KHZ，作用于固定化纤维素酶，处理5-30min。最后测定预处理后固定化纤维素酶的活性，方法如下将20mg处理过的固定化纤 维素酶加入3mL 0. 51% CMC-Na柠檬酸缓冲液中，反应20min，离心5min，取上清液lmL，加 Λ 0. 2ml 2mol/L的NaOH溶液，再加入0. 6ml 0. 53%的DNS溶液，沸水浴5min,流水冷却，定容到5mL，在540nm波长下测定吸光值，通过标准曲线计算酶的活性。本发明将酶学生物工程技术与超声波技术相结合，较大的提高固定化纤维素酶的 活性。相对于不加超声波预处理的固定化纤维素酶的活性，最大可以提高9. 75%。超声波预处理作为一种有效提高酶的活性的方法，因其简单、安全、方便、快速等 优点，将会在工业产业化的发展中得到广泛的应用。
具体实施例方式本发明所使用的液体纤维素酶是产自诺维信公司，购于无锡市联合恒洲化工有限 公司，酶的原始浓度为300g/mL，其酶活为35. 03901U(1个酶活单位被定义为ImL酶液Imin 水解CMC产生1 μ mol葡萄糖的酶量，以U表示)。对比例(1)固定化纤维素酶的制备准确量取壳聚糖与体积分数为2%醋酸溶液比例为 1 100g/mL，用玻璃棒不断搅拌，最后溶解成透明胶体溶液，取上述一定量的壳聚糖胶体 溶液，加入与胶体溶液的体积比为3 4的质量分数为5%的NaOH溶液，得絮凝状物质，离 心得沉淀，水洗沉淀至中性，然后加入与胶体溶液体积比为1 2的体积分数为5%的戊二 醛水溶液，室温下用恒温水浴搅拌器搅拌2h，静置过夜，离心弃去上清液，水洗3-4次，除去 残余戊二醛，离心得到交联后的壳聚糖固体；向上述交联后的壳聚糖中加入与壳聚糖胶体 溶液体积比为1 2的稀释100倍液态纤维素酶，每隔一定时间搅拌一次，放入冰箱中于 4°C静置过夜，第二天水洗3-4次，除去游离酶，冻干得固定化纤维素酶。(2)测定固定化纤维素酶的活性将20mg固定化纤维素酶加入3mL pH3. 00. 51% CMC-Na柠檬酸缓冲液中，60°C反应20min，离心5min，取上清液lmL，加入0. 2ml 2mol/L的 NaOH溶液，再加入0. 6ml 0. 53 %的DNS溶液，沸水浴5min，流水冷却，定容到5mL，在540nm 波长下测定吸光值，通过标准曲线计算酶的活性为5. 83U。实施例一(1)固定化纤维素酶的制备准确量取壳聚糖与体积分数为2%醋酸溶液比例为 1 100g/mL，用玻璃棒不断搅拌，最后溶解成透明胶体溶液，取上述一定量的壳聚糖胶体 溶液，加入与胶体溶液的体积比为3 4的质量分数为5%的NaOH溶液，得絮凝状物质，离 心得沉淀，水洗沉淀至中性，然后加入与胶体溶液体积比为1 2的体积分数为5%的戊二 醛水溶液，室温下用恒温水浴搅拌器搅拌2h，静置过夜，离心弃去上清液，水洗3-4次，除去 残余戊二醛，离心得到交联后的壳聚糖固体；向上述交联后的壳聚糖中加入与壳聚糖胶体 溶液体积比为1 2的稀释100倍液态纤维素酶，每隔一定时间搅拌一次，放入冰箱中于 4°C静置过夜，第二天水洗3-4次，除去游离酶，冻干得固定化纤维素酶。(2)超声波预处理固定化纤维素酶采用超声波发生器，其功率为30W，频率为 24KHz，作用于固定化纤维素酶，处理lOmin。(3)测定预处理后固定化纤维素酶的活性将20mg处理过的固定化纤维素酶加入 3mLpH3. 00. 51% CMC-Na柠檬酸缓冲液中，60°C反应20min，离心5min，取上清液lmL，加入 0. 2ml 2mol/L的NaOH溶液，再加入0. 6ml 0. 53%的DNS溶液，沸水浴5min，流水冷却，定容 到5mL，在540nm波长下测定吸光值，通过标准曲线计算酶的活性为5. 87U，比不加超声预处 理的酶的活提高了 0.78%。
