专利名称：哺乳动物细胞染色体中期相标本的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种哺乳动物细胞染色体标本的制备方法，具体涉及一种哺乳动物细胞染色体中期相标本的制备方法。
背景技术：
在新药研发、保健品评价和辐射安全研究中，哺乳动物细胞染色体畸变观察是遗传学毒性评价中重要的内容。在染色体畸变评价中，染色体中期相标本制备是非常关键的环节，染色体分散的好坏对实验质量具有重要的意义，进而影响评价的可靠性。分散不足的中期染色体之间易于交叉、重叠，导致在分析染色单体及染色体的断裂、缺失以及互换时， 难以做出准确判断。如何获得形态良好的中期染色体，一直是许多新药安全性评价遗传实验室面临的难题。实际工作中发现标本制备过程中染色体分散易受外界环境影响，由于没有统一的标准，致使各实验室染色体中期相标本质量不同，不同实验室之间结果的可比性差。温度和湿度对染色体滴片后的展开的影响是显而易见的。在滴片过程中，染色体依靠吸收外界水分迅速铺散，因此外环境的湿度是非常关键的因素。由于温度会对滴片的干燥时间产生影响，所以也在一定程度上影响到分散效果。由于我国幅员辽阔，一年四季气候条件差异显著，各地试验室温度、湿度等相差很大，单单凭借外部自然环境，难以达到染色体制备时的适宜条件，也就难以保证评价体系的稳定。因此，通过相关措施创造一个相对稳定的局部环境，对制备良好标本是很有帮助的。通过对外部环境的优化控制将显著降低人为因素的影响，保证了染色体中期相制备的可靠及稳定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种哺乳动物细胞染色体中期相标本的制备方法，以得到中期染色体质量、形态和分散度良好、易于进行染色体评价的染色体中期相标本。本发明的技术方案如下一种哺乳动物细胞染色体中期相标本的制备方法，该制备方法包括以下步骤在 20 30°C的温度和45 50%的相对湿度下将哺乳动物细胞悬浮液滴加到载玻片上。优选地，在25°C的温度和50%的相对湿度下将哺乳动物细胞悬浮液滴加到载玻片上。在上述制备方法中，优选地，哺乳动物细胞悬浮液滴加高度为距载玻片15 25cm，优选20cm。优选地，哺乳动物细胞悬浮液滴加时，载玻片与水平面成15°角。优选地， 哺乳动物细胞悬浮液的滴加量为每载玻片10 μ L。在上述制备方法中，哺乳动物细胞悬浮液的制备方法可以包括以下步骤(1)将培养至指数生长期的哺乳动物细胞用秋水仙素处理；(2)以体积比为甲醇冰醋酸=3 1的固定液固定哺乳动物细胞。具体而言，上述哺乳动物细胞悬浮液的制备方法包括以下步骤(1)将培养至指数生长期的哺乳动物细胞用0. 25% (g/100ml)胰蛋白酶水溶液消化制得每毫升包含3 5X IO4个细胞的细胞悬浮液，并培养21小时；(2)加秋水仙素处理M小时，秋水仙素的浓度为每毫升细胞悬浮液15 μ g确认；(3)弃去培养基，用0. 25% (g/100ml)胰蛋白酶水溶液消化哺乳动物细胞并离心， 优选在IOOOrpm下离心10分钟；(4)弃去上清，加入0. 075mol/L的KCl水溶液37°C下静置20分钟；(5)再加入体积比为甲醇冰醋酸=3 1的固定液，吹打细胞混勻后离心，优选在IOOOrpm下离心10分钟；(6)弃去上清，再加入体积比为甲醇冰醋酸=3 1的固定液，37°C下静置20分钟后离心。优选地，步骤(6)反复进行3次。在上述制备方法，优选地，哺乳动物细胞悬浮液滴加到载玻片后自然干燥，再用 10% (1份姬姆萨原液9份缓冲液)姬姆萨染液染色。本发明还提供了根据上述制备方法制备的哺乳动物细胞染色体中期相标本。以下是本发明的详细描述1.细胞准备复苏哺乳动物细胞，获取足量所需细胞，加入适量培养基，培养至指数生长期。用0.25% (g/100ml)的胰蛋白酶水溶液消化传代细胞，制备成3 5X IO4细胞/ mL细胞悬液，培养21小时，加入秋水仙素(浓度15 μ g/mL细胞悬液)，培养至M小时倒掉培养基，收获细胞。2.细胞固定用0. 25% (g/100ml)的胰蛋白酶水溶液消化细胞后，移至15mL离心管，IOOOrpm 离心10分钟，弃去上清液。离心管中加入0. 075mol/L的KCl水溶液5mL，低渗20分钟(37°C )。之后每管再加入0. 5mL固定液(体积比甲醇冰醋酸=3 1)，用吸管轻轻吹打，混勻后IOOOrpm离心10分钟，去上清液。再向离心管中加入固定液(体积比甲醇冰醋酸=3 l)5mL，混勻后37°C下固定20分钟，离心，去上清液，上述步骤再反复操作2次，完成染色体固定。3.染色体制备最后一次固定后离心，将上层液大部分倒掉，仅剩下约0. 5mL上层固定液。用滴管吹打细胞沉淀物，使成均勻细胞悬浮液。控制滴片时环境温度范围为20 30°C以及环境相对湿度范围为45 55%。加样器距载玻片15 25cm处滴下，使细胞均勻分散在玻片上，自然晾干。载玻片与水平面角度15°。样本滴片体积10 μ L/载玻片。