专利名称：一种可识别hcv ns5a蛋白的核酸适体、核酸适体的衍生物及其筛选方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于遗传工程技术领域，尤其涉及一种核酸适体、核酸适体的衍生物及其筛选方法和应用。
背景技术：
丙型肝炎病毒(HCV)感染是一种危害严重的全球性健康问题，全世界已有2亿感染者。据估计，每年新增感染者数为300 400万。我国约有4000万至5000万人感染 HCV，仅次于乙型肝炎携带者数量。目前，治疗丙型病毒肝炎的标准方法是采用干扰素或者干扰素联合利巴韦林治疗。在治疗感染基因型2型和3型HCV的患者中有75% 90%的HCV根除率，然而，仍有约50%的I型和4型HCV感染的病人不敏感。虽然加入利巴韦林能够增强持久的抗病毒应答水平，但也能带来严重的副作用(如溶血性贫血)，这些副作用常常导致20%的患者中断治疗。由于HCV基因组有极大的序列差异性，加之组合疗法的副作用大和治疗价格昂贵，急需开发新方法来有效治疗不同HCV基因型感染的肝病患者。核酸适体(Aptamer)是通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能高亲和性、高特异性结合生物靶标的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸适体的靶标包括多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别功能与抗体类似，识别能力与抗体分子相当甚至更强，但自身又具有许多显著优点，如分子量小、易保存、无免疫原性、容易合成标记、穿透组织能力强、化学稳定性好等，在抗病毒治疗领域具有重要的应用前景。作为一种严重危害人类健康的病毒，HCV编码约3100个氨基酸残基组成的多聚蛋白，该蛋白在宿主细胞信号肽酶和病毒蛋白酶作用下，可裂解产生10种HCV蛋白包括结构蛋白Core,EI和E2、p7蛋白，以及非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。其中，非结构蛋白NS5A的功能至今仍不十分明确，近年来的研究表明其定位于内质网膜的细胞质侧，存在基础磷酸化与过磷酸化两种形式(P56和P58)，过磷酸化位点为ser2197，ser2201和/或ser2204,并且含有已知的干扰素敏感性决定区域(IFN sensitivity determiningregion，ISDR)。越来越多的研究表明NS5A可能是影响和调控HCV复制的关键蛋白，尤其是磷酸化形式对HCV的复制有着重要的影响。Min Gao等(Min Gao, Richard E. Nettles,Makonen Belemaj et al. Chemical genetics strategy identifies an HCV NS5Ainhibitor with a potent clinical effect. Nature，2010;465:96-100)用化学遗传学方法筛选出了特异性抑制NS5A蛋白的小分子有机化合物抑制剂BMS-790052，并且该抑制剂能非常有效地抑制HCV的基因组复制。因此，以HCV NS5A蛋白作为特定靶点筛选与其特异结合的核酸适体，然后从这些特异识别靶标的核酸适体中，挑选出特异性结合NS5A蛋白功能结构域的抑制HCV复制的核酸适体，具有非常重要的医学价值，这将为丙型病毒性肝炎及其他肝病药物的开发开辟新的途径。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能有效结合并封闭NS5A蛋白的活性位点、进而抑制HCV复制、并具有显著抗HCV感染能力的核酸适体及其衍生物，并相应提供易于制备、成本低廉的该核酸适体的筛选方法和应用。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种可识别HCV NS5A蛋白的核酸适体，其为SEQ ID NO 5序列所示的DNA片段。上述技术方案中，SEQ ID NO 5序列的DNA片段如下
核酸适体序列5 (以下简称NS5A-5):
5’ - CTGGATCGAAAAGTATCCACGTTTGTCTGAAAATAGTGGC -3’。作为一个总的技术构思，本发明还同时筛选得到了与上述核酸适体序列5具有相同功能的其他四条核酸适体序列
核酸适体序列I (以下简称NS5A-1)
