制备同多糖的方法

专利名称：制备同多糖的方法
制备同多糖的方法本发明涉及通过在水性培养基中发酵将该葡聚糖分泌进入发酵肉汤中的真菌菌株，使用非对称过滤膜实现从发酵肉汤分离葡聚糖制备具有3 -1,3-糖苷连接的主链和与其具有￠-1,6-糖苷键的侧基的葡聚糖的水溶液的方法。在天然矿物油沉积物中，矿物油存在于多孔储油岩的空腔中，所述储油岩被不可渗透的覆盖层隔绝于地球表面。空腔可为非常细的空腔、毛细管、孔等。细的孔颈能够具有例如仅约Ium的直径。除了矿物油外，包括天然气部分，沉积物包含具有较高或较低的盐含量的水。在矿物油生产中，初级、次级和三级生产有差异。在初级生产中，在将井沉入沉积物中之后，由于沉积物自生的压力，矿物油自己通 过井流到表面。然而，取决于沉积物类型，一般地通过初级生产仅能够提取从约5至10%的存在于沉积物中的矿物油量，在此之后自生的压力不再足够提取。因此在初级生产后使用次级生产。在次级生产中，除了用作矿物油生产的井，所谓的生产井之外，向具有矿物油的地层内钻另外的井。通过这些所谓的注入井迫使水和/或蒸汽进入沉积物中以维持或再次增加压力。通过迫入水，迫使矿物油从注入井开始，朝生产井的方向缓慢通过地层中的空腔。然而，仅当空腔完全被油填充并且水推动它前面的更加粘性的油时这才起作用。只要低粘度的水穿透过空腔，它从此时起沿着最小阻力的路径，即通过注入井和生产井之间获得的通道流动，并不再推动它前面的油。通常，通过初级和次级生产仅能够提取从约30至35%的存在于沉积物中的矿物油量。已知通过三级油生产方法能够进一步增加矿物油产量。三级矿物油生产包括在其中使用适当的化学制品作为油生产助剂的方法。这些包括所谓的“聚合物溢流(polymerflooding) ”。在聚合物溢流中，迫使具有稠化作用的聚合物的水溶液代替水通过注入井进入矿物油沉积物中。通过迫入聚合物溶液，迫使矿物油从注入井开始，朝生产井的方向通过地层中的所述空腔，并且最终经过生产井提取矿物油。由于适应矿物油粘度的聚合物溶液的高粘度，聚合物溶液能够不再，或者至少不如此容易地，如使用纯水的情况中冲破空腔。已经为聚合物溢流提出了多种不同的水溶性聚合物，即合成的聚合物比如，例如，聚丙烯酰胺或包含丙烯酰胺和其他单体的共聚物和天然来源的水溶性聚合物。对于三级矿物油生产的适当的稠化聚合物必须符合多种特别的要求。除了足够的粘度之外，聚合物必须也是非常热稳定的并且即使在高盐浓度时保持它们的稠化作用。用于聚合物溢流的天然来源的聚合物的重要类包含从葡萄糖获得的支化同多糖。包含葡萄糖单元的多糖也被称为葡聚糖。所述支化同多糖具有￠-1, 3-连接的葡萄糖单元的主链，根据统计学其大约每3个单元具有与另外的葡萄糖单元的￠-1,6-糖苷键。此类支化同多糖的水溶液具有有利的物理化学性质，如此使得它们特别适合于聚合物溢流。所述结构的同多糖由多种真菌菌株，例如由担子菌纲裂裙菌(Schizophyllumcommune)分泌，其表现丝状生长并且，在生长期间，分泌具有从约5至约25 106g/mol的典型的分子量1的所述结构的同多糖(俗名裂裥菌素)。可另外提及由齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)分泌的所述结构的同多糖(俗名小核菌葡聚糖)。
对于聚合物溢流重要的是，为此目的使用的水性聚合物溶液根本不包含凝胶颗粒或其他小颗粒。即使少量的具有微米范围尺寸的颗粒可阻塞矿物油地层中的细孔并因此至少使得矿物油生产复杂化或甚至停止。因此用于三级矿物油生产的聚合物应当具有尽可能小比例的凝胶颗粒或其他小颗粒。为了用于聚合物溢流，因而所述同多糖的溶液基本没有细胞和细胞碎片是重要的，因为否则这些阻塞矿物油地层，这使得矿物油的提取复杂化或者甚至使之成为不可能的。所谓的微孔过滤比率(MPFR值)能够被用作聚合物溶液的良好品质的特征。本文确定在过滤溶液期间过滤器阻力在时间过程中的变化方式。制备包含￠-1, 3-连接的葡萄糖单元的支化同多糖的方法是已知的。