专利名称：脑脊液感染细菌基因检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因领域，具体是一种脑脊液感染细菌基因检测试剂盒。
背景技术：
随着医疗手段的进步，神经外科手术(脑外伤、脑肿瘤、脑出血)病例日益增多。手术治疗的同时，由于手术过程机体免疫系统受到较大创伤，导致机体免疫力下降，极易导致颅内感染，此外，医院获得性感染也是导致颅内感染的重要原因。颅内感染引发的细菌性脑脊髓膜炎是一种发病急、病死率高的常见的中枢神经系统疾病，如能得到及时、正确的诊断和治疗，多数患者预后良好，少数感染严重者可导致死亡或留有后遗症。因此，对脑脊液中感染的病原菌进行快速而准确的检测和鉴定则显得十分重要。姜绯等对579例颅脑术后患者脑脊液细菌生长分布试验及药物敏感试验结果进行分析发现，脑脊液细菌培养阳性的细菌前十五位为凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、B群链球菌、类白喉棒状杆菌、粪链球菌、牛链球菌、绿色气球菌、洛菲不动杆菌、鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯菌。 徐明等收集北京天坛医院神经外科1997年8月至2006年9月送检的脑脊液标本。统计致病菌分布，分离到致病菌970株，其中革兰氏阳性菌720株；革兰氏阴性杆菌250株，排在前6位的致病菌分别为表皮葡萄球菌4% )，金黄色葡萄球菌(9. 4% )，不动杆菌 (6.9%)，肠杆菌属(5% )，铜绿假单胞菌0.8%)，肠球菌0.8%)。而周建新等收集北京天坛医院神经外科的2000年1月2004年12月的脑脊液标本，结果分离出致病菌438株， 排在前五位的分别是凝固酶阴性葡萄球菌(53.7% )、金黄色葡萄球菌(10.5% )、肠球菌 (6.2%)、不动杆菌(6. 2% )、铜绿假单胞菌(3. 7% )。和徐明得出结果一致。李光辉等对上海地区部分医院1995年1月到2004年12月的脑脊液标本按常规方法进行分析，分离致病菌4 例，最常见的细菌分别是凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌属、肠球菌属、肺炎链球菌属、不动杆菌属、克雷伯菌属、大肠埃希菌。靳桂明1(1等采用荟萃分析方法，对开颅术后颅内感染进行流行病学调查，共有46篇论文进入荟萃分析，其中有34篇论文用于开颅术后颅内感染发病率的统计，共调查43766例，发生颅内感染1137例，发病率为2. 60%;有沈篇论文统计显示，颅内感染细菌培养阳性率为55. 41 %，金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球及其它凝固酶阴性葡萄球菌占40. 18%，铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌占32. 28%, 真菌占7. 13%。目前，国内外对脑脊液等临床标本中病原菌的检验大多采用所谓的“金标准”-培养法，一般采集标本后需先进行增菌，出现阳性结果后，再分离单个菌落，通过形态、生理生化、免疫学等方法才能最终确诊。该法灵敏度低、检测周期长、易受细菌生理条件和抗生素使用的限制，且不能用于目前还不能培养细菌或新菌种的鉴定。荧光PCR的方法只能检测一次性只能检测一种或几种细菌，而基因芯片具有体积微小、操作方便、能同时特异检测多种生物分子等优点，为解决上述问题提供了一个新的方向。基于上述原因，开发研制一种简单、快速、能够精确检测出颅内感染且鉴定出所感染大部分细菌的产品是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种脑脊液感染细菌基因检测试剂盒，用以检测脑脊液中常见感染的病原菌群金黄色葡萄球菌、肠球菌(粪肠、屎肠)、表皮葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、洛菲不动杆菌。本发明的脑脊液感染细菌基因检测试剂盒，包括(1) 一个基因芯片，其上带有①检测以上10种菌群的探针，探针为SEQ ID Nos :1_12 ；②标记有生物素点的DNA序列(Bio)，用于监控杂交是否成功，序列为SEQ ID No. 13 ；③带有编码β-球蛋白部分的DNA序列(IC)，作为内控点，用于监控PCR体系是否成功，序列为SEQ ID No. 14 ；(2)弓丨物用于扩增大多数常见细菌的16S rRNA保守序列的引物，DNA序列为SEQ ID Nos. 15-17 ；用于扩增细菌的23S rRNA保守序列的引物，DNA序列为SEQ ID Nos. 18-19 ； 以及用于扩增内控点(IC)的引物，DNA序列为SEQ ID Nos. 20-21。具体序列如下
权利要求
1.一种脑脊液感染细菌基因检测试剂盒，包括(1)一个基因芯片，其上带有①检测菌群的探针，探针为SEQID Nos :1-12 ；②标记有生物素点的DNA序列，序列为SEQID No. 13 ；③带有编码β-球蛋白部分的DNA序列，作为内控点，序列为SEQID No. 14；(2)弓丨物用于扩增大多数常见细菌的16SrRNA保守序列的引物，DNA序列为SEQ ID Nos. 15-17 ；用于扩增细菌的23S rRNA保守序列的引物，DNA序列为SEQ ID Nos. 18-19 ；以及用于扩增内控点的引物，DNA序列为SEQ ID Nos. 20-21。
2.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述探针5'或3'端经过胺基化处理。
3.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述基因芯片包括用于定位探针的位置标记。
4.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上。
5.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述引物的5'端标记有生物素。
全文摘要
本发明公开了一种脑脊液感染细菌基因检测试剂盒，包括(1)一个基因芯片，其上带有①检测以上10种菌群的探针，探针为SEQ ID Nos1-12；②标记有生物素点的DNA序列，序列为SEQ ID No.13；③带有编码β-球蛋白部分的DNA序列，作为内控点，序列为SEQ ID No.14；(2)引物用于扩增大多数常见细菌的16S rRNA保守序列的引物，DNA序列为SEQ IDNos.15-17；用于扩增细菌的23S rRNA保守序列的引物，DNA序列为SEQ ID Nos.18-19；以及用于扩增内控点的引物，DNA序列为SEQ ID Nos.20-21。本发明所述脑脊液感染细菌基因检测试剂盒能够快速准确的检测10种脑脊液中常见感染细菌种类，对于颅内感染患者能够得到及时、正确的诊断和治疗具有重要的意义。
文档编号C12R1/19GK102251053SQ201110233170
公开日2011年11月23日 申请日期2011年8月11日 优先权日2011年8月11日
发明者刘志忠, 康熙雄, 朱娟娟 申请人:广东凯普生物科技股份有限公司