专利名称：一种用于多不饱和脂肪酸生物合成的脱饱和酶Δ9 Des的制作方法
技术领域：
本发明涉及多不饱和脂肪酸((Polyunsaturated fatty acids, PUFAs)的微生物制造领域，具体涉及在多不饱和脂肪酸生物合成途径中起作用的脂肪酸脱饱和酶。
背景技术：
多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids, PUFAs)是指含有两个或两个以上双键、碳原子数为16 26的直链脂肪酸。其中，《_3和《-6是两类人体所必需的脂肪酸，不能在体内合成，只能通过食物摄取。属于《-3的有a-亚麻酸(ALA, 18:3)、二十碳五烯酸(EPA，20:5)、二十二碳六烯酸(DHA，22:6)等；属于《_6的有亚油酸(LA，18:2)、Y-亚麻酸(GLA，18:3)和花生四烯酸(ARA，20:4)等。多不饱和脂肪酸《_3和《_6在人体内有着多方面重要的生理功能，是所有细胞膜的重要组成成分，对激素代谢和许多酶的·活性起调控作用，特别对新生儿脑和视力的发育是必需的。PUFAs的生物合成途径是以硬脂酸(Stearic acid)为底物，主要通过脂肪酸脱氢酶(Desaturase, Des)和延长酶(Elongase, Elo)的作用，生成不同的脂肪酸产物。主要的脂肪酸合成途径有三条A 6脱氢酶-A 6延长酶-A 5脱氢酶-A 5延长酶-A 4脱氢酶途径(A6 Des-A 6 Elo- A 5 Des- A 5 Elo- A 4 Des),A 9延长酶-A 8脱氢酶途径(A 9 Elo- A 8 Des)和聚酮合成酶途径(Polyketidesynthase, PKS)。研究PUFAs生物合成途径中的关键酶和节点，对其合成通路进行解析和改造，对于PUFAs的微生物制造具有重要意义。高山被抱霉(Mortierella alpina, M. alpina)是目前产PUFAs真菌中唯一具有正式安全性评估的菌种(GRAS)，其PUFAs含量极为丰富，总的脂肪含量达到菌体生物量的50%，其中《_3达到总脂肪酸含量的3%，而《-6达到总脂肪酸含量的近30%，是名副其实的油脂细胞工厂。目前已有M. alpina菌株用于《_6脂肪酸花生四烯酸(ARA，20:4)商业化生产的报道。已知M. alpina编码I个c5，两个c6，3个c9，I个cl2和I个《 3区位选择性脱氢酶，其具备所有已知的区位选择性膜脱氢酶组。
发明内容
膜脱饱和酶可以在多种宿主中表达，例如大肠杆菌、啤酒酵母、米曲酶和高山被孢霉。申请人已经对PUFAs生物合成途径中的关键酶(《3 Des, A 12 Des和A9_I Des)的高效表达、纯化和鉴定进行了大量工作。具体地，申请人在M. alpina全基因组测序的基础上，设计了三对分别针对编码M. alpine A 9 Des, A 12 Des和《3 Des这三个脱饱和酶的核苷酸的引物，具体引物序列在表I中列出。提取高山被孢霉RNA后进行反转录得到cDNA，用FFl和FR1、FF2和FR2、FF3和FR3三对引物PCR扩增出三条序列，将其插入pET19b(PP)并测序，进而亚克隆至毕赤酵母表达载体pPink a -HC,构建上述三个脱饱和酶的表达载体,线性化后电转化至PPink strain2，得到的重组菌能够顺利表达上述三种脱饱和酶。酶学活性分析结果表明重组菌中的脱饱和酶能够发挥功能，并用Ni柱一步层析法得到纯化的脱饱和酶蛋白。本发明提供了编码M. alpina 3脱饱和酶(FADS15)和A 9脱饱和酶(FADS9-I)的基因，其核酸序列分别如SEQ ID NO: I和SEQ ID N0:3所示。本发明还提供了分别含有SEQ ID NO: I和SEQ ID NO:3的表达载体，能够分别表达M. alpine 3脱饱和酶(FADS15)和A 9脱饱和酶(FADS9-I)。