EP 271907A2、EP 504673A1和DE 4012238A1公开了制备方法，即制备是通过真菌裂褶菌的分批发酵以及搅拌和通气实现的。培养基基本包含葡萄糖、酵母提取物、磷酸二氢钾、硫酸镁和水。EP 271907A2描述了离析多糖的方法，其中首先离心培养物悬液并用异丙醇从上清液沉淀多糖。第二种方法包括压力过滤，随后超滤获得的溶液，没有公开方法的细 节。“Udo Rau, ^Biosynthese, Produktion und Eigenschaften vonextrazelllllaren Pilz-Glucanen，，，Habilitationsschrift, Technical University ofBrunswick, 1997，第70至95页”，描述了通过连续或分批发酵制备裂裥菌素。通过交叉流动过滤能够将裂裥菌素分离开(在上述引文中，第75页)。为了分离开细胞块，测试具有0. 5iim、2iim、10iim和20 y m的孔直径的多种不锈钢膜。然而,使用2iim膜,用包含0. 5g/I的葡聚糖和0. 5g/l的干生物质的溶液仅获得小的渗透速率。此外，浓度约0. lg/ml的菌丝碎片保留。因此提出第二个超精细澄清步骤(在上述引文中，第94页)。此类方法非常复杂并且此外不锈钢膜非常昂贵。" U do Rau, Biopolymers, A. Steinbiichel 编，第 6 卷，第 63 页至第 79 页，WILEY-VCH Publishers, New York，2002"描述了通过连续或分批发酵制备小核菌葡聚糖。对于回收没有细胞和细胞碎片的小核菌葡聚糖推荐离心和交叉流动微量过滤(在上述引文中，第78页，第10. I节)。对于交叉流动微量过滤，此处提出使用具有10 y m的孔大小的烧结的不锈钢膜。然而如此获得的渗透物必须通过渗滤再次纯化并且，如果是必要的，通过交叉流动微量过滤进一步纯化(在上述引文中，第78页，第10.2节)。此类方法非常复杂并且此外不锈钢膜非常昂贵。“GIT Fachzeitung Labor 12/92，第 1233-1238 页”描述了用细胞再循环的支化￠-1,3-葡聚糖的连续制备。首先，提出通过具有200 u m孔大小的不锈钢膜的交叉流动过滤用于从发酵循环分离支化3-1，3-葡聚糖。然而，获得的含有聚合物的渗透物仍然被大量细胞碎片污染并必须随后在第二步中纯化。为此目的提出使用玻璃纤维厚层(deep-bed)过滤器的厚层过滤、三阶段压力过滤和离心。作为第二纯化阶段的另外的方法，作者未成功地研究陶瓷膜的交叉流动过滤。作为他们实验的结果，他们得出结论交叉流动微量过滤不适合于含有菌丝体、高粘度的培养物悬液的细胞分离。通过渗滤最终随后在第三纯化阶段纯化获得的渗透物。然而，此类三阶段方法非常复杂并因此不适合于工业生产方法。WO 03/016545A2公开了使用齐整小核菌制备小核菌葡聚糖的连续的方法。对于纯化，描述了使用具有20 U m孔大小的不锈钢过滤器和至少7m/s的跨膜流动速度的交叉流动过滤。然而，20 过滤器不足以分离开非常小的颗粒。诚然原则上通过使用更细的过滤膜能够改善细颗粒的移除。然而，随着孔大小降低，过滤膜也以不期望的方式渐增地滞留葡聚糖，特别地具有非常高分子量的部分。此外，更细的膜需要更高的过滤器压力并且真菌可能受过量的机械负载的危险因此增加。旨在避免细胞的破坏和裂解，因为将因此污染待制备的聚合物。此外，出于经济的原因，获得的水性葡聚糖溶液的浓度应当尽可能的高，即首先能够使用尽可能小的发酵设备并且其次保证尽量少的将水性葡聚糖溶液从生产点运输至使用地的运输工作。出于经济原因，应当争取至少3g/l的葡聚糖的浓度。具有如此高浓度的葡聚糖溶液具有非常高的粘度并且此外具有高的结构粘度。此类溶液难以过滤。浓度越高，过滤步骤越困难。本发明的目标是为制备支化￠-1,3-葡聚糖溶液提供经济的方法，其中溶液应当具有足以在三级矿物油生产中使用的品质。除了高的比粘度之外，溶液应当特别地具有尽 可能低的细胞和细胞碎片含量。