4.染色体染色载玻片置于10%姬姆萨染液中染色15分钟。取出玻片标本后先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗至无浮色，置空气中自然干燥。染色体制备具有非常关键的意义，也是本发明的技术方案的重点。本发明经研究发现，滴片时的温度和相对湿度对于干燥时间的控制至关重要，对是否能得到好的染色体分散度有很大影响。具体来说，染色体的分散依赖于中期相染色体干燥的速度，干燥速度太快，细胞达不到最优的直径，形成紧密的中期相，导致染色体之间相互折叠；与之相反，如果干燥速度太慢，将引起两种结果，一是细胞膜破裂，染色体移出，二是细胞膜不破裂，染色体在细胞内交织。因此，对染色体干燥速度的优化便非常关键，对滴片时的外部环境温度、相对湿度进行控制进而控制干燥时间，将有利于得到好的染色体分散度。同时，滴片高度、载玻片与水平面夹角及滴片体积也会对染色体分散产生一定影响。因此，本发明重点在筛选和优化外环境温度和湿度的基础上，进一步优化其他相关参数，以达到制备分散良好染色体中期相标本的目的。本发明的技术方案相对于已有技术的有益效果如下首先，控制滴片时环境温度范围为20 30°C。设定温度为20 30°C的原因在于需要足够的时间以吸收足够的水分，以满足染色体蔓延时固定剂的蒸发。本发明实验表明，温度高于30°C时，固定液干燥快，染色体不会充分蔓延；温度低于20°C，固定液干燥慢， 将引起两种结果，一是细胞膜破裂，染色体移出，会造成染色体丢失。二是细胞膜不破裂，染色体在细胞内交织，无法观察染色体中期相。同时，控制滴片时环境相对湿度范围为45 55%。在评估中期染色体分散时，环境湿度对载玻片干燥时间也是一个干扰因素，因为环境湿度高意味着相同的细胞悬液在相同的温度下，固定剂含水量减少缓慢，造成需要较长的干燥时间。在相对湿度高于55%时，染色体质量差。在相对湿度为低于45%时，中期染色体分散面积小，且染色体重叠多。其次，本发明实验表明，加样器距载玻片20cm处滴下使得细胞均勻分散在在玻片上，有利于自然晾干。第三，载玻片与水平面角度为15°。15°夹角使细胞悬液沿着载玻片倾斜向下，在染色体中期相制备中利于细胞分散蔓延。第四，样本滴片体积为10 μ L/载玻片。样本滴片体积多于10 μ L，延长其干燥分散时间，造成染色体重叠。第五，本发明的哺乳动物染色体中期相标本的制备方法可以用于检测药物对于哺乳动物细胞的影响，可以将不同浓度的药物与哺乳动物细胞共同培养，然后采用本发明的方法制备染色体中期相，通过进行染色体畸变观察可以就药物对于哺乳动物细胞的影响进行评价，进而获得关于药物安全性等方面的信息。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中图1显示采用实施例1的制备方法制备的染色体中期相标本中的染色体；图2显示温度高于30°C、相对湿度大于55%时制备的染色体中期相标本中的染色体；图3显示温度低于20°C、相对湿度低于45%且载玻片水平放置时制备的染色体中期相标本中的染色体。
具体实施例方式下面通过具体实施例来详细说明本发明，但本发明的范围不受这些实施例的限制。实施例1哺乳动物细胞以CHL细胞(中国仓鼠肺成纤维细胞，购自上海细胞所)为例。CHL细胞培养条件含10 15% (10 15ml血清/100ml RPMI1640培养液)胎牛血清的 RPMI1640培养液，37°C、5% CO2培养箱培养。复苏CHL细胞，用0. 25% (g/100ml)的胰蛋白酶水溶液消化传代细胞，制备成3 5 X IO4细胞/mL细胞悬液，每一个50mL培养瓶中加入2mL细胞悬液和SmL新鲜培养基，在 37°C下、5% CO2培养箱中培养2天，更换培养液，继续培养。培养21小时，加入秋水仙素 0. 2mL (浓度15 μ g/mL)，培养至M小时倒掉培养基，收获细胞。用0. 25% (g/100ml)胰蛋白酶水溶液消化细胞后，移至15mL离心管，IOOOrpm离心10分钟，去上清液，加入0. 075mol/L的KCl水溶液5mL,低渗20分钟(37°C )。每管加入固定液(体积比甲醇冰醋酸=3 1)0. 5mL，进行预固定，IOOOrpm离心10分钟，去上清液；向离心管中加入固定液5mL，混勻后37°C条件下固定20分钟，离心，弃去上清液，此步骤再反复操作2次。最后一次固定后，离心，将上层液大部分倒掉，仅剩下约0. 5mL上层液。用滴管吹打细胞沉淀物，使成均勻细胞悬浮液。调节滴片时环境温度为25°C，滴片时环境相对湿度为 50%，放置载玻片，与水平面夹角为15°，用加样器吸取细胞悬液，样本体积为10 μ L。加样器距载玻片20cm处滴下，使细胞均勻分散在玻片上，自然晾干。载玻片置于10% (1份姬姆萨原液9份缓冲液)姬姆萨染液中染色15分钟。取出载玻片标本后先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗至无浮色。