专利名称：一种dhfr的c829t单核苷酸多态性检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒，采用基因测序技术，可以对DHFR (C829T)多态性位点进行检测。
背景技术：
骨髓抑制限制了多种化疗药物的应用，使之难以达到治愈或抑制肿瘤生长的效果，而一些耐药基因是产生骨髓抑制的分子基础，如二氢叶酸还原酶基因(dihydrof olatereductase, DHFR)。DHFR是细胞内叶酸代谢的关键酶，分子量为22KD。在还原型辅酶II (NADPH)的参与下，DHFR能催化叶酸变成二氢叶酸，而后者为合成胸嘧啶核苷及嘌呤核苷输送了碳元素，因此DHFR是DNA、RNA及蛋白质等物质合成的其中一种关键酶。此外，DHFR也是抗代谢类抗肿瘤药物氨甲嘌呤(MTX)的靶酶。MTX是一种叶酸类似物，在临床上常用来治疗乳腺癌、急性白血病、淋巴瘤等多种肿瘤。其作用原理是通过竞争性与DHFR的活性位点紧密结合而使其失活，从而导致细胞中四氢叶酸含量下降，细胞DNA合成异常，造成细胞死亡。但是在治疗过程中一些肿瘤细胞很快对其产生耐药性，骨髓抑制的毒副作用也较严重、限制了其疗效。DHFR基因的SNP是导致肿瘤细胞对MTX产生耐药的一种因素。虽然MTX可以竞争性地抑制DHFR，但是当MTX和DHFR亲和力下降时，MTX抑制该酶的作用就会明显下降。诸多研究表明在一些耐药细胞中，由于DHFR基因中第829号核苷酸会发生T代替C的突变，即产生CC型(野生纯合型)、CT型(杂合型)、TT型(突变纯合型)三种基因型，而后两者导致了 DHFR蛋白质结构的改变，进而影响DHFR与MTX结合的空间结构，最终引起DHFR和MTX亲和力的下降，提高了细胞的抗药性。吴瑞琼等将含突变mDHFR的逆转录病毒上清转染脐血CD34+细胞之后进行细胞抗MTX分析，结果发现转导mDHFR耐药基因的脐血干细胞集落形成数明显高于对照组，同时对MTX的抗性提高了约2倍。另有资料显示将转导有人的突变mDHFR基因的小鼠骨髓移植到荷瘤小鼠后，再使用大剂量MTX治疗，结果表明转导有突变mDHFR基因的小鼠骨髓能耐受大剂量化疗的冲击治疗，并使44%的小鼠肿瘤完全消退，而对照组小鼠全部死亡。终上所述，正是由于DHFR中一个氨基酸的改变从而使细胞具有对MTX的耐受性。因此，检测肿瘤患者中DHFR (C829T)的基因型，有助于临床医生制定更具针对性的个体治疗方案，获得较佳效果的同时也减轻患者的经济与身体负担。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒，可用于检测DHFR(C829T)位点是否发生突变。一种DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、单链纯化试剂和测序试剂，其特征在于PCR试剂包括特异性扩增引物SEQ NO. I、SEQ NO .2，其序列为
SEQ NO. I ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC,
SEQ NO. 2 =Biotin- AATGTCAAGGACTGGCAAGAG ；
测序试剂包括特异性测序引物SEQ NO. 3，其序列为
SEQ NO. 3 :AGTCCCCAGCACCTG。进一步地，所述PCR试剂包括2*PCR BufferUOmM dNTP、5U/ul Taq酶、特异性扩增引物SEQ NO. I和SEQ NO . 2、灭菌水；所述单链纯化试剂包括链亲和素包被的磁珠、70%(V/V)乙醇、变性液、I XWash Buffer、结合缓冲液、退火缓冲液；所述测序试剂包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及dNTP。所述试剂盒的使用方法包括如下步骤
(1)提取样本中的DNA
(2)以DNA为模板，依据所述的特异性扩增引物(SEQNO. I、SEQ NO. 2)进行PCR扩增；
(3)将步骤(2)所得的PCR产物以所述的标记生物素的引物序列进行单链纯化；
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行测序；
(5)结果分析。进一步地，步骤⑵的PCR反应按以下条件进行扩增94°C 2min预变性；98°C10s、58°C 30s,68°C 30s，40 个循环；68°C 5min。步骤(3)单链纯化的具体步骤为将得到的50ul PCR产物与3ul链亲和素包被的磁珠及47ul结合缓冲液混合，室温孵育l(Tl5min，期间震荡2 3次，然后使用Vaccuumprep tool吸取磁珠,将带有磁珠的Vaccuum prep tool先后放进70%(V/V)乙醇、变性液、I Xffash Buffer中清洗IOs左右，再将Vaccuum prep tool放入含有49ul退火缓冲液及Iul测序引物(SEQ N03)的96孔板中，释放磁珠，将该96孔板放置于80°C 2min，再冷却至室温，即得到测序反应所需的单链纯化产物。步骤(5)结果分析的具体方法是将测序结果与标准序列对比，得到DHFR (C829T)位点的碱基类型。DHFR 部分标准序列为ACTCTTGTCTCTATCAGATA CCATTTATGAGACATTCTTGCTATAACTAAGTGCTTCTCCAAGACCCCAACTGAGTCCCCAGCACCTGCTACAGTGAGCTGCCATTCCACACCCATCACATGTGGCACTCTTGCCAGTCCTTGACATTGTCGGGCTTTTCACATGTTGGTAATATTTAT。其中下划线部分为829位点。本发明的有益效果目前，对于检测DHFR (C829T)多态性的最可靠的方法就是进行测序，而本发明通过特异性引物扩增目的区域，并利用焦磷酸测序分析鉴定多态性。该方法不但保证了一定的准确性及灵敏度，同时相对Sanger测序法具备了较短的检测周期，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。
