专利名称：中国对虾家系识别微卫星标记四重pcr引物与识别方法
技术领域：
本发明属于分子生物学遗传育种的分子标记辅助技术，是一种中国对虾家系识别微卫星标记四重PCR引物及利用该引物进行家系识别的方法。
背景技术：
中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)又名东方对虾、对虾，是原产我国的一种优质海水养殖品种。利用分子标记辅助育种是中国对虾良种选育重要途径之一，目前应用最为广泛的分子标记为微卫星。常规微卫星检测技术为单对引物进行单个位点的PCR扩增，其产物利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测，效率低，周期长。微卫星多重PCR是基于常规PCR技术，在一个PCR反应体系中加入多对特异性的微卫星引物，针对特定模板进行多个微卫星目的片段的PCR技术。中国对虾多重PCR检测技术的特点是效率高、周期短，可以有效利用少量模板，提高微卫星标记中国对虾遗传多样性分析、个体系谱识别及遗传连锁图谱构建的效率。目前国内外尚未见有中国对虾微卫星四重PCR技术的发明及相关报道。与本发明类似的专利申请有“中国对虾微卫星三重PCR家系识别技术”(孔杰，高焕，授权公告号为CN100510103C)。该专利将开发的三对中国明对虾微卫星引物纳入到一个PCR反应体系中，利用片段大小区分不同产物。其优点在于三重PCR提高了 PCR检测效率；缺点在于个体识别率有限，不同目的片段的PCR产物靠目测难以区分。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供中国对虾家系识别四重微卫星PCR引物，并利用不同中国对虾微卫星位点扩增片段的大小差异，优化PCR反应条件，建立一个中国对虾四重微卫星PCR反应及检测体系，为中国对虾分子标记辅助育种提供高效、准确的微卫星标记检测技术。本发明是通过如下技术方案实现的中国对虾家系识别微卫星四重PCR引物的序列如下RSllOl 正向序列为5 ‘ -CGAGTGGCAGCGAGTCCT-3 ‘，反向序列为 5 ‘ -TATTCCCACGCTCTTGTC-3 ‘；FCKR005 正向序列为5 ‘ -CATCGAATCTAAGAGCTGGAAT-3 ‘，反向序列为 5 ‘ -TTTGTTTGTGAATAATGTGTGT-3‘；FCKR007 正向序列为5 ‘ -CGAAATAAGTTAAATGAAAAAA-3 ‘，反向序列为 5 ‘ -CAACATAAGACTCACGAGACAG-3‘；FCKR009 正向序列为5 ‘ -GCACGAAAACACATTAGTAGGA-3 ‘，反向序列为 5' -ATATCTGGAATGGCAAAGAGTC-3‘。一种中国对虾微卫星标记四重PCR家系识别方法，包括以下步骤提取中国对虾基因组DNA、加入上述中国对虾微卫星标记四重PCR引物建立PCR反应体系，选择合适的 PCR反应程序进行扩增，PCR产物经常规聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染检测方法进行中国对虾四个微卫星位点分析，对中国对虾不同家系进行区分或者进行个体间及亲子之间的识别和鉴定；所述的PCR反应体系，即四对引物可在同一个PCR反应体系中同时扩增的参数，这些参数是10 XPCR Buffer 2. 5 μ 1 (内含 750mM Tris-HCl (pH 8. 8), 200mM(NH4) 2S04,0. 1% Tween 20), 2. OmM Mg2+, 0. 2mM dNTP，四对引物正向及反向序列各 0. 2 μ M，1. OunitDNA 聚合酶，模板DNAlOOng，补充灭菌双蒸水使PCR反应体系达到25 μ 1 ；所述的PCR反应程序为95°C预变性^iin，随后的10个PCR循环为94°C变性40s、 52°C退火lmin、72°C延伸40s ；紧跟着的4个循环为941变性408、511退火lmin、随后每个循环的退火温度降低0. 