专利名称：一种基于位点特异性重组的rna干扰载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种RNA干扰载体及其构建方法和应用，特别涉及一种基于位点特异性重组的RNA干扰载体及其构建方法和应用，属于生物技术领域。
背景技术：
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。在动物中，RNAi可以通过U6启动表达shRNA来实现。目前的U6载体可以通过2种方式表达在动物细胞内表达瞬时表达以及稳定表达。稳定表达主要是通过插入基因组中实现的。目前主要通过Gateway技术或者是载体随机插入宿主细胞基因组来完成。这些技术的缺陷是无法进行插入位置的直接准确定位，并且随机插入可能影响目的基因的表达。
为了实现稳定表达细胞系中插入基因组位置的准确定位以及不影响相关基因的表达，本发明通过U6启动子与同源打靶技术相结合，实现了对猪源细胞的精确打靶，并为筛选提供了方便，同时可预期插入片段后对基因表达的影响，为后续实验提供了方便。
发明内容
本发明是结合位点特异性同源重组与RNA干扰(RNAi)技术所发明的特异性插入猪β 3内含子区域的新型RNAi载体。此处，U6启动子结合同源打靶技术，使得基因组定位更加方便快捷，并且可以确保所筛选工程细胞的目的基因表达不受影响。为了达到上述目的本发明采用了以下技术手段本发明的一种基于位点特异性重组的RNA干扰载体，其特征在于从5’端开始，包括以下依次相连的各部分与猪的整合素受体β 3基因上某单一内含子区域上游进行同源重组的同源重组臂1、人U6启动子序列、多克隆酶切位点、人U6终止子序列、含有PCMV启动子的新霉素抗性基因、与猪的整合素受体β 3基因上某单一内含子区域下游进行同源重组的同源重组臂2、复制起始位点基因、氨苄青霉素抗性筛选基因以及用于载体线性化的酶切位点，所述的猪的整合素受体β 3基因的GeneBank登录号为NC_010454. 3。其中同源重组臂1、2用于与猪的整合素受体β 3基因上某单一内含子区域进行同源重组；人 启动子用于表达目的shRNA，用于稳定RNAi ；PCMV-NEO:用于抗G418抗性细胞的筛选；复制起始位点(Origin)提供载体在大肠杆菌中的复制信息；Amp promoter-Amp用于筛选阳性克隆或者是菌体的大量增殖；位于人U6启动子序列以及人U6终止子序列之间的多克隆酶切位点用于酶切暴露U6启动子与终止信号之间的粘性末端，便于插入目的
ds oligoo
在本发明中，优选的，所述的与猪的整合素受体￠3基因上某单一内含子区域上游进行同源重组的同源重组臂I是以提取自猪肝组织的DNA为模板，通过使用以下引物扩增得到的引物F: 5 ’ -AAGTCCGGCAGGTGGAGGATTACC-3 ’引物R : 5，-CCCAGTGCTGGTTATCACATGGC-3，；所述的与猪的整合素受体P 3基因上某单一内含子区域下游进行同源重组的同源重组臂2是以提取自猪肝组织的DNA为模板，通过使用以下引物扩增得到的引物F : 5 ’ -GGCCATGTGATAACCAGCACTGGGA-3 ’引物R : 5，-CCCCCTTGTAGTGGACACAGGAGA-3，。在本发明中，优选的，所述的载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。进一步的，本发明还提供了一种构建以上任一项所述的RNA干扰载体的方法，其特征在于包括以下步骤(I)同源臂的构建以提取自猪肝组织的DNA为模板，设计两对引物分别用来扩增同源重组所使用的同源重组臂I以及同源重组臂2 扩增同源重组臂I所用的引物为F: 5，-AAGTCCGGCAGGTGGAGGATTACC-3’R:5， -CCCAGTGCTGGTTATCACATGGC-3，；同源重组臂2所用的引物为F:5， -GGCCATGTGATAACCAGCACTGGGA-3’R : 5，-CCCCCTTGTAGTGGACACAGGAGA-3，。