进行读片观察。实施例2哺乳动物细胞以人外周血淋巴细胞为例。CHL细胞培养条件含10 20% (10 20ml血清/IOOmlRPMI 1640培养液)胎牛血清的RPMI1640培养液，37°C、5% CO2培养箱培养。抽取健康志愿者静脉血，抗凝分离淋巴细胞，每一个50mL培养瓶中加入ImL淋巴细胞悬液和9mL新鲜培养基，在37°C下、5% CO2培养箱中培养64小时，加入秋水仙素 0. 2mL (浓度15 μ g/mL)，培养至68小时倒掉培养基，收获细胞。细胞培养液移至15mL离心管，IOOOrpm离心10分钟，去上清液，加入0. 075mol/ L的KCl水溶液5mL，低渗20分钟(37°C)。每管加入固定液(体积比甲醇冰醋酸= 3 1)0. 5mL，进行预固定，IOOOrpm离心10分钟，去上清液；向离心管中加入固定液5mL，混勻后37°C条件下固定20分钟，离心，弃去上清液，此步骤再反复操作2次。最后一次固定后，离心，将上层液大部分倒掉，仅剩下约0. 5mL上层液。用滴管吹打细胞沉淀物，使成均勻细胞悬浮液。调节滴片时环境温度为20 30°C，滴片时环境相对湿度为45 55%，放置载玻片，与水平面夹角为15°，用加样器吸取细胞悬液，样本体积为 IOuL0加样器距载玻片15 25cm处滴下，使细胞均勻分散在玻片上，自然晾干。载玻片置于10% (1份姬姆萨原液9份缓冲液)姬姆萨染液中染色15分钟。取出载玻片标本后先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗至无浮色。进行读片观察。
权利要求
1.一种哺乳动物细胞染色体中期相标本的制备方法，该制备方法包括以下步骤在 20 30°C的温度和45 50%的相对湿度下将哺乳动物细胞悬浮液滴加到载玻片上。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在25°C的温度和50%的相对湿度下将哺乳动物细胞悬浮液滴加到载玻片上。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞悬浮液滴加高度为距载玻片15 25cm，优选20cm。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞悬浮液滴加时，载玻片与水平面成15°角。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞悬浮液的滴加量为每载玻片10 μ L。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞悬浮液的制备方法包括以下步骤(1)将培养至指数生长期的哺乳动物细胞用秋水仙素处理；(2)以体积比为甲醇冰醋酸=3 1的固定液固定哺乳动物细胞。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞悬浮液的制备方法包括以下步骤(1)将培养至指数生长期的哺乳动物细胞用0.25% W/V胰蛋白酶水溶液消化制得每毫升包含3 5Χ IO4个细胞的细胞悬浮液，并培养21小时；(2)加秋水仙素处理M小时，秋水仙素的浓度为每毫升细胞悬浮液15μ g ；(3)弃去培养基，用0.25% W/V胰蛋白酶水溶液消化哺乳动物细胞并离心，优选在 IOOOrpm下离心10分钟；(4)弃去上清，加入0.075mol/L的KCl水溶液37°C下静置20分钟；(5)再加入体积比为甲醇冰醋酸=3 1的固定液，吹打细胞混勻后离心，优选在 IOOOrpm下离心10分钟；(6)弃去上清，再加入体积比为甲醇冰醋酸=3 1的固定液，37°C下静置20分钟后离心。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)反复进行3次。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞悬浮液滴加到载玻片后自然干燥，再用10% V/V姬姆萨染液染色。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的制备方法制备的哺乳动物细胞染色体中期相标本。
全文摘要
本发明提供一种哺乳动物细胞染色体中期相标本的制备方法，该制备方法包括以下步骤在20～30℃的温度和45～50％的相对湿度下将哺乳动物细胞悬浮液滴加到载玻片上。该制备方法得到中期染色体质量、形态和分散度良好、易于进行染色体评价的染色体中期相标本。
文档编号C12Q1/02GK102465168SQ20101056034
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月18日 优先权日2010年11月18日
发明者傅鹏, 姜凌, 张建军, 王建君, 申秀萍 申请人:天津市新药安全评价研究中心, 天津药物研究院