专利名称：一种pik3r5基因突变检测特异性引物和液相芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种PIK3R5基因突变检测特异性引物和液相芯片。
背景技术：
磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol3-kinases, PI3K)属于酯类的激酶(或酶)，普遍存在于体内各类细胞，能磷酸化与膜相关的磷脂酸肌醇家族，它可以募集和激活下游的靶物质而启动一系列信号联级反应，在细胞的有丝分裂发生、细胞存活、分化和激活、细胞骨架的构型与重塑以及囊胞的运输起着重要的作用憐脂酸肌醇-3-激酶调节亚基5 (phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 5)位于染色体17pl3. 1，编码PI3K的重要组成亚基。目前，对PIK3R5基因突变进行检测和分析的方法很少，主要有直接测序法和PCR-RFLP分析法，其中最常用的方法有PCR-RFLP分析法。PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。再次，以上这些方法都存在着检测通量的局限性，每次只能检测一种突变类型，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供PIK3R5基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于检测PIK3R5基因常见基因型R28C的野生型和突变型。一种PIK3R5基因突变检测液相芯片，包括有(A).针对PIK3R5基因R28C位点的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为SEQID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8 ;所述 tag 序列分别选自 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 6中的不同两种；(B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID NO. 9 SEQ ID NO. 14，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有R28C位点的目标序列的引物。优选地，所述扩增引物为SEQ ID NO. 15 SEQ ID NO. 16。优选地，所述ASPE引物为^SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 7组成的序列以及由SEQID NO. 2和SEQ ID NO. 8组成的序列。本发明的另一目的是提供用于PIK3R5基因突变检测的特异性引物。具体技术方案如下
用于PIK3R5基因突变检测的特异性引物，其为SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8。
本发明的主要优点在于
1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100%。所制备的PIK3R5基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及ant1-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、ant1-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应,实现多个突变位点的并行检测。
2.本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ;除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。
3.本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。
4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷， 同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
实施例1PIK3R5基因突变检测液相芯片，主要包括有
一、ASPE 引物
针对PIK3R5基因常见基因型R28C的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。 ASPE引物由“tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示
表1PIK3R5基因的ASPE引物序列中的tag序列
SEQ ID NO.tag 序列(5’ -3’ )ICTTTATCAATACATACTACAATCA2CAATTCATTTACCAATTTACCAAT3CTACTATACATCTTACTATACTTT4CTTTTCAATTACTTCAAATCTTCA5ATTATTCACTTCAAACTAATCTAC6CTTTCTACATTATTCACAACATTA
表2PIK3R5基因的ASPE引物序列中的特异性引物序列
基因型类型特异性引物序列(5，一3’ )R28CR28C-WGCATGGACTCAGCCTCAGCC (SEQ ID NO+7)R28C-mGCATGGACTCAGCCTCAGCT (SEQ ID NO.8)
每条ASPE弓I物包括两个部分,5 ’端为针对相应微球上ant1-tag序列的特异性tag 序列，3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表I所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用lOmmol/L Tris Buffer 配制成100pmol/mL的忙存液。
二、ant1-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的 ant1-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的微球编号与微球上相应的ant1-tag序列如表3所示
表3微球编号与微球上相应的ant1-tag序列
SEQ NO.微球编号微球上对应的ant1-tag序列(5' ~3f )921TGATTGTAGTATGTATTGATAAAG1023ATTGGTAAATTGGTAAATGAATTG1131AAAGTATAGTAAGATGTATAGTAG1243TGAAGATTTGAAGTAATTGAAAAG1335GTAGATTAGTTTGAAGTGAATAAT1451TAATGTTGTGAATAATGTAGAAAG
选择的微球购自美国Luminex公司，将ant1-tag序列包被于微球上。ant1-tag 序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列，即在每个ant1-tag序列前加上一段5_10 个T的间隔臂 序列，ant1-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的 ant1-tag序列用灭菌ddH20配成100nmol/ml的忙存液。所述间隔臂为用于将ant1-tag与微球表面间隔开来或是将ant1-tag置于亲水性环境中的序列。通过在ant1-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(η彡3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly (dA)干扰，还可以用poly (TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T，微球包被的过程如下分别取5X IO6个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ulO. lmol/L 的 MES 溶液中(ρΗ4· 5),加入 IOul 合成的 ant1-tag 分子(100nmol/ml)。配制 10ng/ml 的 EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylca;rbodiimide)(购自 PierceChemical公司)工作液。往微球悬液中加入2. 5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2. 5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0. 02%的Tween-20洗涤一次，再用0. 1%的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有ant1-tag序列的微球重悬于IOOul的 Tris-EDTA 溶液[10mmol/L Tris (pH8. 0) ]，lmmol/LEDTA 中，2_8°C避光保存。三、扩增出含有突变位点的目标序列的引物针对PIK3R5基因常见基因型R28C，设计扩增引物对(见表4)，扩增出I条含有两个突变位点的目标序列。表4扩增出具有突变位点的目标序列的引物
权利要求
1.一种PIK3R5基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有(A).针对PIK3R5基因R28C位点的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为SEQID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8 ;所述 tag序列分别选自 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 6 中的不同两种；(B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID NO. 9 SEQ ID NO. 14,且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有R28C位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的PIK3R5基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为SEQ IDN0. 15 SEQ ID NO. 16。
3.根据权利要求1或2所述的PIK3R5基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 7组成的序列以及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 8组成的序列。
4.根据权利要求1或2所述的PIK3R5基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5-10个T。
5.用于PIK3R5基因突变检测的特异性引物，其特征是，所述特异性引物为针对R28C位点的 SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8。
全文摘要
本发明公开了一种PIK3R5基因突变检测特异性引物和液相芯片，该液相芯片主要包括有每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为针对R28C位点的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8；有anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，实现突变位点的野生型和突变型并行检测。
文档编号C12N15/11GK102994624SQ201110269828
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月13日 优先权日2011年9月13日
发明者许嘉森, 甘丹翠, 邹凤文 申请人:广州益善生物技术有限公司