专利名称：苏云金芽胞杆菌vip1like1、vip2like1基因组合及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物防治技术领域，特别是涉及苏云金芽胞杆菌vipl、vip2基因组合及其应用。
背景技术：
蛴螬是金龟总科(Scarabaeoidea)幼虫的总称，属于鞘翅目，鳃金龟科，是地下害虫中种类最多，也是危害最大，造成植物损失最大的种类。金龟子总科种类繁多，世界上记载的有3万多种，目前我国已记录1800多种，这类害虫食性杂、分布广、生活隐蔽、适应性强、生活史长短不一，其中为害农林牧草的有100多种，防治十分困难。最主要的有暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)、华北大黑觸金龟(Holotrichia obeita)和铜绿丽金龟(Anomala carpulenta)等。蛴螬生活习性复杂多样，危害虫态也各异，有的以成虫危害，有的以幼虫危害。蛴螬成虫喜食作物，林果木(杨，榆，柳，苹果，梨等)叶片、嫩茎和花蕾，果穗等，造成危害。蛴螬幼虫危害更为严重，幼虫栖居地下，取食萌发的种子咬断幼苗的根茎，蛀食根块茎等，造成轻则缺苗断垄，重则毁种绝收。幼虫不仅危害范围广，而且为害时间长，从春季到秋季，从播种到收获都有较大危害。蛴螬啃食地下块根、块茎，使作物生长衰弱，直接影响产量和品质，如花生、红薯、马铃薯、萝卜类春秋受害严重。蛴螬啃食后不仅影响产品的外观品质，还易招致病菌从伤口入侵，对冬菜贮藏带来很大不便。近年来随着城市发展，草皮绿化面积逐年加大，对绿化植被的维护已经成为城市发展中的一项重要工作。蛴螬幼虫咬食草皮根茎，以及进一步引起的病害入侵成为城市绿化草皮的主要危害之一。此外，蛴螬还是危害猪群的寄生虫病(猪巨吻棘头虫)中间宿主和传播媒介，棘头虫寄生于猪的小肠，粪肥施于田间，蛴螬是其中间寄主。因此，蛴螬是危害农业、林业、城市绿化的重要害虫。蛴螬是国内外公认的难以防治的地下害虫，作物地下部分损失的86%是由蛴螬造成的，据统计常年全国蛴螬发生面积约700万公顷，一般减产20% 30%。严重年份全国蛴螬发生面积曾达2000万公顷，减产达到50%以上(姜常松，姜福军，包信平.(2008)花生蛴螬播种期一次用药全生育期控制技术，现代农业科技，121-123.)，甚至绝产，成为目前最重要的地下害虫。花生因蛴螬为害一般情况造成减产20% 40%，严重时可减产70% 80%，甚至绝产，并使花生品质下降大大挫伤了群众种植花生的积极性(刘树森,李克斌，尹姣，曹雅忠(2008)蛴螬生物防治研究进展，中国生物防治，168-173。许婷婷，江晨，宫清轩，陈金凤，曲明静(2010)青岛市花生田蛴螬发生与无公害防治研究，花生学报，42-44。王振军，郭志刚，雷晓天，茹德平.(2010)花生田蛴螬发生原因与防治技术，农业科技通讯， 198-200。张改霞，王永芳，魏改红(2010)夏花生田蛴螬的发生与防治，农家参谋，11)。2007年8月中下旬在山东省菏泽地区挖查，蛴螬虫口密度平均为8. 7头/m2，最高达22头/m2(王爱东.(2008)农田蛴螬发生及综合防治技术，现代农业科技)。2003 2007年，在无棣县采取黑光灯诱集与春、夏、秋3季挖土调查相结合的方法。对大田作物进行了随机调查,大豆田、玉米田金龟子分别达5. 63和3. 00头/m2。大豆田金龟子发生的种类最多，为7种。其中中华弧丽金龟最多，占50. 2%，铜绿丽金龟次之，占25. 1%。华北大黑鳃金龟第3，占13. 0%，其他种类较少。玉米田华北大黑鳃金龟最多，占38. 7%，铜绿丽金龟次之，占29. 5%，暗黑鳃金龟第3，占14. 6%，其他种类较少(田方文，彭彦明，张伟华，崔少英(2008)山东省无棣县农田金龟子种类调查及发生规律研究，安徽农业科学，12322-12323)。目前，由于机械化作业的推广，农业生产的耕作制度的改变，比如免耕耕作制度、秸杆还田等技术的推广，给蛴螬带来了舒适的生存环境与丰富的食物，增加了单位面积的虫口数，使得蛴螬危害日益加重，特别是东北、华北和华中地区，给蛴螬的防治带来了困难(裴桂英，马赛飞，刘健，刘保才(2010)大豆田不同耕作模式对蛴螬发生及产量的影响，科学种养)。筛选具有特异性杀虫谱的新Bt菌株始终是Bt研究最活跃的领域。90年代以来，人们在总结回顾Bt杀虫剂防治害虫的历史时发现，现有的Bt杀虫剂主要是用于防治地上的敏感性鳞翅目害虫，用于防治鞘翅目叶甲类害虫的很少。但是起主要杀虫活性作用的伴孢晶体蛋白和芽孢在阳光中的紫外线照射下很容易失活，丧失杀虫活性(初立良，郑桂玲，周洪旭，李长友，李国勋.