5°C、72°C延伸Imin ；最后10个循环为94°C变性40s、49°C退火 lmin、72°C延伸 lmin。本发明与现有技术相比的有益效果本发明将需要分别进行四次的中国对虾微卫星PCR扩增和检测，整合为一次的四重PCR反应体系和一次的产物检测，可大大提高中国对虾微卫星标记的检测效率，四重PCR 技术的中国对虾单亲排除率为99. 25%，个体识别率99. 87%。由于四对微卫星产物片段差异显著，避免了由于不同位点产物片段大小接近时无法有效区分的弊病。利用该四重PCR 反应体系进行中国对虾微卫星标记检测，可以大大节约包括PCR实验耗材、PCR试剂、电泳检测及时间成本等各项内容。同时避免了其它以荧光标记为基础的多重PCR技术检测体系成本高，对分析仪器要求严格的缺点。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的解释，但实施例不对本发明作任何形式上的限制。中国对虾微卫星标记RSllOl引物是引用已有的参考文献(专利名称“中国对虾微卫星三重PCR家系识别技术”，授权公告号为CN100510103C)。FCKR005，FCKR007和FCKR009 是我们利用“菌落富集-探针杂交”策略测序获得的，对重复序列进行引物设计从而实现对中国对虾特定微卫星位点的PCR扩增。利用引物设计软件分析排除这四对引物彼此形成引物二聚体、发荚结构的可能，对于检测到的严重影响复合PCR反应进行的二聚体及发荚结构的引物进行修改，使其完全适合复合PCR反应体系。组合这四对引物于同一个PCR反应体系。调整PCR反应体系，建立这四对引物可在同一个PCR反应体系中同时扩增的参数，这些参数是10 XPCR Buffer 2. 5 μ 1 (内含 750mM Tris-HCl (pH 8. 8), 200mM(NH4) 2S04,0. 1% Tween20), 2. OmM Mg2+, 0. 2mM dNTP，四对引物正向及反向序列各 0. 2 μ M，1. Ounit DNA 聚合酶，模板DNAlOOng，补充灭菌双蒸水使PCR反应体系达到25 μ 1，模板DNA为取中国对虾肌肉组织采用常规的酚/氯仿抽提法获得。PCR反应程序为95°C预变性％iin，随后的10个PCR循环为94°C变性40s、52°C退火Imin、72°C延伸40s ；紧跟着的4个循环为94 V变性40s、51 °C退火lmin、随后每个循环的退火温度降低0. 5°C、72°C延伸Imin ；最后10个循环为94°C变性40s、49°C退火lmin、72°C 延伸lmin;循环完成后72°C延伸5min。PCR反应过程在常规PCR仪上进行。PCR产物经变性聚丙酰胺凝胶电泳分离，银染显色。四对微卫星引物的序列如下
RSllOl正向序列为5 5 ‘ -TATTCCCACGCTCTTGTC-3 ‘；FCKR005 正向序列为5 ‘ 5 ‘ -TTTGTTTGTGAATAATGTGTGT-3‘；FCKR007 正向序列为5 ‘ 5 ‘ -CAACATAAGACTCACGAGACAG-3‘；FCKR009 正向序列为5 ‘ 5' -ATATCTGGAATGGCAAAGAGTC-3‘。
-CGAGTGGCAGCGAGTCCT-3
反向序列为
-CATCGAATCTAAGAGCTGGAAT-3 ‘，反向序列为 -CGAAATAAGTTAAATGAAAAAA-3 ‘，反向序列为 -GC ACGAAAACACATTAGTAGGA-3 ‘，反向序列为技术指标RS1101，FCKR005，FCKR005, FCKR007和FCKR009位点的目的片段大小分别为330bp, 283bp, 241bp和196bp,具有的等位基因数分别为12，9，8和14个，由此组合的四重PCR技术的中国对虾单亲排除率为99. 25%,个体识别率99. 87%。应用范围可以通过此四重PCR技术，经过常规方式PCR扩增和银染检测，可一次性获得四个微卫星位点上的中国对虾个体的遗传信息，通过这些不同个体间显示的遗传信息差异来进行个体和家系系谱识别。育种中的应用1)获得了家系个体四个微卫星位点的遗传信息，可以推测缺失的父本或母本的基因型或父母本的基因型组合；幻获得群体四个微卫星位点的遗传信息，可以对该群体按照家系组成进行归类；幻获得亲本之一或父母本四个微卫星位点的遗传信息，可以对混养的后代进行遗传分析，确定或排除后代是否为检测亲本的子代个体。