克隆得到的片段分别连接到PMD20-T载体上，得到分别连有同源重组臂I和同源重组臂2的重组载体PMD20-T-HA1及PMD20-T-HA2 ；(2)人U6启动子、多克隆酶切位点、人U6终止子序列的构建以含人U6启动子、多克隆酶切位点、人U6终止子序列的载体为模板，PCR扩增得到含有人U6启动子、多克隆酶切位点、人U6终止子的片段，将克隆得到的片段连接到PMD20-T载体上，构建得到PMD20-T-U6 ；(3)正筛选基因的构建新霉素抗性基因NEO以及PCMV启动子在载体PGT-Vl上克隆，NEO的扩增引物为F: 5，-ACACGATGATAAGCTTGCCAC-3，R:5’ -TTAGCTAGCGAACCTCTTCGAGGGACCTAATAACTTC-3’ ；
PCMV启动子的扩增引物为F: 5 ’ -ACGGGATCCATATACGCGTTGACATTGATTATTGAC-3，R:5’ -GTTCCCGGGAGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCC AC-3’ ；(4)骨架载体的构建合成多克隆位点，并将其亚克隆到pUC57载体上，构建骨架载体TOC57-MCS，多克隆位点序列如SEQ ID NO. 2或图13所示；(5)元件组装①利用PMD20-T-HA2载体上的spel与BamHI位点酶切后，将同源重组臂2连接到骨架载体PUC57-MCS上，构建成为载体pUC57-2 ；②PCMV与NEO基因的组装将克隆到的PCMV与NEO基因胶回收后，利用基因上的XmaI酶切位点将两个基因拼接成为PCMV-NE0，将PCMV-NEO克隆到载体pUC57_2上，构建成为载体pUC57-N2 ；③利用PMD20-T-U6 上的 AgeI 与 SalI 以及 PMD20-T-HA1 上的 XmaI 与 SalI 位点，将 HAl 克隆到 PMD20-T-U6 上，构建成 PMD20-T-HA1-U6 ;利用 PMD20-T-HA1-U6 上的 SalI 与ClaI位点将目的片段HA1-U6克隆到pUC57-N2上，构建成为目的载体PSN-U6。在本发明中，优选的，步骤(2)中构建得到的含有人U6启动子、多克隆酶切位点、人U6终止子的片段的序列如SEQ ID NO. 3所示。更进一步的，本发明还提供了以上任一项所述的RNA干扰载体在构建猪源细胞RNAi表达载体中的应用。在使用本发明的载体构建猪源细胞RNAi表达载体时，包括以下步骤1、根据需要选择多克隆位的酶切位点，双酶切载体，暴露PSN-U6上的U6启动子与终止信号之间的粘性末端。2、合成转录shRNA所需的DNA序列，例如步骤I如当选用Clal、SfiI作为酶切位点时，符合本载体的ds-oligo (DNA)如图11所示3、将合成的片段与酶切后的PSN-U6连接，转化连接产物，挑取阳性克隆测序验证，测序引物为5’ -G GACTATCATA TGCTTACCG-3’。
4、大量获得阳性菌液，大提质粒。5、使用载体上自带的合适的平末端酶切位点，酶切载体，使之线性化。6、电击转染细胞，筛选阳性克隆。通过southern杂交验证目的片段掺入基因组的拷贝数，利用PCR引物验证是否同源插入基因组的特异性位置。
图1为重组载体PMD20-T-HA1的载体图谱；图2为重组载体PMD20-T-HA2的载体图谱；图3为重组载体PMD20-T-U6的载体图谱；图4为PCMV与NEO的连接片段；图5为重组载体PUC57-MCS的载体图谱；图6为重组载体pUC57-2的载体图谱；图7为重组载体pUC57-N2的载体图谱；图8为重组载体PMD20-T-HA1-U6的载体图谱；图9为重组载体PSN-U6的载体图谱；图10为构建具有同源重组能力的RNA干扰载体PSN-U6的简要流程图；图11为符合本载体的ds-oligo (DNA)示意图；图12为本发明实施例中合成转录shRNA所需的DNA序列；图13为合成的多克隆位点序列示意图14为鉴定出阳性克隆的PCR胶块图；图15为southern实验结果；图16为工程细胞及正常参考细胞中α V的mRNA水平比较；图17为mRNA扩增曲线图；图18为mRNA溶解曲线图；图19为mRNA相对表达水平统计图。
