专利名称：一种头孢菌素c的发酵方法
技术领域：
本发明涉及头孢菌素C的发酵方法。
背景技术：
头孢菌素C由顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)产生,是继青霉素之后又一重要的内酰胺抗生素，其结构与青霉素的结构相似，有一酰基侧链与一双环母核上的氨基相接，与青霉素一样都具有一个四元内酰胺环，但头孢菌素C具有六元二氢噻嗪环，代替了青霉素特征五元噻唑环。头孢菌素C的分子式C16H21O8N3S,分子量为415. 4，结构式 为
H
匪2 O o#-NY^cH2OCOCH3
COOH
O头孢菌素类抗生素由于其抗菌谱广和过敏性弱的特点，是临床上广泛使用的消炎、抗菌药物。头孢菌素C是生产各种注射用半合成头孢菌素的基本原料。头孢菌素C是顶头孢霉菌的次级代谢产物，在其合成过程中，需要补充足够的碳源。葡萄糖是常用的碳源，但是糖类物质会抑制头孢菌素C合成的关键酶，进而影响其正常合成。油脂则有利于头孢菌素C前提氨基酸的合成，进而可以促进头孢菌素C的合成，但其难溶于发酵液，过高浓度的油脂会导致发酵液供氧速率降低，因此会影响到菌体的生长，最终导致产物得率下降。补充合适的碳源，是决定头孢菌素C产量极为关键的因素。郭元昕等，“豆油对头孢菌素C发酵影响的初步研究”，中国抗生素杂志，2010，35( 10): 747-750研究发现，用顶头孢霉AC0508菌株发酵制备头孢菌素C，发酵培养基(％):葡萄糖I. 67，KH2PO4 O. 4，(NH4) SO4
O.8，FeSO4 ·7Η20 O. 005, CaCO3 1，发酵 140h，在 72h，84h，96 三个时间添加点中，以 72h 添加豆油为最佳，72h的豆油添加以O. 8%的添加效果最好，制备的头孢菌素C效价约为18000U/
mLo现有文献报道的发酵方法制备的头孢菌素C的效价低，难以满足工业化应用的需求。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的头孢菌素C的发酵方法。本发明头孢菌素C的发酵方法，它包括如下步骤(I)取顶头孢霉，制备一级种子、二级种子；(2)取步骤(I)制备的二级种子，接种至顶头孢霉发酵培养基中发酵，在发酵过程的以下时间段内补入葡萄糖和植物油，工艺如下葡萄糖40-80h,流加4-llg/L · h ;80_140h,流加 9_21g/L · h ；植物油50_90h，流加l-6g/L · h ;90_140h，流加 3_8g/L · h ；(3)将步骤(2)所得发酵液过滤，得上清，分离纯化，即得头孢菌素C。其中，步骤(I)所述顶头孢霉是保藏号为ATCC 36225的顶头孢霉。其中，步骤(I)中一级种子和二级种子按照本领域常规方法即可制备得到，其中，活化后用于制备一级种子的顶头孢霉菌液浓度应不小于25% (mg/ml)。其余步骤可以按照冀志霞等，“头孢菌素C发酵过程代谢特征”，华东理工大学学报(自然科学报2006-11第32卷1275-1279)第I. 2. 6三级发酵记载的方法制备；也可按如下方法制备a、一级种子取顶头孢霉，按照1-2% (v/v)接种量接种至种子培养基，在pH为6. 5-7. 5、27-29°C培养50-65h，所述种子培养基含有如下成分玉米浆20-30重量份、葡萄糖13-20重量份、蔗 糖10-20重量份、植物油35-50体积、碳酸钙1-1. 5重量份、消沫剂O. 5-1. O体积份；b、二级种子取一级种子，按照8-10% (v/v)接种量接种至种子培养基，在pH为6. 0-7. 0,27-29°C培养50-65h，所述种子培养基含有如下成分为玉米浆16-25重量份、花生粉4_7重量份、黄豆粉4-7重量份、硫酸钙5-10重量份、葡萄糖6-10重量份、植物油40-50体积份、碳酸钙
4-7重量份、消沫剂O.5-1重量份。其中，步骤(2)所述发酵的条件是发酵时间140h ;发酵温度0_40h为28°C，40-140h 为 24-25 °C ;发酵 pH 为 5. 5-5. 8。其中，步骤(2)所述发酵培养基包含如下成分玉米浆40-75重量份、花生粉10-20重量份、葡萄糖5-12重量份、水解淀粉20-30重量份、甲硫氨酸3-8重量份、植物油50-70体积份、消沫剂I. 5-3体积份、MgSO4 2-5重量份、(NH4)2SO4 8-15重量份、FeSO4 O. 05-0. I重量份、MnSO4 O. 01-0. 04 重量份、ZnSO4 O. 01-0. 04 重量份、CuSO4 O. 01-0. 04 重量份、CaCO3
5-10重量份。前述重量份与体积份的比值为g/mL。优选地，步骤(2)中补入葡萄糖的工艺40_80h，流加5-10g/L-h ;80_140h，流加10-20g/L · h ;补入植物油的工艺50-90h，流加 2-5g/L · h ;90_140h，流加 4_7g/L · h。进一步优选地，补入葡萄糖的工艺40_80h，流加10g/L · h ;80_140h，流加20g/L · h ;补入植物油的工艺50-90h,流加5g/L · h ;90_140h,流加6g/L · h。进一步优选地，补入葡萄糖的工艺40_80h，流加9g/L · h ;80_140h，流加18g/L · h ;补入植物油的工艺50-90h,流加2g/L · h ;90_140h,流加4g/L · h。前述植物油为大豆油或者玉米油。本发明的发酵方法制备得到的头孢菌素C的效价达到了 2870(T41200U/mL，显著高于现有技术制备得到的头孢菌素C，可以大幅降低生产成本，具有良好的应用前景。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施例方式本发明效价按照刘雪惠等，“利用HPLC方法快速测定发酵液中头孢菌素C效价”，黑龙江医药1996年第9期第138-139页记载的方法测定。实施例I本发明头孢菌素C的发酵方法I、发酵方法(I)制备一级种子—级种子培养基玉米衆20g、葡萄糖13g、鹿糖10g、植物油35ml、碳酸|丐lg、消沫剂 O. 5ml。 