权利要求
1.中国对虾家系识别微卫星标记四重PCR引物，其特征在于所述引物序列如下RSllOl正向序列为5 -TATTCCCACGCTCTTGTC-3‘；-CGAGTGGCAGCGAGTCCT-3反向序列为FCKR005 正向序列为5 ‘ -CATCGAATCTAAGAGCTGGAAT-3 ‘，反向序列为 5 ‘ -TTTGTTTGTGAATAATGTGTGT-3‘；FCKR007 正向序列为5 ‘ -CGAAATAAGTTAAATGAAAAAA-3 ‘，反向序列为 5 ‘ -CAACATAAGACTCACGAGACAG-3‘；FCKR009 正向序列为5 ‘ -GCACGAAAACACATTAGTAGGA-3 ‘，反向序列为 5 ‘ -ATATCTGGAATGGCAAAGAGTC-3‘。
2. 一种中国对虾微卫星标记四重PCR家系识别方法，其特征在于包括以下步骤提取中国对虾基因组DNA、加入权利要求1所述的引物，建立PCR反应体系，选择合适的PCR反应程序进行扩增，PCR产物经常规聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染检测方法进行中国对虾四个微卫星位点分析，对中国对虾不同家系进行区分或者进行个体间及亲子之间的识别和鉴定； 所述的PCR反应体系，即四对引物可在同一个PCR反应体系中同时扩增的参数， 这些参数是10XPCR Buffer 2. 5 μ 1，Buffer 内含 pH8. 8 浓度为 750mM Tris-HCl, 200mM (NH4) 2S04、0. 1% Tween20，另有 2. OmM Mg2+, 0. 2mM dNTP,四对引物正向及反向序列各 0. 2 μ M，1. Ounit DNA聚合酶，模板DNAlOOng,补充灭菌双蒸水使PCR反应体系达到25 μ 1 ； 所述的PCR反应程序为95°C预变性％iin，随后的10个PCR循环为94°C变性40s、52°C 退火lmin、72°C延伸40s ；紧跟着的4个循环为94°C变性40s、51°C退火lmin、随后每个循环的退火温度降低0. 5°C、72°C延伸Imin ；最后10个循环为94°C变性40s、49°C退火lmin、 72°C延伸 lmin。
全文摘要
中国对虾家系识别微卫星标记四重PCR引物与识别方法，利用现有中国对虾微卫星标记RS1101引物和“菌落富集-探针杂交”策略测序获得的FCKR005、FCKR007和FCKR009共四个引物，建立PCR反应体系，选择合适的PCR反应程序进行扩增，PCR产物经常规聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染检测方法进行中国对虾四个微卫星位点分析，对中国对虾不同家系进行区分或者进行个体间及亲子之间的识别和鉴定；本发明通过一次的四重PCR反应体系和一次的产物检测，可大大提高中国对虾微卫星标记的检测效率，组合的四重PCR技术的中国对虾单亲排除率为99.25％，个体识别率99.87％；同时大大节约了实验耗材，降低成本。
文档编号C12Q1/68GK102399776SQ201110258128
公开日2012年4月4日 申请日期2011年9月2日 优先权日2011年9月2日
发明者李伟亚, 王伟继, 阮晓红 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所