图I是样本A测序图。测序结果为CTA￡AGTGAG，该样本是CC型(野生型)，图中红框部分是样本A基因型的判断区。图2是样本B测序图。测序结果为:CTAC (T)AGTGAG,该样本是CT型(杂合型)，图中红框部分是样本B基因型的判断区。
图3是样本C测序图。测序结果为CTAIAGTGAG，该样本是TT型(突变纯合型)，图中红框部分是样本C基因型的判断区。图4飞分别是样本A、B、C的sanger测序图谱。目的是为验证图广3的结果，最终发现两种测序检测结果一致。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。实施例I 检测DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、单链纯化试剂和测序试剂，其中
(i)PCR扩增试剂2*PCR BufferUOmM dNTP、5U/ul Taq 酶、扩增引物(SEQ NO. USEQNO. 2)及灭菌水；SEQ NOUSEQ NO 2的序列为
SEQ NO. I ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC,
SEQ NO. 2 =Biotin- AATGTCAAGGACTGGCAAGAG ；
(ii)单链纯化试剂链亲和素bead、70%(V/V)乙醇、变性液、I XWash Buffer、结合缓冲液、退火缓冲液；
(iii)测序试剂=DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及 dNTP CdNTP 即 dATP、dTTP、dCTP、dGTP)及测序引物(SEQ NO. 3)。SEQ NO. 3序列为AGTCCCCAGCACCTGo上述试剂盒的使用方法包括如下步骤
(1)提取样本中的DNA
(2)以DNA为模板，依据所述的特异性扩增引物(SEQNO. USEQ NO. 2)进行PCR扩增；
(3)将步骤(2)所得的PCR产物以所述的标记生物素的引物序列进行单链纯化；
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行测序；
(5)结果分析。通过几百例临床受检样本用本试剂盒中的引物(SEQ NO. I、SEQ NO. 2、SEQ NO. 3)进行实时荧光定量PCR，发现其具有较高的扩增稳定性、特异性、灵敏度；同时使用Sanger测序法对相同的受检样本进行测序，结果两类方法的检测结果完全一致，说明本试剂盒具有极高的检测准确性。实施例2
本发明试剂盒的具体使用方法
I、DNA提取
I)抽取300uL血液加入900uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混勻几次。IOOOOrpm离心I分钟(若离心机最高转速不允许,可3000rpm离心5min),吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20 μ I蛋白酶K溶液，混匀后加入200 μ I缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。3)加人200 μ I无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000 rpm (13, 400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。5)向吸附柱CB3中加入500 μ I缓冲液⑶(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000 rpm (13，400 Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。6)向吸附柱CB3中加入700 μ I漂洗液PW (使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000 rpm (13，400 Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱 CB3 中加入 500 μ I 漂洗液 PW，12，000 rpm (13，400 X g)离心 30秒，倒掉废液。 8)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000 rpm(13, 400Xg)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。9)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100 μ I洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，000 rpm (13，400Xg)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。2、PCR 扩增
一例样本的总 PCR 体系为 50ul :2氺PCR Buffer 25ul、10mM dNTP 10ul、引物 SEQ NO. I和 SEQ NO. 2 各 I. 75ul、5U/ul Taq 酶 lul、灭菌水 9ul、DNA 模板 2. 5ul。PCR 反应程序94°C 2min 预变性；98°C 10s，58°C 30s，68°C 30s，38 个循环；68 °C 5min。3、单链纯化