5’ - ACGTACACTAGTGGTCCGGGCGGGGCTCATTGTCC -3’ ；
核酸适体序列2 (以下简称NS5A-2)
5’ - GCGGATTGTCCATTGAACCTTCGTCAACTATGCCG -3’ ；
核酸适体序列3 (以下简称NS5A-3)
5’ - CACGCCAGACCAGCCGTCCTCTCTTTATCCGAGCCTTCATCCGAG -3’ ；
核酸适体序列4 (以下简称NS5A-4)
5’ - GCTATCTTATGGAAATTTCGTGTAGGGTTTGGTGTGGCGGGGCTA -3’。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述核酸适体的衍生物，该衍生物可以为以下a d中的任意一种
a)将所述核酸适体进行核苷酸取代后得到的RNA核酸适体；
b)将所述核酸适体骨架改造为硫代磷酸酯骨架后得到的核酸适体衍生物；
c)将所述核酸适体改造为肽核酸后得到的核酸适体衍生物；
d)将所述核酸适体连接上放射性分子(或者其他的肝癌治疗药物)后得到的核酸适体衍生物。需要说明的是，上述各种衍生物应当具有本发明所述核酸适体相类似的功能，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的核酸适体的筛选方法，包括以下步骤
(O制备丙型肝炎病毒NS5A蛋白以PJFHl质粒作为PCR扩增的模板，用第一引物对NS5A基因进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；用限制性酶Nde I和Hind III双酶切所述的PCR扩增产物，获得酶切产物；用限制性酶Nde I和Hind III双酶切原核表达载体pET28b，回收载体骨架；将所述酶切产物和载体骨架连接，得到连接产物；将该连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，用含卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取得到重组质粒pET28b-NS5A ;再经过大量表达及纯化过程，制得带组氨酸标签的丙型肝炎病毒NS5A蛋白；
(2)制备对照蛋白LacZ:用pET200/D/LacZ蛋白的编码基因与载体上的组氨酸标签的编码基因融合，表达带组氨酸标签的pET200/D/LacZ蛋白；再经过大量表达及纯化过程，制得带组氨酸标签的pET200/D/LacZ蛋白；
(3)蛋白的固定取Ni-NTA琼脂糖微珠，经预处理后分别分散于步骤(I)制得的带组氨酸标签的丙型肝炎病毒NS5A蛋白和步骤(2)制得的带组氨酸标签的pET200/D/LacZ蛋白中，经孵育、洗涤后分别得到固定有靶标蛋白的微珠和固定有对照蛋白的微珠；
(4)随机核酸文库的设计设计两端包含20个核苷酸、中间包括40个核苷酸的随机核酸文库如下5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAG (N40) CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’;其中，N40 表示40个随机核苷酸；
(5)核酸适体的筛选
A)DNA文库预处理将步骤(4)设计的随机核酸文库溶于结合缓冲液中；
B)反筛将步骤(3)制得的固定有对照蛋白的微珠与所述预处理后的随机核酸文库混合，孵育、洗涤后再进行超滤离心；
C)正筛将上述超滤离心后的溶液与步骤(3)制得的固定有靶标蛋白的微珠混合，经过孵育、洗涤后转移微珠，再将转移后的微珠进行加热、冷却和离心，收集上清，以上清液中的DNA为模板并利用生物素标记的第二引物对进行PCR扩增，扩增后通过亲和素包被的葡聚糖珠分离生物素标记的PCR扩增产物，然后使双链DNA变性解链，收集生物素标记的DNA单链，脱盐后用于下一轮筛选；
D)反复筛选重复上述步骤B 步骤C，在重复筛选过程中逐步增加筛选压力，经过多轮反复筛选后，以筛选产物为模板通过第三引物对进行PCR扩增，获得竞争能力强、序列长度得到优化的核酸适体。上述的核酸适体的筛选方法中，所述步骤(I)中选用的第一引物对优选是指以下序列的引物对
上游引物5’ - CGCGCCATATGTCCGGATCCTGGCTCCGCGAC -3’ 和 下游引物5’ - CTGCAGAAGCTTTCAGCAGCACACGGTGGTATCG -3’。上述的核酸适体的筛选方法中，所述步骤(5)中选用的第二引物对优选是指以下序列的引物对
