专利名称：一对丽蚜小蜂特异性scar引物及快速pcr检测方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及一对丽蚜小蜂特异性SCAR引物及快速PCR检测方法和试剂盒。
背景技术：
丽姆小蜂Encarsia formosa Gahan,属膜翅目、姆小蜂科、恩姆小蜂属，是烟粉風、温室粉虱的主要寄生性天敌之一。丽蚜小蜂于1927年首次在英国发现并用于防治温室粉虱，此后，欧洲各国便开始利用丽蚜小蜂防控温室粉虱的研究。如英国的英格兰和威尔士地区，在1976年应用丽蚜小蜂防治温室粉虱的面积就已经达到139. 4ha.，约占当时温室种植番茄、黄瓜面积的72%，并取得了令人满意的结果，防效达7217%。我国于1978年由中国农业科学院生物防治研究室从英国引进丽蚜小蜂，之后对该蜂的生物学和生态学习性及其与寄主之间的关系等进行了系列研究，丽蚜小蜂的商品化生产技术、田间应用方法及效果评价模式等日臻成熟，并取得了很好的防治效果。如，当温室粉虱种群密度为0. 5头/株时，每平方千米释放15万头丽蚜小蜂(分3-4次释放)，其防治效果可达95. 4%。由于丽蚜小蜂具有安全性能高、控害效果好、适应能力强且成本低廉等特点，目前已成为世界广泛商品化的用于防治温室作物粉虱不可或缺的重要寄生性天敌种类。丽蚜小蜂体型微小，成虫体长0. 59、. 68mm,与其他常见的寄生蜂种类如浅黄恩蚜小蜂、海氏桨角蚜小蜂等形态相似，而且成虫前的各个虫态(包括卵、幼虫、蛹)均在寄主体内度过。鉴于粉虱类害虫的寄生蜂种类较多，而丽蚜小蜂是其重要寄生性天敌之一，因此快速准确地识别丽蚜小蜂是其寄主谱确定及其对不同种类粉虱控制效果评价的必要前提。目前国际上用于丽蚜小蜂鉴定的方法主要有1)形态特征鉴定；2)AFLP技术等。但目前国内针对丽蚜小蜂尚没有标准的检测方法。AFLP技术曾用于丽蚜小蜂及其近缘种鉴别。AFLP技术是RFLP技术与PCR技术相结合的产物，亦即，先行利用限制性内切酶水解基因组DNA，使之产生不同大小的DNA片段，然后再使双链人工接头的酶切片段相连接，并以此作为扩增反应的模板DNA ;之后，以人工接头的互补链作为引物进行预扩增；最后，在接头互补链的基础上添加广3个选择性核苷酸作为引物，并对模板DNA再次进行选择性扩增，之后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的DNA扩增片段，并根据扩增片段长度的不同检测出多态性。SCAR-PCR技术检测是在RAPD技术的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用特异性的引物，根据预期DNA条带的有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且重现性和稳定性强等优点。
发明内容
本发明的目的为提供一对丽蚜小蜂特异性SCAR引物。本发明的再一目的为提供一种丽蚜小蜂特异性片段。
本发明的另一目的为提供一种丽蚜小蜂的特异性快速检测方法。本发明的再一目的为提供一种丽蚜小蜂的特异性快速检测试剂盒。本发明根据丽蚜小蜂的基因组DNA序列，设计一对种特异性引物，该引物只对丽蚜小蜂具有扩增能力。是对丽蚜小蜂AFLP技术检测方法的补充和改进。同时，本发明采用SCAR PCR技术，提高了检测的准确性和灵敏度，节约了检测时间，在丽蚜小蜂监测检测方面具有重要的应用价值，可以试剂盒的形式在保护地及露地丽蚜小蜂种类鉴别、寄主谱筛选及其有效利用中推广。根据本发明的一对丽蚜小蜂特异性SCAR引物为引物EFZZF :5' -AATCGTCGTGTCAGGGAG-3' (SEQ ID No.1);和 引物EFZZR :5' -GCCGTGGCGTTTAGTATG-3' (SEQ ID No. 2)。根据本发明的丽蚜小蜂种特异性检测方法包括使用上述SCAR引物进行PCR扩增的步骤；或者包括使用探针与上述特异性片段进行杂交的步骤。根据本发明的丽蚜小蜂种特异性检测试剂盒包括上述丽蚜小蜂特异性SCAR引物，和/或用于检测上述特异性片段的探针。本领域普通技术人员利用分子杂交技术进行丽蚜小蜂种特异性检测时，可以根据本领域的公知常识设计与本申请的丽蚜小蜂特异性片段(SEQ ID No. 3所示)特异性杂交的探针。本发明的丽蚜小蜂种特异性SCAR引物及快速检测方法，用于快速检测丽蚜小蜂。与国际现有方法相比，本发明具有以下的技术优势I)检测准确性高。本发明根据丽蚜小蜂种特异性SCAR标记设计的引物EFZZF和EFZZR，在PCR快速检测丽蚜小蜂时，可扩增出287bp的片段，不仅对丽蚜小蜂的单头成虫、蛹和3龄幼虫可以进行检测，对于单粒卵也能准确检测。2)操作简便快捷。本发明采用PCR技术，操作过程简单、快速、高效。一般整个过程可在5个小时内完成。3)特异性强。本发明设计的引物可特异性检测丽蚜小蜂，在其近缘种、属蚜小蜂及其主要粉虱类寄主昆虫中无扩增产物。因此本方法实用性强，可满足自然资源保护及寄生蜂监测/检测的需要。