将得到的50ul PCR产物与3ul链亲和素磁珠(bead)及47ul结合缓冲液混合，室温孵育10 15min,期间震荡2 3次，以免bead下沉。然后使用Vaccuum prep workstation中的 Vaccuum prep tool 吸取 bead,将带有 bead 的 Vaccuum prep tool 先后放进 70% (V/V)乙醇、变性液(Denaturation Solution)、I Xffash Buffer 中清洗 IOs 左右，再将 Vaccuumprep tool放入含有49ul退火缓冲液及Iul测序引物(SEQ N03)的96孔板中，释放bead,将该96孔板放置于80°C 2min,再冷却至室温，即得到测序反应所需的单链纯化产物。4、结果分析。具体方法为测序结果与标准序列对比，得到DHFR(C829T)位点的碱基类型。DHFR部分标准序列为ACTCTTGTCTCTATCAGATACCATTTATGAGACATTCTT GCTATAACTAAGTGCTTCTCCAAGACCCCAACTGAGTCCCCAGCACCTGCTACAGTGAGCTGCCATTCCACACCCATCACATGTGGCACTCTTGCCAGTCCTTGACATTGTCGGGCTTTTCACATGTTGGTAATATTTATo 其中下划线部分为 829 位点。实施例3 临床样品检测
取待检的临床样品A、B、C，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。PCR产物纯化后进行测序，将所得序列与标准序列比对，判断结果。样品A的测序结果图如图I所示，测序结果为CTA￡AGTGAG，该样本是CC型(野生型)，图中红框部分是样本A基因型的判断区。
样品B的测序结果图如图2所示,测序结果为CTAC(T)AGTGAG,该样本是CT型(杂合型)，图中红框部分是样本B基因型的判断区。样品C的测序结果图如图3所示,测序结果为CTAIAGTGAG，该样本是TT型(突变纯合型)，图中红框部分是样本C基因型的判断区。
图4飞分别是样本A、B、C的sanger测序图谱。目的是为验证图广3的结果，最终发现两种测序检测结果一致。
权利要求
1.一种DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、单链纯化试剂和测序试剂，其特征在于 PCR试剂包括特异性扩增引物SEQ NO. I、SEQ NO · 2，其序列为SEQ NO. I ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC,SEQ NO. 2 =Biotin- AATGTCAAGGACTGGCAAGAG ； 测序试剂包括特异性测序引物SEQ NO. 3，其序列为SEQ NO. 3 :AGTCCCCAGCACCTG。
2.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂包括2*PCRBufferUOmMdNTP、5U/ul Taq酶、特异性扩增引物SEQ NO. I和SEQ NO . 2、灭菌水；所述单链纯化试剂包括链亲和素包被的磁珠、70% (V/V)乙醇、变性液、I XWash Buffer、结合缓冲液、退火缓冲液；所述测序试剂包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及dNTP。
3.如权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤 (1)提取样本中的DNA (2)以DNA为模板，依据所述的特异性扩增引物(SEQNO. I、SEQ NO. 2)进行PCR扩增； (3)将步骤(2)所得的PCR产物以所述的标记生物素的引物序列进行单链纯化； (4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行测序； (5)结果分析。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，步骤(2)的PCR反应按以下条件进行扩增94°C 2min 预变性；98°C 10s、58°C 30s,68°C 30s，40 个循环；68°C 5min。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，步骤(3)单链纯化的具体步骤为将得到的50ul PCR产物与3ul链亲和素包被的磁珠及47ul结合缓冲液混合，室温孵育l(Tl5min,期间震荡2 3次,然后使用Vaccuum prep tool吸取磁珠,将带有磁珠的Vaccuumprep tool先后放进70%(V/V)乙醇、变性液、I Xffash Buffer中清洗IOs左右，再将Vaccuumprep tool放入含有49ul退火缓冲液及Iul测序引物(SEQ NO. 3)的96孔板中，释放磁珠，将该96孔板放置于80°C 2min，再冷却至室温，即得到测序反应所需的单链纯化产物。
全文摘要
本发明公开了一种DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、单链纯化试剂和测序试剂,其特征在于PCR试剂包括特异性扩增引物SEQNO.1、SEQNO.2，其序列为SEQNO.1ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC；SEQNO.2Biotin-AATGTCAAGGACTGGCAAGAG；测序试剂包括特异性测序引物SEQNO.3，其序列为SEQNO.3AGTCCCCAGCACCTG。
文档编号C12Q1/68GK102876779SQ201210331289
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月10日 优先权日2012年9月10日
发明者陈奕磊, 汝昆, 徐建成, 王淑一, 孙翠莲 申请人:济南艾迪康医学检验中心有限公司