专利名称：一种制备白杨素的方法
技术领域：
本发明天然产物分离领域，尤其是涉及一种采用酶解方法制备白杨素的方法。
背景技术：
白杨素又称白杨黄素，化学名称5，7_ 二羟基黄酮，淡黄色棱柱形结晶(由甲醇中结晶)，熔点285°C。溶于氢氧化碱溶液，微溶于乙醚、乙醇和氯仿，不溶于水。研究表明白杨素具有抗氧化、抗病毒、抗高血压、降血糖和抑制芳香酶活性的作用，特别受人关注的是其具有肿瘤预防和治疗作用。白杨素的抗肿瘤作用主要包括(1)抗肿瘤细胞增殖；(2)诱导肿瘤细胞凋亡；(3)逆转肿瘤细胞多药耐药作用；(4)抗基因突变作用。现有提取白杨素多是从紫薇科植物木蝴蝶中提取，但是木蝴蝶药材白杨素含量较低。而三叶海棠叶中白杨素苷含量较高，高达5%左右，可以经过水解或酶解成白杨素，原料易得。从三叶海棠叶中提取白杨素，现有工艺是先提取白杨素苷再酸水解得到白杨素。 如文献“HPLC法测定三叶海棠叶中白杨素苷含量”，该文献公开的方法是取三叶海棠叶，加 12倍量的丙酮超声提取3次，每次lh，合并提取液，回收丙酮，其提取物混合聚酰胺后，干法上聚酰胺柱，依次用水，10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、70 %、95 %乙醇洗脱，以TLC跟踪检测，合并相同的馏分，浓缩部分溶剂，析出结晶，结晶再以丙酮进行重结晶，得针状浅黄色结晶，即为白杨索苷。取该结晶适量用6%硫酸加热水解，析晶，丙酮重结晶即得白杨素。酸水解产生较多废酸水，污染较严重。
发明内容
本发明要解决技术问题是提供一种用生物酶解制备白杨素的方法，该方法反应条件温和，对环境污染小。为解决上述问题，本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种制备白杨素的方法，其特征在于包含以下步骤1)取三叶海棠叶粉碎，加酸性水溶液拌湿，加入2_5%。生物酶酶解，制得酶解原料；2)把上述酶解原料加入5-10倍量80-90%乙醇溶液回流提取2_3次，提取液减压回收浓缩至醇浓度20-40%，放置结晶；3)滤出上述结晶物，乙醇溶解聚酰胺拌样，挥干乙醇装柱，乙醇溶液梯度洗脱，薄层检测，收集高浓度流分，减压浓缩，放置结晶，滤出结晶物90-99%乙醇回流溶解结晶，结晶物干燥即得高含量白杨素产品。所述步骤1)中酸性水为pH3-5的盐酸或硫酸水溶液，生物酶可选纤维素酶、淀粉酶和β -葡聚糖苷酶中的一种或几种，添加量为原料的1-2%。，酶解时间24-48小时，酶解温度 35-50°C。
所述步骤3)中乙醇梯度洗脱为4-6BV40-50%乙醇一70%乙醇。本发明优势在于采用三叶海棠叶，白杨素苷含量高，原料便宜易得；生物酶解反应温和，而且酶解后原料更易提取，不产生更多废液酸水，提取过的原料更易降解；整个工艺未使用毒性有机试剂，所得产品符合药品生产要求。下面将结合具体实施方式
进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
具体实施例方式实施例1 取干燥的三叶海棠叶粉碎，称量1kg，加适量pH3盐酸水溶液拌湿，再加入2g β -葡聚糖苷酶拌勻，保温酶解原料35小时，温度控制35-50°C。酶解原料加入10kg90%乙醇溶液回流提取2次，每次1小时，合并提取液减压浓缩至醇浓度40%，放置结晶，过滤得粗结晶物95g。把粗结晶物用90%乙醇回流溶解，取20g聚酰胺拌样，挥干乙醇，与200g聚酰胺装柱，取1L50 %乙醇溶液洗脱杂质，再取70%乙醇溶液洗脱有效成分，薄层检测，收集白杨素高浓度流分，减压浓缩至醇浓度30%，放置结晶，滤出结晶物用99%乙醇回流溶解，浓缩至1/2体积放置结晶，结晶物滤出干燥，得白杨素产品18. 2g，含量95. 6% (HPLC检测)。实施例2:取干燥的三叶海棠叶粉碎，称量1kg，加适量pH5盐酸水溶液拌湿，再加入5g纤维素酶拌勻，保温酶解原料40小时，温度控制35-50°C。酶解原料加入^igSOW乙醇溶液回流提取3次，每次1小时，合并提取液减压浓缩至醇浓度30%，放置结晶，过滤得粗结晶物 102g。把粗结晶物用90%乙醇回流溶解，取30g聚酰胺拌样，挥干乙醇，与200g聚酰胺装柱，取1. 