用1.2iim Isopore过滤器,滤液应当达到过滤性规格值MPFR < 2. 5。因此，发现制备具有￠-1, 3-糖苷连接的主链和与其具有￠-1,6-糖苷键的侧基的葡聚糖的水溶液的方法，方法包括在水性培养基中发酵分泌所述结构的葡聚糖的真菌菌株，和随后通过交叉流动微量过滤从包含葡聚糖和生物质的水性发酵肉汤分离获得的葡聚糖的水溶液，非对称过滤膜包含至少一层支持材料和至少一层用于交叉流动微量过滤的分离层，分离层的孔大小为从I y m至10 ii m并且支持材料的孔大小为从5 ii m至100 u m,条件是分离层的孔大小比支持材料的孔大小大至少I U m,并且交叉流动的流动速度为从0. 2m/s至20m/s并且跨膜压力为从0. I至10巴。附图
列表图I :优选的过滤装置的原理2 :用于实验和比较性实验的装置的原理图。下文可特别针对本发明陈述“葡聚糖”被本领域技术人员理解为意为仅由葡萄糖单元组成的同多糖。通过根据本发明的方法，制备特别类的葡聚糖，并且特别地包含￠-1, 3-糖苷连接的葡萄糖单元的主链和与其具有￠-1,6-糖苷键并且包含葡萄糖单元的侧基的那些葡聚糖。优选地，侧基由单个￠-1,6-糖苷连接的葡萄糖单元组成，其中-根据统计学-主链的每三个单元具有与另外的葡萄糖单元的￠-1,6-糖苷键。本领域技术人员知晓分泌葡聚糖的此类真菌菌株。实例包含裂褶菌、齐整小核菌、Sclerotium glucanicum、仁果丛梗抱(Monilinia fructigena)、香 (Lentinula edodes)或灰葡萄孢(Botrytis cinera)。例如在 EP 271907A2和EP 504673A1中，在每篇的权利要求I中还提及适当的真菌菌株。优选地，使用的真菌菌株是裂褶菌或齐整小核菌，并且特别优选地是分泌葡聚糖的裂褶菌，在所述葡聚糖中在包含3-1，3-糖苷连接的葡萄糖单元的主链上，根据统计学，主链的每三个单元具有与另外的葡萄糖单元的￠-1,6-糖苷键；即，优选地葡聚糖是所谓的裂裥菌素。典型的裂裥菌素具有从约5至约25 106g/mol的重量平均分子量Mw。在方法的第一个步骤，在适当的水性培养基中发酵真菌。在发酵过程中，真菌在水性发酵肉汤中分泌前述类的葡聚糖。原则上本领域技术人员知晓此类真菌菌株的发酵方法，例如从EP 271907A2、EP 504673AU DE 4012238AU WO 03/016545A2 和 “Udo Rau/^Biosynthese, Produktionund Eigenschaften von extrazelllllMreil Pilz-Glucanen”，Habilitationsschrift, Technical U niversity ot Brunswick, 1997”,每篇也提及适当的培养基。根据本发明，例如在水性培养基中，在从15°C至40°C，优选地从25°C至30°C和，例如在27°C的温度，优选地在通气和流动下(例如使用搅拌器)，能够培养真菌。在根据本发明的方法中，优选地应当以在待过滤的发酵肉汤中的待制备的葡聚糖浓度为至少3g/l的方式进行发酵。原则上上限不受限制。其取决于在每种情况中使用的发酵装置仍然能够应对的粘度。·最后，通过交叉流动微量过滤从包含溶解的葡聚糖和生物质(有或没有细胞组分的真菌细胞)的发酵肉汤分离包含葡聚糖的水溶液，其中生物质具有比先前更高的浓度的水性发酵肉汤剩余。在方法的实施方案中，在发酵容器中实施发酵并且根据本发明使用非对称过滤膜在发酵后过滤发酵罐的内容物。在本发明的另一个实施方案中，在包含至少一个发酵容器的适当的装置内实施发酵。经过旁流(side stream)从装置连续或间或移除发酵肉汤并且通过交叉流动微量过滤从其分离开包含葡聚糖的水溶液。能够将其中生物质具有比先前更高的浓度的剩余的水性发酵肉汤至少部分地再循环至发酵容器。原则上交叉流动微量过滤方法为本领域技术人员所知晓并且例如，在"Melin，Rautenbach, Membranverfahren, Springer-Verlag,第三版，2007,第 309 页至第 366 页"中描述。