FITC-5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAG-3’ 和Biotin-5’ - GTCACCAGCACGTCCATGAG- 3’。上述的核酸适体的筛选方法中，所述步骤(5)中选用的第三引物对优选是指以下序列的引物对
5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAG-3’ 和5’ - GTCACCAGCACGTCCATGAG-3’。上述的核酸适体的筛选方法中，所述步骤(I)和步骤(2)的大量表达及纯化过程优选包括以下步骤
先用相应的重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，得到重组菌；然后将重组菌接种到LB培养基，37°C振荡培养过夜，再按一定体积比转接到含卡那霉素的LB培养基中，37°C振摇培养数小时，加入异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)继续培养诱导至少12h ;离心收集菌体，在含溶菌酶的结合缓冲液中超声破碎，离心，收集裂解上清；将裂解上清上样于镍离子偶联的琼脂糖黏附柱，用洗涤缓冲液洗涤去除杂蛋白，用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，得到带组氨酸标签的丙型肝炎病毒NS5A蛋白或带组氨酸标签的pET200/D/LacZ蛋白。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的核酸适体或者其衍生物在制备丙型肝炎病毒NS5A蛋白检测试剂盒或丙型肝炎病毒NS5A蛋白诊断试剂中的应用。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的核酸适体或者其衍生物在制备用于抑制丙型肝炎病毒在肝细胞内复制的试剂中的应用。与现有技术相比，本发明的优点在于本发明旨在通过原核表达技术表达丙型肝炎病毒(HCV) NS5A蛋白，并利用SELEX技术筛选出特异性结合NS5A蛋白的核酸适体，经实验和研究表明，利用本发明的核酸适体，并借助有效的传递载体将其导入被HCV感染的肝
细胞，该核酸适体便能有效结合并封闭NS5A蛋白的活性位点，进而影响NS5A蛋白参与HCV基因组复制的生理功能，以达到抑制HCV复制的治疗效果。本发明提供的上述核酸适体是包括有多种不同序列组成的单链DNA，上述各种序列的核酸适体均能够起到抑制HCV复制的显著效果，具有低成本、高效、特异抑制HCV感染等功能；通过修饰或改造该核酸适体还可得到用于HCV诊断和临床治疗的各种衍生物，以解决目前HCV治疗方法存在的成本高、副作用大且对部分患者无治疗效果等问题。总的来说，本发明的核酸适体易制备、成本低、易保存、具有显著的抗病毒感染能力，具有广阔的应用前景。
图I为本发明实施例中带组氨酸标签的丙型肝炎病毒NS5A蛋白的western-blot表征图。图2为本发明实施例中带组氨酸标签的LacZ蛋白的western-blot表征图。图3为本发明实施例中NS5A核酸适体对HCV复制的抑制效果对比图。
具体实施例方式以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步描述，以便于更好地理解本发明，但并不因此而限定本发明。如无特别说明，下述实施例中所用的原材料均购自常规生化试剂公司，实施例中的各定量实验均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例可识别HCV NS5A蛋白的核酸适体、核酸适体的衍生物及其筛选方法和应用。I.相关蛋白的制备。I. I带组氨酸标签的丙型肝炎病毒NS5A蛋白(即靶标蛋白)的制备。I. I. I HCV NS5A蛋白的编码基因的扩增
以PJFHl质粒作为PCR扩增的模板，用以下引物I和引物2组成的第一引物对NS5A基因进行PCR扩增(PCR试剂购自Roche公司、100微升PCR管购自Eppendorf公司)
引物I (上游引物)
5’ - CGCGCCATATGTCCGGATCCTGGCTCCGCGAC -3’ ；
引物2 (下游引物)5’ - CTGCAGAAGCTTTCAGCAGCACACGGTGGTATCG -3’ ；