两株杀鞘翅目害虫Bt菌株的生物活性及杀虫蛋白基因鉴定，华北 农学报，2010 (3))。应用Bt制剂防治蛴螬具有一定的优势，因为蛴螬生活环境隐蔽，避免了伴胞晶体和芽孢受紫外线的照射，能延长杀虫持效期，提高杀虫效果(刘树森，李克斌，尹姣，曹雅忠(2008)蛴螬生物防治研究进展，中国生物防治，168-173)。因此，一些Bt研究者将研究重点转向筛选对主要地下害虫一金龟子类幼虫具有杀虫活性的菌株上，并取得突破性进展。目前，已有不少报道关于对蛴螬有效的菌株与基因，1992年，Ohba等在世界上首次筛选出对铜绿丽金龟、日本弧丽金龟幼虫有特异杀虫活性的一株Bt新菌株(Bt. subsp.japonensis BuiBui),这是Bt首次用于对挤赠的防治研究。Sato等于1994年从该菌株中克隆得到新的杀虫基因_cry8Cal。1994年，美国Mycogen公司从Bt菌株PS50C分离的cry8Aal 和 cry8Bal 对花金龟 Cotinis sp 有明显的杀虫活性。Shin-ichiro Asano 等 2003年发现的含有cry8Da的Bt菌株SDS-502对铜绿异丽金龟有高活性。我国的相关基因发掘是2002年以后开始的。河北省农科院植保所筛选出多株对黄褐丽金龟(Anomala. exoleta)和铜绿丽金龟(Anomala. . corpulenta)幼虫具有特异杀虫活性的Bt菌株(冯书亮，王容燕，范秀华，胡明峻.一株对金龟子类幼虫具有杀虫活性的苏云金杆菌新分离株[J].中国生物防治，2000(2) :74-76)。2004年，中国农业科学院植物保护研究所从菌株HBF-I中克隆得到对铜绿丽金龟高效的cry8Ca2基因，随后进行了突变研究，提高了对铜绿丽金龟的杀虫活性。2006年，中国农业科学院植物保护研究所又发现Bt菌株Btl85对暗黑鳃金龟具有较好杀虫活性，这是发现的第一株对暗黑鳃金龟有杀虫活性的基因，2008年从该菌株中克隆得到了模式基因cry8Fal和对暗黑鳃金龟高活力的模式基因crySEal。2009年，中国农业科学院植物保护研究所又发现了同时对暗黑鳃金龟和大黑鳃金龟高杀虫活性的Bt菌株HBF-18，从该菌株中分离到对大黑鳃金龟与暗黑鳃金龟都有效的第二分类等级的新基因crySGal。研究结果表明自然界中存在对蛴螬具有特异杀虫活性的菌株与基因，通过筛选高效杀虫菌株与基因，可以利用Bt来蛴螬进行有效的生物防治。目前发现对挤赠有杀虫活性的Bt基因有cry3、cry8、cry23、cryl8、cry37、cry43等类基因。研究较多的是cry8类基因，cry8类基因由1160-1210个氨基酸组成，分子量在128-137kDa之间。这些菌株与基因的克隆为我国的蛴螬防治提供了优质菌株资源，也为进一步开发抗蛴螬转基因作物提供了基因资源。
除cry基因外，Bt还有其他编码杀虫蛋白的基因。营养期杀虫蛋白(Vegetativeinsecticidial protein,Vips)是在苏云金芽孢杆菌在细胞营养期发现的一种非晶体的新型胞外杀虫蛋白，Estruch和Warren等人于1996年和1998年分别从Bt菌株AB88和蜡状芽孢杆菌(B. cereus)菌株AB78的上清液中发现了 Vip杀虫蛋白(Estruch et al. 1996)。该类蛋白从对数生长中期开始分泌，直到稳定前期达到最高峰；一般不形成伴孢晶体且与已知的ICPs没有序列相似性，最重要的是其杀虫作用机理与ICPs不同。该蛋白的发现使Bt在杀虫活性、杀虫范围方面得到很大突破，并在一定程度上克服了多种害虫对ICPs低敏感或不敏感的弊端。目前Vips命名规则分为4大类(Vipl，Vip2，Vip3和Vip4)，其中Vipl与Vip2是一种二元毒素，两者需要协同 作用，目前研究显示这类毒素对鞘翅目害虫具有杀虫活性(US5770696，US6656908，US6605701等专利);Vip3类是一大类对鳞翅目高效的杀虫蛋白，特别是Vip3Aa类蛋白对草地滩夜蛾、小地老虎等害虫有较好杀虫活性，克服了 Bt杀虫晶体蛋白对其不敏感的弱点(Estruch et al. 1996) ;Vip4类蛋白是新发现的一类营养期杀虫蛋白，其具体功能还不清楚。20世纪90年代以后，随着化学农药的大规模应用而产生的问题越来越突出，我国逐渐限制了相关高毒农药的使用，从2007年I月I日起，已全面禁止了甲胺磷等高毒化学农药在农业生产中的应用。高毒化学农药的逐渐退场无疑给生物农药腾出了巨大的市场空间。依照我国农药行业确定的“十二五”规划，农药产业将继续深化高毒农药的替代工作，预计到2015年，高毒农药所占比重将由目前的20%降低到5%左右，而生物农药占所有农药的份额将由现在的不足10%增加到30%以上。