本文中，“微量过滤”被本领域技术人员理解意为移除具有从约0. I ii m至约10 ii m的大小的颗粒。在交叉流动过滤中，例如通过适当的循环泵，平行于用作过滤材料的膜表面应用待过滤的液体流。因此液体流连续地流过过滤膜上，并从而防止或至少降低在膜表面形成沉积物。原则上，全部类型的泵适合作为泵。然而，由于待运输的基质的高粘度，已经证明特别地正排量泵和非常特别地偏心螺杆泵以及回转式活塞泵是有用的。根据本发明，非对称过滤膜被用于交叉流动微量过滤。非对称过滤膜由具有不同孔大小的至少两种不同的层，即由至少一层支持层和一层分离层组成。支持层相对厚并且具有相对大的孔。它给予过滤膜机械强度。对支持层施用至少一层具有比支持层的孔更细的孔的分离层。例如，能够以原则上知晓的方式使用水银孔隙度测量法用于测量孔大小。任选地，在分离层和支持层之间也可放置一层或多层中间层。例如，非对称膜可为金属膜或陶瓷膜。使用的非对称膜优选地为非对称陶瓷膜。例如，在“Melin, Rautenbach, Membranverfahren, Springer-Verlag,第 3 版，2007,第 51 页至第52页”中描述了非对称陶瓷膜的细节。用支持材料生产陶瓷或金属膜体。这些膜体的适当的形式为本领域技术人员所知晓并且是由本领域技术人员根据过滤器装置的设计选择的。例如，它们可形成平膜或管状膜的形式。平膜是盘样结构。管状膜是具有通道(单通道膜)或多个通道(多通道膜)的管状结构。通常管状膜通道的内直径是从Imm至25_，特别地从2_至12. 5_。通道不需要是圆的，而不规则的形状，比如，例如，具有圆的顶点的多边形也是可能的。通常管状膜为从0. Im至5m长,优选地从0. 5至2m。长度从Im至I. 2m的管状膜是可商购的。将多个管状膜一个在另一个后面或互相平行放置，任选地也在不同的箱(housing)，所谓的膜模块中放置也是可能的。在陶瓷过滤膜的情况中，支持材料由多孔无机材料，比如，例如矾土、硅石、碳化硅、氧化锆、氧化钛或这些物质的混合物组成。在金属膜的情况中，使用烧结的金属，比如，例如不锈钢、哈斯特洛伊耐蚀镍基合金、因科镍合金或钛作为支持材料。材料的组合，例如，烧结的金属支持物和陶瓷分离层的组合也是可能的。在单通道膜或平膜的情况中，通常支持材料为从0. 05至IOmm厚，优选地从Imm至5mm。特别优选使用多通道膜。在多通道膜的 情况中，支持材料形成模塑，例如圆的或六角形的模，前述的通道通入其中。通常多通道膜的此类模塑的外直径为从5_至100_，优选地从10mm至50mm。在根据本发明的制备具有￠-1, 3-糖苷连接的主链和与其具有￠-1,6-糖苷键的侧基的葡聚糖溶液的方法中，支持材料的孔大小为从5 ii m至100 ii m，优选地从7 y m至100 u m并且特别优选地从10 ii m至60 ii m。在每种情况中所述值为孔大小D90。术语“孔大小D90”为本领域技术人员所知晓。它是从支持材料的孔大小分布曲线测定的，“孔大小D90”为在90%材料的孔体积具有<孔大小D90的孔大小之处的孔大小。例如，通过水银孔隙度测量法和/或气体吸附方法能够测定材料的孔大小分布。原则上这些方法为本领域技术人员所知晓并且描述于例如，相关的标准 IS015901-1EN、ISO 15901-2EN 和 ISO 15901-3EN 中。任选地，可对支持材料施用一层或多层中间层。支持层或任选地存在的中间层之后为分离层。分离层的平均孔大小为从I至10 y m，优选地从I y m至6 y m并且特别优选地从2iim至5iim。如上所述，值是D90孔大小。在每种情况中由本领域技术人员选定支持层和分离层的孔大小如此使得支持层的孔大小比分离层的孔大小大至少I Pm。优选地，支持层的孔大小比分离层的孔大小大至少5 y m,特别优选地至少10 u m和,例如,至少20 u m。例如，分离层和中间层可由矾土、硅石、碳化硅、氧化锆、氧化钛、这些物质的混合物或金属合金组成。