优选地，所述表达载体是毕赤酵母表达载体。本发明还提供了一种重组微生物，它能够分别表达M.alpina 3脱饱和酶(FADS15)和A 9脱饱和酶(FADS9-I)。优选地，所述重组微生物是重组毕赤酵母，包括 PichiaPink strain 1> PichiaPink strain 2、PichiaPink strain 3 和 PichiaPinkstrain 4 菌株，特别是 PichiaPink strain 2，其中含有携带 SEQ ID N0:1 或 SEQ ID NO: 3的毕赤酵母表达载体。本发明成功表达和纯化了来源于M. alpina，在多不饱和脂肪酸生物合成途径中起关键作用的新的膜脱饱和酶《3脱饱和酶(FADS15)和A 9脱饱和酶(FADS9-I)，其氨基酸序列分别如SEQ ID N0:2和SEQ ID NO:4所示，并对上述两种膜脱饱和酶进行了酶学活性验证。I.本发明还涉及上述新的膜脱饱和酶A9脱饱和酶(FADS9-I)和《3脱饱和酶(FADS15)在多不饱和脂肪酸生物合成中的用途，特别是利用此基因在高山被孢霉或其他转入此基因物种中用于不饱和脂肪酸的生产及人类健康治疗，特别是将饱和脂肪酸转化成单不饱和脂肪酸(△ 9脱饱和酶)和《 6多不饱和脂肪酸催化为《 3多不饱和脂肪酸(《 3脱饱和酶)，比如A 9脱饱和酶能将C14:0催化为C14:1A9，C16:0催化为C16:1A9，C18:0催化为C18:1A9，C20:0 催化为 C20:1A9，w 3 脱饱和酶能将 C18:1A9 催化为 C18:2 A9’15，C18:2A9’12催化为 C18:3 A9’12’15，C20:4A5’8’n’14 催化为 C20:5 A5’8’n’14’17表I引物序列表及其酶切位点
权利要求
1.如SEQID N0:3所示的核酸，特征在于编码一种高山被孢霉的A9脱饱和酶。
2.含有权利要求I所述核酸的表达载体，特征在于能够表达高山被孢霉的A9脱饱和酶。
3.根据权利要求2所述的表达载体，特征在于所述载体是毕赤酵母表达载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体,特征在于所述载体是pPinka -HC。
5.含有权利要求2-4任一项所述表达载体的重组微生物,特征在于能够表达高山被孢霉的A 9脱饱和酶。
6.根据权利要求5所述的重组微生物，特征在于所述微生物是毕赤酵母。
7.根据权利要求6所述的重组微生物,特征在于所述毕赤酵母是PichiaPinkstrain2菌株。
8.一种高山被孢霉的A 9脱饱和酶，特征在于其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
9.权利要求8所述的脱饱和酶在不饱和脂肪酸生物合成中的用途，特征在于将饱和脂肪酸催化为单不饱和脂肪酸。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于利用此基因在高山被孢霉或其他转入此基因物种中用于不饱和脂肪酸的生产及人类健康治疗，特别的是将脂肪酸C14:0催化为C14:1A9，C16:0 催化为 C16: 1A9, C18:0 催化为 C18:1A9，C20:0 催化为 C20:1A9。
全文摘要
本发明提供了来自高山被孢霉的一种用于不饱和脂肪酸生物合成的新的脂肪酸脱饱和酶基因，特别是Δ9脱饱和酶(FADS9-I)。本发明还提供了编码上述脱饱和酶的核酸序列、上述脱饱和酶的表达载体和表达上述脱饱和酶的重组微生物。
文档编号C12N1/19GK102787128SQ201210310769
公开日2012年11月21日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月28日
发明者宋元达, 张灏, 田丰伟, 赵建新, 陈卫, 陈永泉, 陈海琴, 顾震南 申请人:江南大学