上、下游引物的5’端分别引入Nde I酶切位点和Hind III酶切位点；
PCR 扩增条件为95 0C, 2min ；95 °C, 30s,66 °C, 30s, 72 °C, I. 5min，35 个循环；72 °C,7min ；PCR扩增完成后得到PCR扩增产物。I. 1.2原核表达载体的构建
I. I. 2. I用限制性酶Nde I和Hind III双酶切步骤I. I. I得到的PCR扩增产物，进而获得酶切产物；
I. I. 2. 2用限制性酶Nde I和HindIII双酶切原核表达载体pET28b vectorCInvitrogen公司)，回收载体骨架；
I. I. 2. 3将步骤I. I. 2. I得到的酶切产物和步骤I. I. 2. 2得到的载体骨架连接，得到连 接产物；
I. I. 2. 4将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞(鼎国公司)，用含卡那霉素(Kana)的LB平板(LB培养基购自鼎国公司，下同)筛选阳性克隆，提取质粒依次进行酶切鉴定和测序鉴定；
测序结果表明，上述步骤I. I. 2. I I. I. 2. 4得到了重组质粒pET28b-NS5A ;在Nde I和BamHl酶切识别位点之间插入了 NS5A目的序列，且序列准确无误。I. I. 3带组氨酸标签的丙型肝炎病毒NS5A蛋白的原核表达鉴定
I. I. 3. I将以上步骤I. I. 2得到的重组质粒pET28b-NS5A转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞(InvitiOgen公司)，用含卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆；
I.I. 3. 2挑取阳性克隆于LB液体培养基，37°C振摇过夜，加入IPTG (终浓度lmmol/L)继续培养诱导IOh ；
I.I. 3. 3在13000rpm条件下离心Imin,收集菌体进行SDS-PAGE电泳和Western blot。Western blot的一抗为anti-his (购自Sigma公司);Western blot的结果见图I,结果表明，菌体中含有带组氨酸标签的丙型肝炎病毒NS5A蛋白。I. I. 4带组氨酸标签的丙型肝炎病毒NS5A蛋白的大量表达、纯化及检测
I.I. 4. I将重组质粒pET28b-NS5A转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，得到重组菌；
I.1.4. 2将步骤I. 1.4. I得到的重组菌接种LB培养基，37°C振荡培养过夜，按I : 50的体积比转接到含10 μ g/ml卡那霉素的LB培养基中，37°C振摇培养约2h(使0D600为0. 6
0.8)，加入IPTG (终浓度lmmol/L)继续培养诱导12h ；
I.I. 4. 3在3500rp条件下离心收集菌体,在含100 μ g/ml溶菌酶(鼎国公司)的startbuffer (0. 02M磷酸钠，0. 5M NaCl, ρΗ7· 4)中超声破碎(频率120w，每个循环内超声3s停3s, 400个循环,在冰浴上进行),4°C、IOOOOrpm离心IOmin,收集裂解上清；
I.I. 4. 4将裂解上清上样于Ni-NTA偶联的琼脂糖黏附柱(购自GE公司),用washingbuffer(0. 02M憐酸钠，0. 5M NaCl, 0. 05M 咪唑，pH7. 4)洗漆去除杂蛋白，用 elution buffer(0. 02M磷酸钠，0. 5M NaCl,0. 5M咪唑，pH7. 4)洗脱目的蛋白，得到带组氨酸标签的丙型肝炎病毒NS5A蛋白。I. 2带组氨酸标签的对照蛋白LacZ的制备
I.2. I 将 pET200/D/LacZ (质粒 pET200/D/LacZ 购自 Invitrogen 公司)蛋白的编码基因与载体上的组氨酸标签的编码基因融合，表达带组氨酸标签的pET200/D/LacZ蛋白。
I. 2. 2带组氨酸标签的pET200/D/LacZ蛋白的原核表达鉴定
I. 2. 2. I将重组质粒pET200/D/LacZ转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，用含卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆；