不必需用相同物质生产分离层、中间层和支持材料；通常，不同物质的组合恰恰是有利的。任选地存在的中间层的厚度为从Iym至500 iim。通常分离层的平均厚度为从I ii m至50 ii m，优选地从5 ii m至200 ii m。中间层具有在分别选定的支持材料的孔大小和分离层的孔大小之间的孔大小。用于实施根据本发明的方法，在适当的过滤器装置中安装非对称过滤膜。原则上本领域技术人员知晓适当的过滤器装置的设计。如果分离层存在于支持材料和存留物空间之间则是有利的，本发明不限于此。优选地，管状膜能够被用于实施根据本发明的方法。在管状膜的情况中，存留物优选地通过(一条或多条)通道的内部，而相应地渗透物通过支持材料的壁向外现出进入渗透物空间。如果存留物存在于(一条或多条)通道的外部并且渗透物聚集在(一条或多条)通道的内部是较少优选的。
能够将管状膜用作所谓的单通道元件。然而，优选使用多通道元件。这些元件具有与相同的空间需求相组合的更大的膜面积、更简单的安装的优势并因此基本较低的资本成本。然而在这些膜元件的情况中，渗透物必须穿透整个支持体以从膜元件现出。在物质具有结构粘度的情况中，在低流动速度时粘度 特别高，这使得葡聚糖溶液通过支持体更困难。因此推测，由于渗透物通过支持体的长的路径和更复杂的流动，多通道元件可能不适合于裂裥菌素溶液的过滤。然而，发现尽管渗透物的高粘度和结构粘度的性质，使用多通道元件是可能的并且即使在低跨膜压力下能够达到高渗透物流动。根据本发明，交叉流动的流动速度应当为从0. 2m/s至20m/s,优选地从0. 5m/s至7m/s并且特别优选地从lm/s至6m/s。过慢的流动速度是不利的因为那时膜被快速阻塞；由于待循环的大量的存留物，过高的流动速度产生不必要的高成本。通常跨膜压力为从0. I巴至10巴，优选地从0. 5巴至6巴并且非常特别地从I巴至4巴。实施交叉流动微量过滤的温度是不重要的并且通常是从5°C至150°C，优选地从10至80°C并且特别优选地从15至40°C。如果不杀死待分离开的细胞，即例如在具有生物质再循环的方法中，温度应当为从15°C至40°C。在图I中显示了根据本发明的待使用的过滤器单元的优选的实施方案。优选的装置包含循环泵P，过滤器模块F和热交换器W。通过泵P，生产在过滤器装置F中放置的膜的表面上的液体的前述交叉流动。通过热交换器W能够使装置内容物恒温。过滤器装置F由其中引入膜作为间隔物的箱组成。箱被膜分为所谓的存留物空间和渗透物空间。称为饲料的从泵P到达的液体，是被生物质污染的葡聚糖溶液。饲料通过至少一次进料进入存留物空间。称为浓缩物的液体流通过至少一次排放再次从存留物空间现出。存留物空间中的压力高于渗透物空间中的压力。压力差异被称为跨膜压力。部分饲料流通过膜并且在渗透物空间聚集。被称为渗透物的通过的这部分液体，是从生物质分离的葡聚糖溶液。在本发明的另一个实施方案中，通过使用旋转的内件或旋转膜本身可在膜表面上获得高的剪切力。在这种情况中，也使用术语动态交叉流动过滤。用于实施动态交叉流动微量过滤的装置为本领域技术人员所知晓并且例如能够以DynaMem模块的名称从Buss-SMS-Cancler GmbH, Dtoen获得。使用此类动态交叉流动微量过滤装置，使用盘形式的描述的非对称陶瓷膜。通过用渗透物规律回洗能够任选地延长膜渗透设备的操作时间。为此目的，以规律的间隔在渗透物空间中施用高于存留物空间中压力的压力并且在规定的时间内迫使一定量的渗透物向后通过膜进入存留物空间。例如，通过迫使氮气进入渗透物空间，通过回洗泵或通过使用活塞系统(例如，以“BACKPULSE DECOLMATEUR BF 100”的名称，由Pall，BadKreuznach销售的)，能够实现此回洗。应当以从I分钟至5小时的间隔,优选地以从2分钟至60分钟的间隔实现回洗，其目的并非旨在将本发明限制于此时间周期。优选地回洗的渗透物的量在从每m2膜面积0. 05至5升的范围内，但优选地在从每m2膜面积0. I至2升的范围内。取决于使用的发酵排出物的品质，在合适的时间清洁使用的过滤膜可为必要的。