图1为引物EFZZF/EFZZR对丽蚜小蜂及其近缘种属蚜小蜂和主要粉虱类(包括不同生物型(B型、Q型、ZHJ-1型、ZHJ-2型)的烟粉虱、温室粉虱和黑刺粉虱等)寄主害虫的SCAR PCR扩增结果，M:分子量标准Trans2K ；1: _姆小蜂Encarsia formosa Gahan ；2:浅黄恩姆小蜂；3:海氏桨角姆小蜂；4:本地种桨角姆小蜂Eretmocerus sp. ；5:蒙氏桨角姆小蜂；6:刺粉虱黑蜂；7:B型烟粉虱；8:Q型烟粉虱；9:ZHJ-1型烟粉虱；10:ZHJ-2型烟粉虱；11:温室粉虱；12:黑刺粉虱；13:阴性对照(超纯水)。图2为引物EFZZF/EFZZR对丽蚜小蜂不同虫态的SCAR PCR扩增结果，M:分子量标准Trans2K ；1:雌性成虫；2:蛹；3:三龄幼虫；4:单粒卵；8:阴性对照(超纯水)。图3为引物EFZZF/EFZZR对丽蚜小蜂检测阈值的测定，
M:分子量标准 Trans2K ;l-9 分别为 1:1/100; 2:1/200; 3:1/400; 4:1/800; 5:1/1600; 6:1/3200; 7:1/6400; 8:1/12800; 9:1/25600; 10:阴性对照(超纯水)。
具体实施例方式实施例1 :引物EFZZF/EFZZR对丽蚜小蜂的扩增效果I)丽蚜小蜂DNA的制备将单头蚜小蜂置于滴有20 ii L提取缓冲液(50mM Tris-HCl, ImM EDTA、1%SDS、20mMNaCl, pH 8.0)的parafilm膜上，以0. 2mL的PCR管底部作为匀浆器充分研磨，匀浆液以微量移液器移入1. 5mL离心管；然后以200 u L缓冲液分2次清洗匀浆器，移入同一离心管，混匀，加入5iiL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后于60° C水浴Ih(中途混匀I次)；然后沸水浴5min,加入220 u L氯仿/异戊醇(V: V=24:1)抽提液,轻柔混匀数十次后,冰上放置30min ;4° C、12000r/min离心20min,取上清液,加入440 u L预冷的无水乙醇,轻轻混 匀，待出现少量絮状沉淀后于-30° C放置30min ;4° C、12000r/min离心15min，小心弃去上清液。加入500 ii L预冷的75%乙醇洗漆,4° C、12000r/min离心15min,小心弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后每管加入20 y L超纯水，充分溶解后于-30° C保存备用。2)检验丽蚜小蜂的特异性引物的合成Primer EFZZF :5' -AATCGTCGTGTCAGGGAG-3'Primer EFZZR 5/ -GCCGTGGCGITTAGTATG-3'由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。3) PCR扩增反应反应体系为20iiL，其中 10XPCR buffer 2. 0 u L, dNTP (IOmM)1. 6u L,MgCl2 (2. 5mM)1. 2 y L、Taq 聚合酶(5U/ y L) 0.1 y L、上游引物和下游引物(10 y M)各0. 5u L、模板 DNA l.Ou L、超纯水 13.1 u L。4) PCR扩增程序94。C 预变性 5min ;30 个循环94。C 30sec、58。C 30sec、72。C 50sec ;最后72。C 延伸 5min。5) PCR产物的鉴定取4 ii L PCR产物用1. 5% (重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。结果利用引物EFZZF/EFZZR以丽蚜小蜂基因组DNA为模板，以浅黄恩蚜小蜂、海氏桨角虫牙小蜂、本地种桨角姆小蜂Eretmocerus sp.、蒙氏桨角姆小蜂、刺粉風黑蜂等5种其他常见种类的蚜小蜂，以及烟粉虱(包括B型、Q型、ZHJ-1型、ZHJ-2型)、温室粉虱和黑刺粉虱等主要粉虱类寄主昆虫为对照，进行SCAR PCR扩增。在I泳道的丽蚜小蜂中扩增出了 287bp的目的条带(见附图1的I泳道)，在其他5种近缘种、属的蚜小蜂及其主要粉虱类寄主昆虫中均无扩增产物。说明我们所筛选的来自丽蚜小蜂基因组DNA的特异性SCAR PCR扩增引物的特异性强。SEQ ID No. 3