具体实施例方式下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围 内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。实施例1 一种基于位点特异性重组的RNA干扰载体的构建方法1、实验材料猪肝脏组织购于甘肃某实验动物供应基地i a v-pENTR/U6载体由本实验室保存PGT-Vl 由西北农林科技大学王华岩老师赞助使用多克隆酶切位点，实验中用到相关引物由上海生物工程有限公司合成试验中用到的各种试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，另XmaI与AgeI购自NEB公司。2、方法2.1载体的构成载体的构成如PSN-U6结构图谱图9所示，其功能介绍如下HAU ΗΑ2 :用于与猪基因组β 3基因某单一内含子区域进行同源重组hU6 (人U6启动子)用于表达目的shRNA，用于稳定RNAiPCMV-NEO:用于筛选抗G418抗性细胞筛选Origin :载体在大肠杆菌中的复制信息Amp promoter-amp :用于筛选阳性克隆或者是菌体的大量增殖Nru1、Srf1:用于转染前，线性化载体ClaI, Sfi1:用于酶切暴露U6启动子与终止信号之间的粘性末端，便于插入目的
ds OligO03.1载体基因原件的克隆3.1.1同源臂的构建在NCBI中筛选猪基因组中符合要求的内含子区域，最后确定使用猪的整合素受体β3基因(GeneBank登录号为NC_010454. 3)的某一特定的内含子区域。针对单一内含子区域设计两对引物分别用来扩增同源重组所使用的长臂以及短臂。扩增长臂(HAl)所用的引物为F: 5，-AAGTCCGGCAGGTGGAGGATTACC-3’R:5， -CCCAGTGCTGGTTATCACATGGC-3，；
扩增短臂(HA2)所用的引物为F:5， -GGCCATGTGATAACCAGCACTGGGA-3’R : 5，-CCCCCTTGTAGTGGACACAGGAGA-3，。长臂与短臂的长度分别为7036bp、2424bp。长臂的扩增程序为94 °C lmin、58°C 50s,72°C 8min(30cycles)；72°C 8min(over)。短臂的扩增程序为94°C lmin、59°C 50s、72°C 3min (30cycles) ；72°C 3min (over)。扩增所使用的目的基因组来源为猪肝脏组织。并将克隆得到的片段分别连接到PMD20-T载体上，进行测序验证，最终得到分别连有长臂和短臂的重组载体PMD20-T-HA1及PMD20-T-HA2，其载体图谱如图1、图2所示。3.1. 2人U6启动子、多克隆酶切位点、人U6终止子序列的构建以实验室以前构建的含有a V干扰片段的U6载体为模板扩增含有人U6启动子、多克隆酶切位点、人U6终止子序列的片段，所使用的扩增引物为F: 5 ’ -ACCGGTACTGGATCCGGTACCAAGGTC-3，R : 5 ’ -CATCGATGTTTCGTCCTTTCCAC-3，。扩增长度为289bp，扩增程序为94°C lmin,55 °C 50s,72 °C 3min (30cycles)；72°C 3min (over).将克隆得到的片段连接到PMD20-T载体上，进行测序验证，克隆得到的含有人U6启动子、多克隆酶切位点、人U6终止子的片段序列如SEQ IDN0. 3所示，其中所含有的多克隆酶切位点为Clal、Sfil，构建得到PMD20-T-U6，其载体图谱如图3所示。3.1. 3正筛选基因的构建正筛选基因(新 霉素抗性基因NE0)以及PCMV启动子在载体PGT-Vl上克隆。NEO的扩增引物为F:5’ -ACACGATGATAAGCTTGCCAC-3’ R :5’ -TTAGCTAGCGAACCTCTTCGAGGGACCTAATAACTTC -3，;其扩增程序为 94°C lmin、59°C 50s,72°C lmin30s (30cycles) ；72°C 8min(over);长度为 1226bp。