通过用从20°C至100°C，特别地从40°C至80°C的温度的适当的清洁溶液处理膜能够实现过滤膜的清洁。酸(矿物质酸，比如，例如，磷酸、硝酸或有机酸，比如，例如甲酸)能够被用作清洁溶液。通常酸浓度为从以重量计1%至以重量计10%的浓度。通常通过使用碱(例如，氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液)达到更佳的清洁效果。使用的碱的浓度为从以重量计0. 1%至以重量计20%。通过添加氧化性物质，比如，例如过氧化氢、次氯酸盐，特别地次氯酸钠，或过乙酸，能够基本提高清洁效果。氧化性物质的浓度应当为从以重量计0.5%至以重量计10%，特别地从以重量计1%至以重量计5%。特别优选地能够用过氧化氢和碱或过氧化氢和次氯酸盐的混合物实施清洁。在设备关闭期间，优选地在安装在膜过滤设备中的状态下，在就地清洗(cleaning-in-place)系统(CIP系统)的帮助下实现膜的清洁。已经证明只要获得从每m2膜面积50kg渗透物至每m2膜面积5000kg渗透物的量，优选地从每m2膜面积50kg渗透物至每m21000kg渗透物的量就实施过滤膜清洁是有用的。
通过根据本发明的方法，能够以简单的方式制备适合三级矿物油生产的具有3-1，3-糖苷连接的主链和与其具有￠-1,6-糖苷键的侧基的葡聚糖的溶液。根据本发明使用的非对称膜是经济的。由于高渗透物流动，膜设备需要低资本成本并具有低能量消耗。非对称膜具有长的使用寿命。产物的良好品质从由低渗透比率(MPFR值)表示的良好的过滤性质显而易见。产品的MPFR值为从I. 001至2. 5，但特别地从I. 01至2. O。基于存在于发酵排出物中的裂裥菌素的量，裂裥菌素的产量，即能够从发酵排出物中回收的裂裥菌素的量，为从25%至97%，特别地从30%至95%并且非常特别优选地从50%至 93%。通过为本领域技术人员所知晓的使用水的渗滤方法能够任选地增加葡聚糖的产量。下述实例旨在以更多细节说明本发明测定渗诱比率(MPFR倌)测量原理在微孔过滤比率(MPFR值)的测定中，将通过规定的过滤器的滤液的量测定为时间的函数。根据以下公式(I)测定MPFR值MPFR = (t190g-t170g) / (t70g-t50g)(I)，其中变量和等式具有如下含义t190g =获得190g滤液的时间t170g =获得170g滤液的时间t70g =获得70g滤液的时间t50g =获得50g滤液的时间因此，在每种情况中测定了在每种情况中20g滤液流过所需要的时间跨度，即在过滤过程中的早期和晚期，并且从两个时间跨度计算商。MPFR值越大，随着过滤方法的持续时间增加过滤速度被更大地缓慢。这表明，例如由于凝胶或颗粒的增加的过滤器阻塞。通过下述方法测定MPFR值I.仪器a)赛多利斯(Sartorius)压力过滤装置16249 ;过滤器直径47mm ;具有200ml消化缸(digestion cylinder) (0i = 41 mm)b) Isopore 膜 I. 2 U in ；0 47mm ；No. RTTP04700c)天平2.葡聚糖溶液的制备首先，制备从实验获得的葡聚糖溶液和超纯水的混合物50g，即以使得葡聚糖的浓度是1.75g/l的比率。搅拌混合物10分钟并且目测检查均匀性。如果混合物仍然不均匀，进一步搅拌直到混合物均匀。然后用200g超纯水制成至多总量250g的混合物。其后为了均匀搅拌至少lh，此后用0. IM NaOH将pH调节至6. 0并然后再次搅拌15min。再次检查pH6.0。混合物中葡聚糖的最终浓度为0. 35g/l。3.实施讨滤测试在室温(T = 250C )在I. 0巴压力(压缩的空气或N2)下实现过滤测试。-将粗支持格栅置于筛板上-将细支持格栅置于筛板上-将过滤膜置于顶部-插入封口(0-环)-将筛板和出口龙头旋至缸上-关闭出口龙头-引入220g (约 220ml)溶液-将上盖旋至缸上-夹住进气管 -检查压力并调节至I.0巴-将烧杯置于过滤装置下的天平上。