专利名称：一种用于检测牙鲆感染β诺达病毒的特异性引物及其检测方法
技术领域：
本发明属于应用生物技术领域，涉及利用逆转录和链置换扩增联用的方法检测β 诺达病毒对牙鲆的感染。更具体的说是一种检测β诺达病毒基因的特异性引物及其检测方法。
背景技术：
β诺达病毒属于诺达病毒科，其基因组由两条正链RNA构成，可感染40多种养殖鱼类，引发病毒性神经坏死病，又称作空泡性脑视网膜炎，是世界范围内流行的鱼类疾病， 受感染的鱼苗死亡率接近100%。提早发现、快速诊断对于该病的防控至关重要。目前，对于诺达病毒基因复制和蛋白成熟过程，科学家们已经有了较多的了解，但快速诊断技术尚不完备，常用的诊断方法例如行为体色观察、组织病理检查、RT-PCR法检测病毒衣壳蛋白基因、原位杂交法检测病毒核酸在组织中的分布、免疫学方法等。链置换型聚合酶可以在合成新链的同时置换出原链，从而为下一轮扩增制备模板，因此扩增不需变性步骤，可以在等温条件下进行，基于该原理的环介导等温扩增技术 (即LAMP技术)已显示出较好的应用前景，近年来广泛应用于微生物检测，它与常规的基因诊断技术相比有明显的优势，该技术尤其在现场操作、检测时间、对设备的要求、结果判断方面有更大的优势。中国专利(申请号200610011855. X)公开了一种环介导逆转录等温扩增技术 (RT-LAMP)检测HCV和H5W等RNA病毒基因的方法，它是对包括RNA病毒在各种生物制品、 献血员、病人血液标本等的监测，每种病毒设计出六条引物完全与识别的靶序列中八个结合区匹配，省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，只需一步就可完成在等温环境中的循环置换扩增反应，最后用电泳或肉眼来检测结果。经检索本发明利用特殊设计的引物，并且采用逆转录和链置换扩增联用的方法检测β诺达病毒对牙鲆的感染，尚未见文献报道。
发明内容
本发明的目的在于利用逆转录和链置换扩增联用的方法检测β诺达病毒对牙鲆的感染，以此来提供一个在养殖现场能够快速准确检测β诺达病毒的手段，以便于高效检测样品是否受到β诺达病毒感染；与常规技术相比，本发明不需要分别在不同反应体系中进行核酸反转录和PCR扩增等过程，而是将反转录和扩增以及染色检验等各个过程置于同一个体系内完成，而且反应过程中不需额外补液以及更换反应管等操作，能较好地避免人为因素干扰，此外，本方法只需要简单的水浴锅即可完成实验，既大大缩短了反应的时间， 又不需使用昂贵的PCR仪，省钱省力。本发明主要用于水产生物病害诊断、防治，不但具有高效、快速、准确及操作简便等特点，而且对检测样品的形式具有广泛的适应性，检测样本可以是病灶组织的粗提液，或是由其抽提的RNA，还可以是由抽提的RNA反转录获得的cDNA。为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案
一种用于检测β诺达病毒基因的特异性引物，其特征在于包括2条外侧引物 N2L2fw, CGTCCGCTGTCCATTGAC ；N2L2rw, GGGGCTGCTCATCAGAGT ；
2 条内侧引物N2L2fn，GCAGGTGTGCCAGCATTTCCTTTTTACAGCCTTGGAACTGGAGA ；N2L2rn, C TGGTTTCGCTGGGGCATCTTTTTGTAGGCAACGCCATCTGTG。本发明所述的特异性引物快速检测β诺达病毒基因的方法，其特征在于按如下步骤
(1)使用上述的2条外侧引物和2条内侧引物序列，采用逆转录和链置换扩增联用的方案，在反应体系中加入供试模板进行90分钟扩增反应；扩增反应的总体积为25μ L，其各种成分分别为预混引物 5μ L，dNTP 4 μ L, IXThermopol Roaction Buffer 2. 5 μ L, Bst DNA聚合酶1 μ L，M-Mlv反转录酶1 μ L，模板5 μ L，DEPC水6.5 μ L ；混勻后按照 42°C, IOmin ；65°C,45min ；80°C,10min程序进行孵育，4°C保存；其中的预混引物体积比为 N2L2fn :N2L2fw :N2L2rn :N2L2rw=4:1:4:1 (浓度为 10 μ Μ)；