PCMV 的扩增引物为 F:5’ -ACGGGATCCATATACGCGTTGACATTGATTATTGAC-3’ R :5’ -GTTCCCGGGAGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCC AC-3’ ；其扩增程序为 94°C lmin、57°C 50s,72°C lmin (30cycles) ；72°C 8min (over);长度为 615bp, PCMV 与 NEO 的连接片段如图4所示。3.1. 4骨架载体的构建本实验根据所得到各个基因原件的基因序列，设计不存在于这些基因上的酶切位点的多克隆位点，将多克隆位点送上海生工合成，并将其亚克隆到PUC57载体上，构建骨架载体PUC57-MCS，多克隆位点序列如SEQ ID NO. 2或图13所示，PUC57-MCS载体图谱如图5所示。3.1. 5元件组装通过如附图10所示的步骤进行基因的亚克隆将各基因原件组装到骨架载体PUC57-MCS 上。(I)利用PMD20-T-HA2载体上的spel与BamHI位点酶切后，将短臂连接到骨架载体PUC57-MCS上，构建成为载体PUC57-2，送测序验证，载体图谱如图6所示。⑵PCMV与NEO基因的组装将克隆到的PCMV与NEO基因胶回收后，利用基因上的XmaI酶切位点将两个基因拼接成为PCMV-NE0，利用设计引物时，PCMV-NEO上所包含的BamHI与NheI以及pUC57_2上面的BglII与Spel，将PCMV-NEO克隆到载体pUC57_2上，构建成为载体PUC57-N2，送测序验证，载体图谱如图7所示。
(3)利用 PMD20-T-U6 上的 AgeI 与 Sail 以及 PMD20-T-HA1 上的 XmaI 与 SalI 位点，将HAl克隆到PMD20-T-U6上，构建成PMD20-T-HA1-U6，送测序验证，载体图谱如图8所示。利用PMD20-T-HA1-U6上的SalI与ClaI位点将目的片段HA1-U6克隆到pUC57_N2上，构建成为目的载体PSN-U6，并且进行测序验证，载体图谱如图9所示，载体的序列如SEQ IDNO.1所示。各个亚克隆步骤中每个载体所使用的限制性内切酶及反应条件如表I所示。表I各个亚克隆步骤中每个载体所使用的限制性内切酶及反应条件
权利要求
1.一种基于位点特异性重组的RNA干扰载体，其特征在于所述的干扰载体依次包括以下相连的各部分与猪的整合素受体β 3基因上某单一内含子区域上游进行同源重组的同源重组臂1、人U6启动子序列、多克隆酶切位点、人U6终止子序列、含有PCMV启动子的新霉素抗性基因、与猪的整合素受体β 3基因上某单一内含子区域下游进行同源重组的同源重组臂2、复制起始位点基因、氨苄青霉素抗性筛选基因以及用于载体线性化的酶切位点，所述的猪的整合素受体β 3基因的GeneBank登录号为NC_010454. 3。
2.如权利要求1所述的RNA干扰载体，其特征在于所述的与猪的整合素受体β3基因上某单一内含子区域上游进行同源重组的同源重组臂I是以提取自猪肝组织的DNA为模板，通过使用以下引物扩增得到的引物 F: 5 ’ -AAGTCCGGCAGGTGGAGGATTACC-3，引物 R :5，-CCCAGTGCTGGTTATCACATGGC-3，； 所述的与猪的整合素受体β3基因上某单一内含子区域下游进行同源重组的同源重组臂2是以提取自猪肝组织的DNA为模板，通过使用以下引物扩增得到的引物 F :5’ -GGCCATGTGATAACCAGCACTGGGA-3’引物 R :5’ -CCCCCTTGTAGTGGACACAGGAGA-3’。
3.如权利要求1或2所述的RNA干扰载体，其特征在于所述的载体的核苷酸序列如SEQID NO.1 所示。