按皮重(tare)。-打开出口龙头-当滤液不再现出时测试停止。通过天平，将滤液的量测定为时间的函数。在每种情况中显示的质量能够目测但当然也可自动阅读并求值。存留:存留R用于表征膜的分离行为(参见Melin，RautenbaCh，在上述引文中，第6页)。R= I-某时(渗透物中葡聚糖的浓度)除以此时存留物中葡聚糖的浓度。因为葡聚糖是作为渗透物获得的，存留应当尽可能低。在微量过滤的情况中，通常存留大于0%。因为存留可在时程中改变，规定时间内的平均存留作为特征。用根据本发明使用的过滤膜，获得少于60%的，在有利的情况中甚至少于30%的平均存留。这意味着能够基本从发酵肉汤回收葡聚糖。浓缩因子:在发酵肉汤的浓缩中，浓缩因子MK是重要的量。将其定义为在0时间使用的发酵肉汤的质量除以在葡聚糖离析结束时发酵肉汤的质量的比率。浓缩因子应当尽可能大。使用根据本发明的方法，浓缩因子能够达到至多15，在有利的情况中甚至至多达到30。比较件实例
使用对称过滤膜的过滤在图2中显示使用的交叉流动过滤装置。其由具有120升容积的受搅拌的双层夹套接收器BI、偏心螺杆泵P1、管束热交换器W1、压力释放阀Vl和两个过滤器模块Fl和F2组成。在每种情况中以300s的间隔，每种情况中用200ml渗透物，通过三路阀V3和V4用渗透物回洗过滤器模块Fl和F2，并且氮气的压力是7巴。经过容器BI的双层夹套和热交换器Wl将交叉流动过滤设备的内容物冷却至24°C。在过滤器模块Fl和F2中，使用对称的管状膜，即来自包含陶瓷ATZ (矾土 / 二氧化钛/氧化锆)的TAMI的5通道元件。膜的孔大小D90是3. 5 y m。膜具有对称的结构并且没有分离层或中间层。膜管的长度为Im并且外直径为20mm。模块元件的膜面积为0. 11m2。通道的水力直径为6mm。
实验使用裂裙菌，即以分批发酵制备如"Udo Rau, Biopolymers, A. Steinbiichel编，WILEY-VCH Publishers，第6卷，第63页至第79页”中描述的裂裥菌素。发酵时间为96小时。将99. 6kg此发酵肉汤(=饲料)引入容器BI (图2)中并且在4巴压力以7mVh的循环速率通过泵Pl循环45分钟。分析容器的内容物并且测定裂裥菌素含量为9. 8克每升。然后将循环速率设定为5. ImVh并且应用I. I巴跨膜压力。跨膜流动速率为5m/
S。收集从过滤器模块现出的渗透物并称重。在实验的第一个10分钟期间，获得0.75kg渗透物。这相当于20.4kg/h/m2的渗透物流动。跨膜压力是2. 9巴。操作过滤达16小时并且在此时间内获得6. 18kg渗透物。在最后的I小时内，仅能够获得5. 4g渗透物因为目测膜几乎完全被阻塞。分析收集的渗透物并且发现葡聚糖的含量为6. 7克每升。因此产量仅为4%。渗透物的MPFR值是2. 8并且实验期间葡聚糖的平均存留是32%。浓缩因子仅为1.07。发明实施例I使用非对称过滤膜的过滤再次使用实施例I中描述的交叉流动过滤装置。在每种情况中以120s的间隔，每种情况中用200ml渗透物，通过三路阀V3和V4用渗透物回洗过滤器模块Fl和F2，并且氮气的压力是4巴。通过容器BI的双层夹套和热交换器Wl将交叉流动过滤设备的内容物冷却至22 °C在过滤器模块Fl和F2中使用包含SIC的非对称管状膜，即37通道元件(来自St. Gobain的“CRYSTAR，FT 3000类型”模型)。膜的孔大小D90是3. 0 y m。支持材料的孔大小D90是30 y m。膜管的长度为Im并且外直径是32mm。模块元件的膜面积是0. 42m2。通道的水力直径是3. 4_。本实验使用实施例I中描述的发酵排出物。将115kg此发酵肉汤(=饲料)引入容器BI中并且在4巴压力和7m3/h的循环速度通过泵Pl循环50分钟。分析容器的内容物并且测定裂裥菌素含量为8. 7克每升。此后，将循环速率设定为4. ImVh并且应用I. I巴的跨膜压力。跨膜流动速度是1.7m/s。收集从过滤器模块现出的渗透物并称重。在开始移走渗透物50分钟后，向容器BI添加25kg发酵肉汤。