I. 2. 2. 2挑取阳性克隆于LB液体培养基，37°C振摇过夜，加入IPTG (终浓度lmmol/L)继续培养诱导IOh ；
1.2. 2. 3在13000rpm条件下离心Imin,收集菌体进行SDS-PAGE电泳和Western blot,Western blot的一抗为anti-his (购自Sigma公司),Western blot的结果见图2,结果表明，菌体中含有带组氨酸标签的pET200/D/LacZ蛋白。I. 2. 3用重组质粒pET200/D/LacZ代替重组质粒pET28b_NS5A，其它操作与步骤 I.I中的步骤I. I. 4相同，得到带组氨酸标签的pET200/D/LacZ蛋白。2.核酸适体的筛选和制备。2. I蛋白的固定
2.I. I取镍离子琼脂糖微珠(QIAGEN公司)置于5ml离心管中，移走上清，PBS缓冲液(Hyclone公司)洗漆三次；
2.I. 2将步骤2. I. I得到的微珠分别和步骤I. I制得的带组氨酸标签的丙型肝炎病毒NS5A蛋白(即靶标蛋白)或步骤I. 2制得的带组氨酸标签的pET200/D/LacZ蛋白(即对照蛋白)混合均匀，室温孵育lh，PBS缓冲液离心洗涤三次，得到固定有靶标蛋白的微珠和固定有对照蛋白的微珠；
2.I. 3将步骤2. I. 2得到的微珠重新分散于Iml PBS缓冲液中，置于4°C备用。2. 2随机核酸文库的设计
设计两端包含20个核苷酸、中间包括40个核苷酸的随机核酸文库如下
5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAG (N40 ) CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’ ；
MO代表40个随机核苷酸。2. 3核酸适体的筛选
2.3. I DNA文库预处理将随机核酸文库溶于结合缓冲液中；
2.3.2反筛将随机核酸文库与步骤2. I. 2制得的固定有对照蛋白的微珠混合，37°C孵育I 2小时；经结合缓冲液洗涤后，将微珠通过超滤离心；
2.3. 3正筛将反筛过程中超滤离心的溶液加入步骤2. I. 2制得的固定有靶标蛋白的微珠中，37°C孵育I 2小时；将微珠通过超滤离心洗涤后，用灭菌水将微珠转移到离心管中；将微珠经95°C加热lOmin、冰上冷却lOmin、高速离心后，收集上清液并以其中的DNA为模板，用含FITC或生物素标记的第二对引物(FITC-5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAG-3’和Biotin-5’ - GTCACCAGCACGTCCATGAG- 3’)进行PCR扩增；扩增后通过亲和素包被的葡聚糖珠分离生物素标记的PCR产物，然后利用0. 2M的氢氧化钠使双链DNA变性解链，收集FITC标记的DNA单链，这些DNA单链脱盐后用于下一轮筛选；
2.3. 4反复筛选为了获得高亲和性和特异性结合靶标蛋白的核酸适体，在筛选的过程中逐步改变反筛和正筛的蛋白量、筛选时间、筛选溶液中tRNA含量以及正筛洗涤次数，以增加筛选压力；经过八轮的反复筛选后，以筛选产物为模板并通过第三对引物(5，-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3’ 和 5’ - GTCACCAGCACGTCCATGAG-3’ )进行 PCR 扩增，将 PCR产物进行测序；这样得到的核酸适体较长，经结构分析后，设计并合成一系列经截短的核酸序列，与荧光染料修饰的全长核酸适体进行竞争反应，挑选竞争能力最强的结合序列用于进一步的应用。经过上述的筛选、优化，最终得到截短的核酸适体(NS5A)序列如下
NS5A-1 :5’ - ACGTACACTAGTGGTCCGGGCGGGGCTCATTGTCC -3’ ；
NS5A-2 :5’ - GCGGATTGTCCATTGAACCTTCGTCAACTATGCCG -3’ ；
NS5A-3 :5’ - CACGCCAGACCAGCCGTCCTCTCTTTATCCGAGCCTTCATCCGAG-3’ ；
NS5A-4 :5’ - GCTATCTTATGGAAATTTCGTGTAGGGTTTGGTGTGGCGGGGCTA -3’ ；
NS5A-5 :5’ - CTGGATCGAAAAGTATCCACGTTTGTCTGAAAATAGTGGC-3’。3.核酸适体NS5A (NS5A aptamers)试剂对HCV感染Huh7. 5细胞的抑制作用。