实施例二 (1)固定化纤维素酶的制备准确量取壳聚糖与体积分数为2%醋酸溶液比例为 1 100g/mL，用玻璃棒不断搅拌，最后溶解成透明胶体溶液，取上述一定量的壳聚糖胶体 溶液，加入与胶体溶液的体积比为3 4的质量分数为5%的NaOH溶液，得絮凝状物质，离 心得沉淀，水洗沉淀至中性，然后加入与胶体溶液体积比为1 2的体积分数为5%的戊二 醛水溶液，室温下用恒温水浴搅拌器搅拌2h，静置过夜，离心弃去上清液，水洗3-4次，除去 残余戊二醛，离心得到交联后的壳聚糖固体；向上述交联后的壳聚糖中加入与壳聚糖胶体 溶液体积比为1 2的稀释100倍液态纤维素酶，每隔一定时间搅拌一次，放入冰箱中于 4°C静置过夜，第二天水洗3-4次，除去游离酶，冻干得固定化纤维素酶。(2)超声波预处理固定化纤维素酶采用超声波发生器，其功率为30W，频率为 18KHz，作用于固定化纤维素酶，处理lOmin。(3)测定预处理后固定化纤维素酶的活性将20mg处理过的固定化纤维素酶加入 3mLpH3. 0 0. 51% CMC-Na柠檬酸缓冲液中，60°C反应20min，离心5min，取上清液lmL，加入 0. 2ml 2mol/L的NaOH溶液，再加入0. 6ml 0. 53%的DNS溶液，沸水浴5min，流水冷却，定容 到5mL，在540nm波长下测定吸光值，通过标准曲线计算酶的活性为5. 72U，与不加超声预处 理的酶的活性相差不大。实施例三(1)固定化纤维素酶的制备准确量取壳聚糖与体积分数为2%醋酸溶液比例为 1 100g/mL，用玻璃棒不断搅拌，最后溶解成透明胶体溶液，取上述一定量的壳聚糖胶体 溶液，加入与胶体溶液的体积比为3 4的质量分数为5%的NaOH溶液，得絮凝状物质，离 心得沉淀，水洗沉淀至中性，然后加入与胶体溶液体积比为1 2的体积分数为5%的戊二 醛水溶液，室温下用恒温水浴搅拌器搅拌2h，静置过夜，离心弃去上清液，水洗3-4次，除去 残余戊二醛，离心得到交联后的壳聚糖固体；向上述交联后的壳聚糖中加入与壳聚糖胶体 溶液体积比为1 2的稀释100倍液态纤维素酶，每隔一定时间搅拌一次，放入冰箱中于 4°C静置过夜，第二天水洗3-4次，除去游离酶，冻干得固定化纤维素酶。(2)超声波预处理固定化纤维素酶采用超声波发生器，其功率为50W，频率为 24KHz，作用于固定化纤维素酶，处理20min。(3)测定预处理后固定化纤维素酶的活性将20mg处理过的固定化纤维素酶加入 3mLpH3. 00. 51% CMC-Na柠檬酸缓冲液中，60°C反应20min，离心5min，取上清液lmL，加入 0. 2ml 2mol/L的NaOH溶液，再加入0. 6ml 0. 53%的DNS溶液，沸水浴5min，流水冷却，定容 到5mL，在540nm波长下测定吸光值，通过标准曲线计算酶的活性为6. 38U，与不加超声预处 理的酶的活性相比提高了 9. 6%。实施例四(1)固定化纤维素酶的制备准确量取壳聚糖与体积分数为2%醋酸溶液比例为 1 100g/mL，用玻璃棒不断搅拌，最后溶解成透明胶体溶液，取上述一定量的壳聚糖胶体 溶液，加入与胶体溶液的体积比为3 4的质量分数为5%的NaOH溶液，得絮凝状物质，离 心得沉淀，水洗沉淀至中性，然后加入与胶体溶液体积比为1 2的体积分数为5%的戊二 醛水溶液，室温下用恒温水浴搅拌器搅拌2h，静置过夜，离心弃去上清液，水洗3-4次，除去 残余戊二醛，离心得到交联后的壳聚糖固体；向上述交联后的壳聚糖中加入与壳聚糖胶体
5溶液体积比为1 2的稀释100倍液态纤维素酶，每隔一定时间搅拌一次，放入冰箱中于 4°C静置过夜，第二天水洗3-4次，除去游离酶，冻干得固定化纤维素酶。(2)超声波预处理固定化纤维素酶采用超声波发生器，其功率为80W，频率为 24KHz，作用于固定化纤维素酶，处理lOmin。(3)测定预处理后固定化纤维素酶的活性将20mg处理过的固定化纤维素酶加入 3mLpH3. 0 0. 51% CMC-Na柠檬酸缓冲液中，60°C反应20min，离心5min，取上清液lmL，加入 0. 2ml 2mol/L的NaOH溶液，再加入0. 6ml 0. 53%的DNS溶液，沸水浴5min，流水冷却，定容 到5mL，在540nm波长下测定吸光值，通过标准曲线计算酶的活性为4. 80U,与不加超声预处 理的酶的活性相比降低了 17.7%。实施例五(1)固定化纤维素酶的制备准确量取壳聚糖与体积分数为2%醋酸溶液比例为 1 100g/mL，用玻璃棒不断搅拌，最后溶解成透明胶体溶液，取上述一定量的壳聚糖胶体 溶液，加入与胶体溶液的体积比为3 4的质量分数为5%的NaOH溶液，得絮凝状物质，离 心得沉淀，水洗沉淀至中性，然后加入与胶体溶液体积比为1 2的体积分数为5%的戊二 醛水溶液，室温下用恒温水浴搅拌器搅拌2h，静置过夜，离心弃去上清液，水洗3-4次，除去 残余戊二醛，离心得到交联后的壳聚糖固体；向上述交联后的壳聚糖中加入与壳聚糖胶体 溶液体积比为1 2的稀释100倍液态纤维素酶，每隔一定时间搅拌一次，放入冰箱中于 4°C静置过夜，第二天水洗3-4次，除去游离酶，冻干得固定化纤维素酶。