(2)利用荧光染料STORGREEN I呈现反应结果，在可见光下肉眼即可辨识，或利用紫外观察箱辅助观察；其中所述的感染β诺达病毒的模板为感染β诺达病毒的牙鲆幼鱼的脑组织粗提液、从病鱼脑组织抽提的RNA及由抽提的总RNA反转录获得的cDNA三种样本。本发明所述的检测方法中引物的贮存浓度为100 μ M，工作浓度为10 μ Μ。本发明公开的检测β诺达病毒基因的特异性引物及其检测方法的重点在于
1.本发明建立了一种便捷高效的检测方法，可用于对β诺达病毒的高效检测。首先， 该方法针对靶基因的6个相关区域，设计4条特异性引物，在保证扩增准确性的前提下，大大提高了检测灵敏度；其次，该方法利用链置换型聚合酶进行扩增反应，因此无需常规PCR 的变性等步骤，也不需PCR仪等精密仪器及昂贵设备；第三，本发明对检测样品的形式具有广泛的适应性，模板可以是病灶组织的粗提液，或是由其抽提的RNA，还可以是由抽提的 RNA反转录获得的cDNA等三种形式；第四，本发明利用核酸染料呈现反应结果，在可见光下肉眼即可辨识，如果利用紫外观察箱辅助，可进一步提高检测灵敏度。2.根据β诺达病毒基因组序列设计4条引物，包括2条外侧引物(N2L2fw和 N2L2rw)以及2条内引物(N2L2fn和N2L2rn)，序列见表1 ；
表诺达病毒检测引物序列
权利要求
1.一种用于检测牙鲆感染β诺达病毒的特异性引物，其特征在于包括2条N2L2fV和 N2L2rw 外侧弓丨物序列CGTCCGCTGTCCATTGAC 和 GGGGCTGCTCATCAGAGT ； 2 条 N2L2fη 和 N2L2rn 内侧引物序列GCAGGTGTGCCAGCATTTCCTTTTTACAGCCTTGGAACTGGAGA 和 CTGGTTTCGCTGGGGCA TCTTTTTGTAGGCAACGCCATCTGTG。
2.一种采用权利要求1所述的特异性引物快速检测牙鲆感染β诺达病毒的方法，其特征在于按如下步骤进行(1)采用权利要求1所述的2条外侧引物和2条内侧引物序列，利用逆转录酶和链置换型BstDNA聚合酶，对供试的样品进行逆转录和链置换式扩增反应，反应进行90分钟；反应的总体积为25 μ L，其各种成分分别为预混引物5μ L，dNTP 4 μ L，1 X Thermopol Roaction Buffer 2. 5 μ L，M-Mlv 反转录酶 lyL，Bst DNA 聚合酶 1 μ L，模板 5 μ L，DEPC/K 6.5 μ L ； 混勻后42°C，IOmin ；65°C,45min ；80°C, IOmin ；4°C保存；其中引物浓度均为10 μ M的预混引物体积比为N2L2fn :N2L2fw :N2L2rn :N2L2rw=4 :1 :4 :1 ；(2)利用荧光染料STORGREEN I呈现反应结果，在可见光下肉眼即可辨识，或利用紫外观察箱辅助观察；其中所述的模板样品可以是病灶组织的粗提液，或是由其抽提的RNA，还可以是由抽提的RNA反转录获得的cDNA等三种类型样本。
全文摘要
本发明涉及用于检测牙鲆感染β诺达病毒的特异性引物及其检测方法。本发明针对靶基因序列的6个关联区域，设计4条特异性引物，确保检测的特异性和准确性；采用具有逆转录效力的方案，使整个检测可在一只PCR管中完成，只需一次加样，减少人为操作干扰，90分钟可完成检测，且不需昂贵设备；反应结束后加入SYBRGREENI染料即可通过肉眼快速辨识阳性结果，紫外辅助观察可进一步提高检测灵敏度，该方法的检出限与操作繁琐的RT-PCR相当；本发明检测样品可以是病灶组织的粗提液或是由其抽提的RNA，还可以是反转录获得的cDNA，因此非常适合用于现场定性和定量检测，在水产养殖病害防治中有着较高的推广应用价值。
文档编号C12Q1/68GK102367495SQ20111040773
公开日2012年3月7日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日
发明者刘逸尘, 孙金生, 张亦陈, 杜宏薇, 耿绪云, 顾中华 申请人:天津师范大学