2L40%乙醇溶液洗脱杂质，再取70%乙醇溶液洗脱有效成分，薄层检测，收集白杨素高浓度流分，减压浓缩至醇浓度30%，放置结晶，滤出结晶物用90 %乙醇回流溶解，浓缩至1/2体积放置结晶，结晶物滤出干燥，得白杨素产品16. 3g，含量97. 2% (HPLC检测)。实施例3 取干燥的三叶海棠叶粉碎，称量1kg，加适量pH4硫酸水溶液拌湿，再加入4g淀粉酶拌勻，保温酶解原料40小时，温度控制35-50°C。酶解原料加入^gSO%乙醇溶液回流提取2次，每次1小时，合并提取液减压浓缩至醇浓度30%，放置结晶，过滤得粗结晶物92g。 把粗结晶物用99 %乙醇回流溶解，取20g聚酰胺拌样，挥干乙醇，与^Og聚酰胺装柱，取 1L50%乙醇溶液洗脱杂质，再取70%乙醇溶液洗脱有效成分，薄层检测，收集白杨素高浓度流分，减压浓缩至醇浓度40%，放置结晶，滤出结晶物用90 %乙醇回流溶解，浓缩至3/4体积放置结晶，结晶物滤出干燥，得白杨素产品17. lg，含量95.4% (HPLC检测)。实施例4 取干燥的三叶海棠叶粉碎，称量^g，加适量pH4硫酸水溶液拌湿，再加入IOg纤维素酶和5gi3 -葡聚糖苷酶拌勻，保温酶解原料40小时，温度控制35-50°C。酶解原料加入乙醇溶液回流提取2次，每次1小时，合并提取液减压浓缩至醇浓度40%，放置结晶，过滤得粗结晶物495g。把粗结晶物用99%乙醇回流溶解，取150g聚酰胺拌样，挥干乙醇，与Ikg聚酰胺装柱，取6L40%乙醇溶液洗脱杂质，再取70%乙醇溶液洗脱有效成分， 薄层检测，收集白杨素高浓度流分，减压浓缩至醇浓度30%，放置结晶，滤出结晶物用95%乙醇回流溶解，浓缩至3/4体积放置结晶，结晶物滤出干燥，得白杨素产品84g，含量94. 8% (HPLC 检测)。实施例5 取干燥的三叶海棠叶粉碎，称量10kg，加适量pH4硫酸水溶液拌湿，再加入30g淀粉酶和10gi3-葡聚糖苷酶拌勻，保温酶解原料35小时，温度控制35-50°C。酶解原料加入 10kg90%乙醇溶液回流提取3次，每次1小时，合并提取液减压浓缩至醇浓度30%，放置结晶，过滤得粗结晶物1023g。把粗结晶物用99%乙醇回流溶解，取300g聚酰胺拌样，挥干乙醇，与2kg聚酰胺装柱，取10L40%乙醇溶液洗脱杂质，再取70%乙醇溶液洗脱有效成分，薄层检测，收集白杨素高浓度流分，减压浓缩至醇浓度20%，放置结晶，滤出结晶物用95 %乙醇回流溶解，浓缩至3/4体积放置结晶，结晶物滤出干燥，得白杨素产品172g，含量95. 1% (HPLC 检测)。
权利要求
1.一种制备白杨素的方法，其特征在于包含以下步骤1)取三叶海棠叶粉碎，加酸性水溶液拌湿，加入2-5%。生物酶酶解，制得酶解原料；2)把上述酶解原料加入5-10倍量80-90%乙醇溶液回流提取2-3次，提取液减压回收浓缩至醇浓度20-40%，放置结晶；3)滤出上述结晶物，乙醇溶解聚酰胺拌样，挥干乙醇装柱，乙醇溶液梯度洗脱，薄层检测，收集高浓度流分，减压浓缩，放置结晶，滤出结晶物90-99%乙醇回流溶解结晶，结晶物干燥即得高含量白杨素产品。
2.如权利要求1所述从制备白杨素的方法，其特征在于所述步骤1)中酸性水为PH3-5 的盐酸或硫酸水溶液，生物酶可选纤维素酶、淀粉酶和β -葡聚糖苷酶中的一种或几种，添加量为原料的1-2%。，酶解时间Μ-48小时，酶解温度35-50°C。
3.如权利要求1所述从制备白杨素的方法，其特征在于所述步骤幻中乙醇梯度洗脱为 4-6BV40-50% 乙醇—70% 乙醇。
全文摘要
本发明涉及了一种制备白杨素的方法，本方法采用生物酶酶解，污染程度低，产品收率高，包括以下步骤取三叶海棠叶粉碎，加酸性水溶液拌湿，加入2-5‰生物酶酶解，酶解原料再加入5-10倍量80-90％乙醇溶液回流提取2-3次，提取液减压回收乙醇至醇浓度20-40％，放置结晶，结晶物用乙醇溶解与聚酰胺拌样，装柱，乙醇溶液梯度洗脱，薄层检测，收集高浓度流分，减压浓缩，放置结晶，滤出结晶物用90-99％乙醇回流溶解结晶，结晶物干燥即得高含量白杨素产品。本方法操作简单，适合工业化生产。
文档编号C12P17/06GK102465158SQ20101054981
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月19日 优先权日2010年11月19日
发明者刘东锋, 李法庆, 杨成东 申请人:苏州宝泽堂医药科技有限公司