(2)超声波预处理固定化纤维素酶采用超声波发生器，其功率为30W，频率为 29KHz，作用于固定化纤维素酶，处理lOmin。(3)测定预处理后固定化纤维素酶的活性将20mg处理过的固定化纤维素酶加入 3mLpH3. 0 0. 51% CMC-Na柠檬酸缓冲液中，60°C反应20min，离心5min，取上清液lmL，加入 0. 2ml 2mol/L的NaOH溶液，再加入0. 6ml 0. 53%的DNS溶液，沸水浴5min，流水冷却，定容 到5mL，在540nm波长下测定吸光值，通过标准曲线计算酶的活性为5. 32U，与不加超声预处 理的酶的活性相比降低了 9. 75%。实施例六(1)固定化纤维素酶的制备准确量取壳聚糖与体积分数为2%醋酸溶液比例为 1 100g/mL，用玻璃棒不断搅拌，最后溶解成透明胶体溶液，取上述一定量的壳聚糖胶体 溶液，加入与胶体溶液的体积比为3 4的质量分数为5%的NaOH溶液，得絮凝状物质，离 心得沉淀，水洗沉淀至中性，然后加入与胶体溶液体积比为1 2的体积分数为5%的戊二 醛水溶液，室温下用恒温水浴搅拌器搅拌2h，静置过夜，离心弃去上清液，水洗3-4次，除去 残余戊二醛，离心得到交联后的壳聚糖固体；向上述交联后的壳聚糖中加入与壳聚糖胶体 溶液体积比为1 2的稀释100倍液态纤维素酶，每隔一定时间搅拌一次，放入冰箱中于 4°C静置过夜，第二天水洗3-4次，除去游离酶，冻干得固定化纤维素酶。(2)超声波预处理固定化纤维素酶采用超声波发生器，其功率为30W，频率为 29KHz，作用于固定化纤维素酶，处30min。(3)测定预处理后固定化纤维素酶的活性将20mg处理过的固定化纤维素酶加入 3mLpH3. 0 0. 51% CMC-Na柠檬酸缓冲液中，60°C反应20min，离心5min，取上清液lmL，加入 0. 2ml 2mol/L的NaOH溶液，再加入0. 6ml 0. 53%的DNS溶液，沸水浴5min，流水冷却，定容到5mL，在540nm波长下测定吸光值，通过标准曲线计算酶的活性为5. 57U，与不加超声预处 理的酶的活性相比降低了 4. 46%。
权利要求
超声波预处理提高固定化纤维素酶活性的方法，其特征在于包括如下步骤(1)固定化纤维素酶的制备准确量取壳聚糖与体积分数为2％醋酸溶液，其质量与体积比为1∶100，用玻璃棒不断搅拌，最后溶解成透明胶体溶液，取上述一定量的壳聚糖胶体溶液，加入质量浓度5％NaOH水溶液，其与胶体溶液的体积比为3∶4，得絮凝状物质，离心得沉淀，水洗沉淀至中性，然后加入体积分数为5％的戊二醛水溶液，其与胶体溶液体积比为1∶2，室温下用恒温水浴搅拌器搅拌2h，静置过夜，离心弃去上清液，水洗3 4次，除去残余戊二醛，离心得到交联后的壳聚糖固体；向上述交联后的壳聚糖中加入与壳聚糖胶体溶液体积比为1∶2的3g/mL液态纤维素酶制剂，每隔一定时间搅拌一次，放入冰箱中于4℃静置过夜，第二天水洗3 4次，除去游离酶，冻干得固定化纤维素酶；(2)超声波预处理固定化纤维素酶采用超声波发生器，其功率为10 80W，频率为18 29KHz，作用于固定化纤维素酶，处理5 30min。
全文摘要
本发明超声波提高固定化纤维素酶活性的方法，包括如下步骤(1)固定化纤维素酶的制备准确量取壳聚糖和体积分数为2％醋酸水溶液，溶解成透明胶体溶液，取上述一定量的壳聚糖胶体溶液，加质量浓度5％NaOH水溶液，得絮凝状物质，加入体积分数5％的戊二醛水溶液，得到交联后的壳聚糖；向上述交联后的壳聚糖中加入纤维素酶，第二天水洗3-4次，除去游离酶，冻干得固定化纤维素酶(2)超声波预处理固定化纤维素酶采用超声波发生器，其功率为10-80W，频率为18-29KHz，作用于固定化纤维素酶，处理5-30min。本发明将酶学生物工程技术与超声波技术相结合，较大的提高固定化纤维素酶的活性。
文档编号C12N13/00GK101914517SQ20101024061
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月29日 优先权日2010年7月29日
发明者任晓锋, 张 杰, 江慎华, 王世清, 王振斌, 陈晓寅, 马晓珂, 马海乐 申请人:江苏大学