4.一种构建权利要求1-3任一项所述的RNA干扰载体的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)同源臂的构建 以提取自猪肝组织的DNA为模板，设计两对引物分别用来扩增同源重组所使用的同源重组臂I以及同源重组臂2 扩增同源重组臂I所用的引物为 F: 5 ’ -AAGTCCGGCAGGTGGAGGATTACC-3，R:5’ -CCCAGTGCTGGTTATCACATGGC-3’ ； 同源重组臂2所用的引物为 F :5’ -GGCCATGTGATAACCAGCACTGGGA-3’R :5，-CCCCCTTGTAGTGGACACAGGAGA-3，。
克隆得到的片段分别连接到PMD20-T载体上，得到分别连有同源重组臂I和同源重组臂 2 的重组载体 PMD20-T-HA1 及 PMD20-T-HA2 ； (2)人U6启动子、多克隆酶切位点、人U6终止子序列的构建 以含人U6启动子、多克隆酶切位点、人U6终止子序列的载体为模板，PCR扩增得到含有人U6启动子、多克隆酶切位点、人U6终止子序列的片段，将克隆得到的片段连接到PMD20-T载体上，构建得到PMD20-T-U6 ； (3)正筛选基因的构建 新霉素抗性基因NEO以及PCMV启动子以载体PGT-Vl为模板进行克隆，NEO的扩增引物为F: 5 ’ -ACACGATGATAAGCTTGCCAC-3， R:5’ -TTAGCTAGCGAACCTCTTCGAGGGACCTAATAACTTC-3’ ；PCMV启动子的扩增引物为F: 5 ’ -ACGGGATCCATATACGCGTTGACATTGATTATTGAC-3，R:5’ -GTTCCCGGGAGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCC AC-3’ ； (4)骨架载体的构建 合成多克隆位点，并将其亚克隆到PUC57载体上，构建骨架载体PUC57-MCS，多克隆位点序列如SEQ ID NO. 2所示； (5 )元件组装 ①利用PMD20-T-HA2载体上的SpeI与BamHI位点酶切后，将同源重组臂2连接到骨架载体pUC57-MCS上，构建成为载体pUC57-2 ； ②PCMV与NEO基因的组装将克隆到的PCMV与NEO基因胶回收后，利用基因上的XmaI酶切位点将两个基因拼接成为PCMV-NE0，将PCMV-NEO克隆到载体pUC57_2上，构建成为载体 pUC57-N2 ； ③利用PMD20-T-U6上的AgeI与SalI以及PMD20-T-HA1上的XmaI与SalI位点，将HAl克隆到 PMD20-T-U6 上，构建成 PMD20-T-HA1-U6 ;利用 PMD20-T-HA1-U6 上的 SalI 与 ClaI 位点将目的片段HA1-U6克隆到pUC57-N2上，构建成为目的载体PSN-U6。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(2)中构建得到的含有人U6启动子、多克隆酶切位点、人U6终止子的片段的序列如SEQ ID NO. 3所示。
6.权利要求1-4任一项所述的RNA干扰载体在构建猪源细胞RNAi表达载体中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种基于位点特异性重组的RNA干扰载体及其构建方法和应用，属于生物技术领域。本发明所述的干扰载体依次包括以下相连的各部分与猪的整合素受体β3基因的某单一内含子区域上游进行同源重组的同源重组臂1、人U6启动子序列、多克隆酶切位点、人U6终止子序列、含有PCMV启动子的新霉素抗性基因、与猪的整合素受体β3基因的某单一内含子区域下游进行同源重组的同源重组臂2、复制起始位点基因、氨苄青霉素抗性筛选基因以及用于载体线性化的酶切位点。本发明的干扰载体实现了对猪源细胞基因组的精确打靶，并为筛选提供了方便，同时还可预期插入片段后对基因表达的影响，对后续实验提供了方便。
文档编号C12N15/85GK103060374SQ20121042478
公开日2013年4月24日 申请日期2012年10月30日 优先权日2012年10月30日
发明者常惠芸, 马延滨, 丛国正, 高闪电, 独军政, 邵军军, 林彤, 郝春霞 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所