为了获得最佳的社会、经济和生态效益，改善农业生态环境，实现我国农业经济的可持续发展，保障粮食、食品安全生产，增强我国农产品国际竞争力，研发和推广以生物防治为核心的蛴螬综合防治技术是目前主流趋势。菌株HBF-18对大黑鳃金龟与暗黑鳃金龟有较好杀虫活性，本项目组从中分离到对暗黑鳃金龟与大黑鳃金龟都有活性的cry8Gal基因。cry8Ga基因也是目前唯一报导的对大暗黑鳃金龟有活性的cry基因类型。然而，cry8Ga基因的表达产物与出发菌株(HBF-18)相比，有较大的差别，结果显示含有crySGa基因的无晶体突变株对大黑鳃金龟与暗鳃金龟的活性比出发菌株要低，其LC5tl分别高出50倍与70倍(Shu et al. 2009)(表1-1)。在申请人克隆的其他对蛴螬有活性的基因则没有这种现象。在转入cry8Ca、cry8Ea、cry8Ha与cry8Ia等基因的Bt无晶体突变株具与其出发菌株HBF_l、Btl85以及BtSU4有相当的杀虫效果(表1-2，1-3)。这些现象表明，菌株HBF-18中除了含有cry8Ga基因外，还含有一些其他新的杀虫基因。表1-1.菌株HBF-18与HD8G (只有cry8Ga基因的表达表达菌株)对大黑鳃金龟与暗黑鳃金龟的杀虫活性比较
~大黑鳃金龟暗黑鳃金龟
菌株 -
LC5o(^g 毒素 g_1 土壤)a Slope士S.E.Mb LC50((ig 毒素 g_1 土壤)a Slope士S.E.Mb
0.1078
HBF-18 0.2043 (0.1218-0.3109) 1.4621±0.1625 ,、 1.3428±0.1673
(0.0686-0.1695)
10.15347.3846
HD8G,、 2.5759±0.1876 ,、 1.5424±0.1814
(5.5692-18.5115)(4.9120-11.1019)
3括号中是95%置信区间13平均值土标准误表1-2.菌株HBF-I与HD8C (只有cry8Ca基因的表达表达菌株)对铜绿丽金龟的杀虫活性比较
权利要求
1.一种蛋白组合物，含有Vipllikel与Vip21ikel的蛋白，所述Vipllikel蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N03所示，所述Vip21ikel蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N04所示。
2.根据权利要求I所述的蛋白组合物，仅由Vipllikel与Vip21ikel的蛋白组成。
3.据权利要求I所述的蛋白组合物，还含有Cry8Gal蛋白。
4.权利要求1-3任一所述的蛋白组合物在抗鞘翅目害虫中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，是将蛋白组合物制成杀虫剂杀鞘翅目害虫。
6.根据权利要求4所述的应用，是将分别含有表达蛋白的基因载体转入同一植物或微生物中，使其表现抗鞘翅目害虫的特性。
7.根据权利要求6所述的应用，其中表达Vipllikel蛋白的基因的序列如SEQID NOl所不，表达Vip21ikel蛋白的基因序列如SEQ ID N02所不，表达Cry8Gal蛋白的基因序列如SEQ ID N05所示。
8.根据权利要求7所述的应用，所述含有表达蛋白的基因载体分别为pSTKvip2A，pSTKviplB, pSTKvip8Gal，其结构如图 16 所示。
9.根据权利要求6所述的应用，所述微生物为苏云金芽胞杆菌无晶体突变株HD-73-。
10.根据权利要求4-9任一所述的应用，所述鞘翅目害虫为蛴螬。
全文摘要
本发明涉及“苏云金芽胞杆菌vip1like1、vip2like1基因组合及其应用”，属于生物防治技术领域。本发明人从出发菌株HBF-18中克隆得到vip1like1、vip2like1基因，其序列分别为SEQ ID NO1和SEQ ID NO 2。本发明发现，vip1like1、vip2like1基因之间，cry8Ga1与vip1like1、vip2like1基因之间存在相互的协同作用，表现出对鞘翅目害虫的高毒力，特别是对暗黑鳃金龟的杀虫效果非常好。该基因组合对主要地下害虫蛴螬的生物防治以及我国农业绿色可持续发展都有极其重要的意义，进一步为开发抗蛴螬的Bt工程菌株、转基因作物提供基因来源。
文档编号C12N1/21GK102633884SQ20121011982
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月21日 优先权日2012年4月21日
发明者宋福平, 张彦蕊, 张 杰, 彭琦, 束长龙, 耿丽丽 申请人:中国农业科学院植物保护研究所