在开始移走渗透物16小时20分钟后，向容器BI添加40kg发酵肉汤并且将循环速率设定为6. 5m3/h。直到此时，已经获得77kg渗透物。这相当于平均渗透物流动5. 6kg/m2/h。在实验开始20小时后，向容器BI添加另外55kg发酵肉汤。在实验开始22. 5h后，已经在渗透物容器中收集109kg渗透物。分析渗透物。第一过滤步骤中的渗透物的MPFR值为I. 3。裂裥菌素的含量为6. 9克每升(直到此时间的平均存留为26% )并且在7/s的粘度是1380mPa S。现在改变渗透物的收集容器，向容器BI添加另外20kg发酵肉汤并且操作过滤另外19. 5h。在此时间中，获得另外85kg渗透物。这相当于5. lkg/h/m2的平均渗透物流动。分析在第二过滤步骤期间收集的渗透物。MPFR值为I. 2并且裂裥菌素的含量为7. 8克每升(整个实验的平均存留29% )并且在7/s的粘度是1560mPa S。因此两个过滤步骤的产量为64%。浓缩因子为4. 2。讨论再次在下表I中列出比较性实例的和实施例的值。
权利要求
1.制备具有￠-1,3-糖苷连接的主链和与其具有￠-1, 6-糖苷键的侧基的葡聚糖的水溶液的方法，所述方法包括在水性培养基中发酵分泌所述结构的葡聚糖的真菌菌株，和随后通过交叉流动微量过滤从包含葡聚糖和生物质的水性发酵肉汤分离获得的葡聚糖的水溶液，其中包含至少一层支持材料和至少一层分离层的非对称过滤膜用于交叉流动微量过滤，分离层的孔大小为从I y m至10 ii m并且支持材料的孔大小为从5 ii m至100 u m,条件是分离层的孔大小比支持材料的孔大小大至少I U m,并且交叉流动的流动速度为从0. 2m/s至20m/s并且跨膜压力为从0. I至10巴。
2.根据权利要求I的方法，其中分离层的孔大小比支持材料的孔大小大至少5iim。
3.根据权利要求I或2的方法，其中在从15至40°C的温度以及通气和流动下实施发酵。
4.根据权利要求I的方法，其中真菌菌株是裂裙菌(Schizophyllumcommune)或齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)。
5.根据权利要求I至4的任一项的方法，其中使用陶瓷非对称过滤膜。
6.根据权利要求I至4的任一项的方法，其中使用非对称金属过滤膜。
7.根据权利要求I至6的任一项的方法，其中将多通道元件用作非对称过滤膜。
8.根据权利要求I至7的任一项的方法，其中在待过滤的发酵肉汤中的葡聚糖的浓度为至少3g/l。
9.根据权利要求I至8的任一项的方法，其中规律地回洗非对称过滤膜。
10.根据权利要求I至9的任一项的方法，其中在包含至少一个发酵容器的设备中实施发酵，经过旁流将包含生物质和葡聚糖的发酵肉汤从设配移除，通过交叉流动微量过滤从其中分离葡聚糖的水溶液，至少部分剩余的包含生物质的发酵肉汤被再循环至发酵容器。
11.根据权利要求I至10的任一项的方法，其中用过氧化氢和碱的混合物在规律的间隔清洁膜，条件是在每种情况中，只要自各自的前次清洁以后达到从每m2膜面积50kg渗透物至每m2膜面积5000kg渗透物的量就实现清洁。
12.根据权利要求I至10的任一项的方法，其中用次氯酸盐和碱的混合物在规律的间隔清洁膜，条件是在每种情况中只要自各自的前次清洁以后达到从每m2膜面积50kg渗透物至每m2膜面积5000kg渗透物的量就实现清洁。
全文摘要
本发明涉及通过在水性培养基中发酵将该葡聚糖分泌进入发酵肉汤中的真菌菌株，生产有具有β-1，3-糖苷键的主链，和通过β-1，6-糖苷键与其结合的侧基的葡聚糖的水溶液的方法，其中通过非对称过滤膜从发酵肉汤分离葡聚糖。
文档编号C12P19/04GK102712943SQ201080061661
公开日2012年10月3日 申请日期2010年12月13日 优先权日2009年12月17日
发明者H·福斯, J·K·施密特, J·特蕾尔, R·霍尔曼, T·福斯特 申请人:温特沙尔控股有限公司