3. I细胞培养
Huh7. 5. 5细胞(被HCV感染的阳性细胞)培养在6孔细胞培养板(30万/孔)中，生长24h后待处理。3. 2核酸适体NS5A及核酸适体文库(Library)进入Huh7. 5. 5细胞
用 Lipofectamine 2000 (购自 Invitrogen 公司)转染相应浓度的 Library 和 NS5Aaptamers进入Huh7. 5. 5细胞，培养24h后换新鲜培养基，继续培养24h。3. 3核酸适体NS5A抑制HCV复制的定量分析
用TRIZOL法提取步骤3. 2中的细胞总RNA，然后将总RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，对各样品进行相对定量，数据处理和汇总后的结果如图3所示。结果表明，不管是用低浓度的IOnM核酸适体处理，还是用高浓度IOOnM核酸适体处理，对比核酸适体文库(Library),各不同序列的本发明NS5A核酸适体(NS5A-1 NS5A-5 aptamer)都能显著性地抑制HCV基因组的复制(T-Test检测)；并且用高浓度IOOnM核酸适体处理Huh7. 5. 5细胞，比用低浓度IOnM核酸适体处理的抑制效果会更明显。以上实验结果为三次以上重复实验所得。综合以上实验数据和结果表明以NS5A蛋白为靶分子的NS5A-1 NS5A-5aptamer具有非常强的抑制HCV基因复制的生物学效果，相应的该核酸适体试剂能够有效阻断HCV病毒在细胞内的繁殖和扩增，这为开发制备用于治疗丙型病毒肝炎及肝癌的药物奠定了良好的基础，对于HCV在细胞内复制机制研究和抗HCV新方法的建立等领域具有重要的科学实用价值，具有广阔的医学应用及市场前景。利用上述的可识别HCV NS5A蛋白的核酸适体分别制备以下四种衍生物
a)将本实施例的各核酸适体进行核苷酸取代后得到的RNA核酸适体；
b)将本实施例的各核酸适体骨架改造为硫代磷酸酯骨架后得到的核酸适体衍生物；
c)将本实施例的各核酸适体改造为肽核酸后得到的核酸适体衍生物；
d)将本实施例的各核酸适体连接上放射性分子后得到的核酸适体衍生物。很明显，通过常规实验可以发现，上述核酸适体的衍生物具有与上述核酸适体相类似的功能和效果。
权利要求
1.一种可识别HCV NS5A蛋白的核酸适体，其为SEQ ID NO :5序列所示的DNA片段。
2.一种如权利要求I所述核酸适体的衍生物，该衍生物为以下a d中的任意一种 a)将所述核酸适体进行核苷酸取代后得到的RNA核酸适体； b)将所述核酸适体骨架改造为硫代磷酸酯骨架后得到的核酸适体衍生物； c)将所述核酸适体改造为肽核酸后得到的核酸适体衍生物； d)将所述核酸适体连接上放射性分子后得到的核酸适体衍生物。
3.—种如权利要求I所述的核酸适体的筛选方法，包括以下步骤 (1)制备丙型肝炎病毒NS5A蛋白以PJFHI质粒作为PCR扩增的模板，用第一引物对NS5A基因进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；用限制性酶Nde I和Hind III双酶切所述的PCR扩增产物，获得酶切产物；用限制性酶Nde I和Hind III双酶切原核表达载体pET28b，回收载体骨架；将所述酶切产物和载体骨架连接，得到连接产物；将该连接产物转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，用含卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取得到重组质粒pET28b-NS5A ;再经过大量表达及纯化过程，制得带组氨酸标签的丙型肝炎病毒NS5A蛋白； (2)制备对照蛋白LacZ:用pET200/D/LacZ蛋白的编码基因与载体上的组氨酸标签的编码基因融合，表达带组氨酸标签的pET200/D/LacZ蛋白；再经过大量表达及纯化过程，制得带组氨酸标签的pET200/D/LacZ蛋白； (3)蛋白的固定取Ni-NTA琼脂糖微珠，经预处理后分别分散于步骤(I)制得的带组氨酸标签的丙型肝炎病毒NS5A蛋白和步骤(2)制得的带组氨酸标签的pET200/D/LacZ蛋白中，经孵育、洗涤后分别得到固定有靶标蛋白的微珠和固定有对照蛋白的微珠； (4)随机核酸文库的设计设计两端包含20个核苷酸、中间包括40个核苷酸的随机核酸文库如下5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAG (N40) CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’;其中，N40 表示40个随机核苷酸； (5)核酸适体的筛选 A)DNA文库预处理将步骤(4)设计的随机核酸文库溶于结合缓冲液中； B)反筛将步骤(3)制得的固定有对照蛋白的微珠与所述预处理后的随机核酸文库混合，孵育、洗涤后再进行超滤离心； C)正筛将上述超滤离心后的溶液与步骤(3)制得的固定有靶标蛋白的微珠混合，经过孵育、洗涤后转移微珠，再将转移后的微珠进行加热、冷却和离心，收集上清，以上清液中的DNA为模板并利用生物素标记的第二引物对进行PCR扩增，扩增后通过亲和素包被的葡聚糖珠分离生物素标记的PCR扩增产物，然后使双链DNA变性解链，收集生物素标记的DNA单链，脱盐后用于下一轮筛选； D)反复筛选重复上述步骤B 步骤C，在重复筛选过程中逐步增加筛选压力，经过多轮反复筛选后，以筛选产物为模板通过第三引物对进行PCR扩增，获得竞争能力强、序列长度得到优化的核酸适体。
4.根据权利要求3所述的核酸适体的筛选方法，其特征在于 所述步骤(I)中选用的第一引物对是指以下序列的引物对5’ - CGCGCCATATGTCCGGATCCTGGCTCCGCGAC -3’ 和5’ - CTGCAGAAGCTTTCAGCAGCACACGGTGGTATCG -3’ ； 所述步骤(5)中选用的第二引物对是指以下序列的引物对FITC-5’ - ACGCTCGGATGCCACTACAG -3’ 和Biotin-5’ - GTCACCAGCACGTCCATGAG - 3’ ； 所述步骤(5)中选用的第三引物对是指以下序列的引物对5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAG-3’ 和 5’ - GTCACCAGCACGTCCATGAG-3’。
5.根据权利要求3或4所述的核酸适体的筛选方法，其特征在于，所述步骤(I)和步骤(2)的大量表达及纯化过程包括以下步骤 先用相应的重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，得到重组菌；然后将重组菌接种到LB培养基，37°C振荡培养过夜，再按一定体积比转接到含卡那霉素的LB培养基中，37°C振摇培养数小时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷继续培养诱导至少12h ;离心收集菌体，在含溶菌酶的结合缓冲液中超声破碎，离心，收集裂解上清；将裂解上清上样于镍离子偶联的琼脂糖黏附柱，用洗涤缓冲液洗涤去除杂蛋白，用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，得到带组氨酸标签的丙型肝炎病毒NS5A蛋白或带组氨酸标签的pET200/D/LacZ蛋白。
6.一种如权利要求I所述的核酸适体或者如权利要求2所述的衍生物在制备丙型肝炎病毒NS5A蛋白检测试剂盒或丙型肝炎病毒NS5A蛋白诊断试剂中的应用。
7.—种如权利要求I所述的核酸适体或者如权利要求2所述的衍生物在制备用于抑制丙型肝炎病毒在肝细胞内复制的试剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种可识别HCV NS5A蛋白的核酸适体，其为SEQIDNO5序列所示的DNA片段，其衍生物为包括核苷酸取代后的RNA核酸适体、骨架改造后的衍生物、改造为肽核酸后的衍生物以及连接上放射性分子后的衍生物。该核酸适体的筛选方法包括先制备带组氨酸标签的丙型肝炎病毒NS5A蛋白，再制备带组氨酸标签的pET200/D/LacZ蛋白；然后对蛋白进行固定，并设计随机核酸文库；最后进行核酸适体的筛选，筛选过程具体又包括DNA文库预处理、反筛、正筛及反复筛选等步骤，最后获得竞争能力强、序列长度得到优化的核酸适体。本发明的核酸适体及其衍生物可用于制备丙型肝炎病毒NS5A蛋白的检测试剂盒或诊断试剂，还可用于制备抑制丙型肝炎病毒在肝细胞内复制的试剂。
文档编号C12Q1/70GK102864150SQ20121037723
公开日2013年1月9日 申请日期2011年6月3日 优先权日2011年6月3日
发明者朱海珍, 方晓红, 刘斌, 杨大荣, 徐丽, 雷少华, 刘念礼 申请人:湖南大学