aatcgtcgtg tcagggagcg aggaataaaa aaaggcagag acaagacgca cggtagctgc 60gtcttcattc ttaaatggat ttttaataca cattcctgag gggagagaat gaaaaaataa120atggattcgt agctacgata agtggagcaa ggtcaatgtt tccgagtcga tctagagatc180caggattgac gggtctggaa gatacggatg ctttgttttt aatcgcgtcg ttcgaattaa240·
tttacacaaa tttgagccta cgagtctcac atactaaacg ccacggc287实施例2 :引物EFZZF/EFZZR对丽蚜小蜂不同虫态的扩增效果I)丽蚜小蜂模板DNA的制备将不同虫态的单头/单粒丽蚜小蜂置于滴有20 ii L提取缓冲液(50mMTris_HCl、lmM EDTA、l%SDS、20mMNaCl, pH 8. 0)的 parafilm 膜上，以 0. 2mL 的 PCR 管底部作为匀浆器充分研磨，匀浆液以微量移液器移入1. 5mL离心管；然后以200 u L缓冲液分2次清洗匀浆器，移入同一离心管，混勻，加入5 u L蛋白酶K(20mg/mL),充分混勻后于60° C水浴Ih (中途混匀I次);然后沸水浴5min，加入220 y L氯仿/异戊醇(V: V=24:1)抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置30min ;4° C、12000r/min离心20min，取上清液，加入440 u L预冷的无水乙醇，轻轻混匀，待出现少量絮状沉淀后于-30° C放置30min ;4° C、12000r/min离心15min,小心弃去上清液。加入500 u L预冷的75%乙醇洗漆,4° C、12000r/min离心15min,小心弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后每管加入20ii L超纯水，充分溶解后于-20° C保存备用。2)检验丽蚜小蜂的特异性引物的合成Primer EFZZF :5' -AATCGTCGTGTCAGGGAG-3'Primer EFZZR 5/ -GCCGTGGCGITTAGTATG-3'由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。3) PCR扩增反应反应体系为20iiL，其中 10XPCR buffer 2. 0 u L, dNTP (IOmM)1. 6u L,MgCl2 (2. 5mM)1. 2 y L、Taq 聚合酶(5U/ y L) 0.1 y L、上游引物和下游引物(10 y M)各0. 5u L、模板 DNA l.Ou L、超纯水 13.1 u L。4) PCR扩增程序94。C 预变性 5min ;30 个循环94。C 30sec、58。C 30sec、72。C 50sec ;最后72。C 延伸 5min。5) PCR产物的鉴定取4 ii L PCR产物用1. 5% (重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。结果利用引物EFZZF/EFZZR以不同虫态的丽蚜小蜂基因组DNA为模板进行PCR扩增。丽蚜小蜂的雌性成虫扩增出了 287bp的目的条带(见附图2的I泳道);同时丽蚜小蜂的蛹、单头三龄幼虫和单粒卵也扩增出了 287bp的目的条带(见附图2的2、3、4泳道)，说明我们所筛选的丽蚜小蜂的种特异性SCARPCR扩增引物的准确性高。实施例3 :引物EFZZF/EFZZR对丽蚜小蜂检测阈值的测定I)丽蚜小蜂模板DNA的制备将单头丽蚜小蜂雌性成虫置于滴有20 ii L提取缓冲液(50mM Tris-HClUmMEDTA,l%SDS、20mMNaCl，pH 8.0)的parafilm膜上，以0. 