取保藏号为ATCC 36225的顶头孢霉，活化，取浓度为25% (mg/ml)的菌液按照1%(v/v)接种量接种至种子培养基，在pH为7. 0、27°C培养50h。(2)制备二级种子二级种子培养基玉米浆16g、花生粉4g、黄豆粉4g、硫酸钙5g、葡萄糖6g、植物油40ml、碳酸I丐4g、消沫剂O. 5g。取一级种子，按照8%(v/v)接种量接种至种子培养基，在pH为6. 5、27°C培养50h。(3)发酵发酵培养基玉米浆50g、花生粉15g、葡萄糖Sg、水解淀粉26g、甲硫氨酸4g、大豆油 55ml、消沫剂 2ml、MgSO4 4g、(NH4)2SO4 13g、FeSO4 O. 09g、MnSO4 0. 03g、ZnSO4 0. 025g、CuSO4 0. 025g、CaCO3 6g。取步骤(2)制备的二级种子，按照18% (v/v)的接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵 140h,0-40h 为 28°C,40-140h 为 24。。，pH 为 5. 6。期间，补入葡萄糖和植物油补入葡萄糖(葡萄糖的浓度为100g/L)的工艺为40_80h，流加10g/L -h ;80_140h，流加 20g/L · ho补入大豆油的工艺为50_90h,流加5g/L · h ;90_140h,流加6g/L · h。(4)发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测取ImL滤液于50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测其效价；(5)分离纯化将步骤(4)的滤液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇或丙酮解吸附，得到的乙酸乙酯(或丙酮)溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C锌盐。2、结果检测结果见表I :表I菌浓度与头孢菌素C的效价
权利要求
1.一种头孢菌素C的发酵方法，其特征在于它包括如下步骤 (1)取顶头抱霉，制备一级种子、_■级种子； (2)取步骤(I)制备的二级种子，接种至顶头孢霉发酵培养基中发酵，在发酵过程的以下时间段内补入葡萄糖和植物油，工艺如下葡萄糖:40-80h,流力口 4-llg/L h ;80_140h,流力口 9_21g/L h ；植物油50-90h，流加 I-6g/L h ;90-140h，流加 3_8g/L h ； (3)将步骤(2)所得发酵液过滤，得上清，分离纯化，即得头孢菌素C。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I)所述顶头孢霉是保藏号为ATCC36225的顶头孢霉。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中 补入葡萄糖的工艺40-80h,流加 5-10g/L h ;80_140h,流加 10_20g/L h ； 补入植物油的工艺50-90h，流加2-5g/L h ;90-140h，流加4_7g/L h。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于 所述补入葡萄糖的工艺40-80h,流加10g/L h ;80_140h,流加20g/L h ； 所述补入植物油的工艺50-90h,流加5g/L h ;90_140h,流加6g/L h。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于 所述补入葡萄糖的工艺:40-80h,流力口 9g/L h ;80_140h,流力口 18g/L h ； 所述补入植物油的工艺50-90h，流加2g/L h ;90-140h，流加4g/L h。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(2)所述植物油为大豆油或者玉米油。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(2)所述发酵的条件是发酵时间140h ;发酵温度0-40h 为 28°C，40-140h 为 24-25°C ;发酵 pH 为 5. 5-5. 8。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(2)所述发酵培养基包含如下成分玉米浆40-75重量份、花生粉10-20重量份、葡萄糖5-12重量份、水解淀粉20-30重量份、甲硫氨酸3-8重量份、植物油50-70体积份、消沫剂I. 5-3体积份、MgSO4 2-5重量份、(NH4) 2S048-15 重量份、FeSO4O. 05-0. I 重量份、MnSO4 0. 01-0. 04 重量份、ZnSO4 0. 01-0. 04 重量份、CuSO4O. 01-0. 04 重量份、CaCO3 5-10 重量份。
全文摘要
本发明公开了一种头孢菌素C的发酵方法，它包括如下步骤(1)取顶头孢霉，制备一级种子、二级种子；(2)取步骤(1)制备的二级种子，接种至顶头孢霉发酵培养基中发酵，在发酵过程的以下时间段内补入葡萄糖和植物油，工艺如下葡萄糖40-80h，流加4-11g/L·h；80-140h，流加9-21g/L·h；植物油50-90h，流加1-6g/L·h；90-140h，流加3-8g/L·h；(3)将步骤(2)所得发酵液过滤，得上清，分离纯化，即得头孢菌素C。本发明头孢菌素C的发酵方法操作方便，成本低廉，制备的头孢菌素C效价高，市场应用前景良好。
文档编号C12P35/06GK102808011SQ201210310798
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月28日
发明者杨勇, 邓芸, 黄海玉, 王利春, 刘思川, 梁隆, 程志鹏 申请人:伊犁川宁生物技术有限公司