2mL的PCR管底部作为匀浆器充分研磨，匀浆液以微量移液器移入1. 5mL离心管；然后以200 u L缓冲液分2次清洗匀浆器，移入同一离心管，混勻，加入5 V- L蛋白酶K(20mg/mL),充分混勻后于60° C水浴1. 5h(中途混勻I次)；然后沸水浴5min,加入220 u L氯仿/异戊醇(V: V=24:1)抽提液,轻柔混匀数十次后，冰上放置30min ;4° C、12000r/min离心20min,取上清液,加入440 u L预冷的无水乙醇,轻轻混匀，待出现少量絮状沉淀后于-30° C放置30min ;4° C、12000r/min离心15min，小心弃去上清液。加入500 V- L预冷的75%乙醇洗漆,4° C、12000r/min离心15min,小心弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后每管加入20ii L超纯水。原模板溶液稀释为1/100头后以2倍进行递减梯度继续稀释至1/25600头，取I U L作为PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中。2)检验丽蚜小蜂的特异性引物的合成Primer EFZZF :5' -AATCGTCGTGTCAGGGAG-3'Primer EFZZR 5/ -GCCGTGGCGITTAGTATG-3'由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。3) PCR扩增反应反应体系为20iiL，其中 10XPCR buffer 2. 0 u L, dNTP (IOmM)1. 6u L,MgCl2 (2. 5mM)1. 2 y L、Taq 聚合酶(5U/ y L) 0.1 y L、上游引物和下游引物(10 y M)各0. 5u L、模板 DNA l.Ou L、超纯水 13.1 u L。4) PCR扩增程序94。C 预变性 5min ;30 个循环94。C 30sec、58。C 30sec、72。C 50sec ;最后72。C 延伸 5min。5) PCR产物的鉴定取4 ii L PCR产物用1. 5% (重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。结果利用引物primer EFZZF/EFZZR做最低检出量的测定，以不同稀释 倍数的丽蚜小蜂基因组DNA为模板进行PCR扩增，能检测到的最低模板DNA浓度为1/1600头雌性成虫(见附图3)。
权利要求
1.一对丽蚜小蜂特异性SCAR引物，其特征在于，所述引物序列为引物 EFZZF :5’ -AATCGTCGTGTCAGGGAG-3’ ；和引物 EFZZR :5’ -GCCGTGGCGTTTAGTATG-3’。
2.丽蚜小蜂SCAR特异性片段，其特征在于，所述片段的序列如SEQID No. 3所示。
3.一种丽蚜小蜂特异性检测方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述SCAR引物进行PCR扩增的步骤。
4.一种丽蚜小蜂特异性检测方法，其特征在于，所述方法包括使用探针与权利要求2所述特异性片段进行杂交的步骤。
5.一种丽蚜小蜂检测特异性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的丽蚜小蜂特异性SCAR引物，和/或用于检测权利要求2所述特异性片段的探针。
全文摘要
本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及一对丽蚜小蜂特异性SCAR引物及快速PCR检测方法和试剂盒。所述丽蚜小蜂特异性SCAR引物为引物EFZZF5′-AATCGTCGTGTCAGGGAG-3′；和引物EFZZR5′-GCCGTGGCGTTTAGTATG-3′。本发明采用SCAR PCR技术，提高了检测的准确性和灵敏度，节约了检测时间，在丽蚜小蜂监测检测方面具有重要的应用价值，可以试剂盒的形式在保护地及露地丽蚜小蜂种类鉴别、寄主谱筛选及其有效利用中推广。
文档编号C12Q1/68GK103014150SQ20121042446
公开日2013年4月3日 申请日期2012年10月30日 优先权日2012年9月24日
发明者张桂芬, 张锐锐, 万方浩, 吕志创, 贤振华 申请人:中国农业科学院植物保护研究所