专利名称：赤藓糖醇生产菌的选育方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种赤藓糖醇生产菌的选育方法。
背景技术：
Yarrowia Iipolytica,中文名被翻译为解脂耶罗威亚酵母、解脂耶氏酵母、解脂耶罗维亚酵母。赤藓糖醇工业化生产是近几年才兴起的，全球的实际产量约6万吨/年左右。由于赤藓糖醇是零热量的天然甜味剂，随着人们健康理念的增强，在市场上越来越受到人们的青睐。继而科研院所、高校等科研工作者对于赤藓糖醇生产技术，特别是菌种的研究越来越多。
目前，赤藓糖醇生产菌的选育方法主要采用化学诱变、物理诱变的方法，由于现有的选育方法存在诱变方向难以把握，诱变后还有大量的培养检测筛选工作要做、存在选育程序复杂，获得优异菌种的时间很长、几率较低等缺陷，致使赤藓糖醇生产菌的选育程序复杂，选育效率低，菌种活力差、产量低，菌种专一性差、转化率低。
发明内容
本发明的目的是提供一种赤藓糖醇生产菌的选育方法，以解决现有技术赤藓糖醇生产菌的选育程序复杂，选育效率低、菌种活力差、菌种专一性差、产量低、转化率低等问题。本发明解决其技术问题所采用的技术方案首先采用基因工程的手段对菌种进行改造以增加4-磷酸赤藓糖激酶和赤藓糖还原酶的基因数量，然后对培养基组成及配比进行优化，并添加适量氯化铜，这样有效提高了菌株中酶的活力。通过以上两个措施，优化培养条件、对原本赤藓糖醇产量极低的Yarrowia Iipolytica菌株进行选育,从而获得了Yarrowia Iipolytica赤藓糖醇高产菌株。其具体选育方法步骤如下
I、基因工程改造4_磷酸赤藓糖激酶和赤藓糖还原酶是赤藓糖醇生产的关键因子；通过低温超声破碎、凝胶色谱分离技术及全波长分光光度计，分离得到这两种酶，分析获得了这两种酶的基因结构；然后用PCR扩增仪将获得的这两种酶的基因片段进行大量复制，PCR扩增的条件90°C变性30 S、53°C退20 S，72°C延伸30 S ;然后将得到的基因分别连接到pBR327质粒中；将质粒转化到Yarrowia Iipolytica中，使其在细胞内大量拷贝；这样Yarrowia Iipolytica中4_磷酸赤藓糖激酶和赤藓糖还原酶的合成量大大增加,有利于赤藓糖醇的生产。将转化成功的Yarrowia Iipolytica进一步富集培养,制成试管斜面在4°C冰箱中保存待用。2、培养基制备优化得到的培养基配比按重量计分别为一水葡萄糖30%_40%，柠檬酸铵 1%_2%，七水硫酸镁O. 01%-0. 08%,氯化铜 O. 0003%-0. 0006%。然后 110°C，灭菌 20min。3、培养条件优化由于培养条件对于微生物的代谢有很大的影响，所以必须对Yarrowia Iipolytica生产赤藓糖醇的培养条件从温度、通风两个方面进行重复试验与优化。优化结果为温度在28°C _31°C时其他副产物最少；每分钟的通风量为料液体积的20%-50%时,Yarrowia Iipolytica细胞到达稳定期的时间比较短,最终获得的高产菌,并利于赤藓糖醇的生产。通过以上三个步骤就可以从一般的Yarrowia Iipolytica菌株中选育得到满足生产需要的赤藓糖醇高产菌。采用本发明的积极效果是通过基因工程改造，避免了传统工艺的盲目性，同时减轻了后续大量的筛选检测工作，Yarrowia Iipolytica中4_磷酸赤藓糖激酶和赤藓糖还原酶的合成量大大增加，有利于赤藓糖醇的生产。未经改造和培养优化的菌种，葡萄糖对赤藓糖醇的摩尔转化率仅为40%，转化效率比较低，改造、优化后葡萄糖对赤藓糖醇的摩尔转化率提闻至68%以上。提供的新培养基选育方法明显提闻赤鲜糖醇的广量，大大提闻了赤鲜糖醇生产菌的选育效率、菌种活力及产量。
具体实施方式
实施例I
将通过PCR仪扩增得到的4-磷酸赤藓糖激酶和赤藓糖还原酶的基因序列分别连接到pBR327质粒中，然后转化到Yarrowia Iipolytica中。PCR扩增的条件90°C变性30 S、53。。退20 S,72°C延伸30 S。将转化成功的Yarrowia Iipolytica进一步富集培养，制成试管斜面在4°C冰箱中保存待用；
制备培养基一水葡萄糖32%，柠檬酸铵1%，七水硫酸镁O. 04%,氯化铜O. 0003%。然后110°C灭菌20min备用；
选取的培养温度为30°C，每min的通风量为料液体积的30%。最终获得的高产菌使葡萄糖对赤藓糖醇的摩尔转化率为79%。实施例2
将通过PCR扩增得到的4-磷酸赤藓糖激酶和赤藓糖还原酶的基因序列分别连接到pBR327质粒中，然后转化到Yarrowia Iipolytica中。PCR扩增的条件90°C变性30 S、53。。退20 S,72°C延伸30 S。将转化成功的Yarrowia Iipolytica进一步富集培养，制成试管斜面在4°C冰箱中保存待用；
制备培养基一水葡萄糖30%，柠檬酸铵I. 5%，七水硫酸镁O. 05%,氯化铜O. 0002%。然后110 C灭囷20min备用；
选取的培养温度为29°C，每min的通风量为料液体积的25%。最终获得的高产菌使葡萄糖对赤藓糖醇的摩尔转化率为84%。实施例3
将通过PCR扩增得到的4-磷酸赤藓糖激酶和赤藓糖还原酶的基因序列分别连接到pBR327质粒中，然后转化到Yarrowia Iipolytica中。PCR扩增的条件90°C变性30 S、53。。退20 S,72°C延伸30 S。将转化成功的Yarrowia Iipolytica进一步富集培养，制成试管斜面在4°C冰箱中保存待用；
制备培养基一水葡萄糖31%，柠檬酸铵I. 5%，七水硫酸镁O. 06%,氯化铜O. 0005%。然后110 C灭囷20min备用；
选取的培养温度为30°C，每min的通风量为料液体积的35%。最终获得的高产菌使葡萄糖对赤藓糖醇的摩尔转化率为82%。
权利要求
1. 一种赤藓糖醇生产菌的选育方法，其特征是首先采用基因工程的手段对菌种进行改造，以增加4-磷酸赤藓糖激酶和赤藓糖还原酶的基因数量，然后对培养基组成及配比进行优化，原料中添加氯化铜，优化培养条件、对原本赤藓糖醇产量极低的YarrowiaIipolytica菌株进行选育,从而获得了 Yarrowia Iipolytica赤藓糖醇高产菌株；其具体选育方法步骤如下 (1)基因工程改造4_磷酸赤藓糖激酶和赤藓糖还原酶是赤藓糖醇生产的关键因子；通过低温超声破碎、凝胶色谱分离技术及全波长分光光度计，分离得到这两种酶，分析获得了这两种酶的基因结构；然后用PCR扩增仪将获得的这两种酶的基因片段进行大量复制，PCR扩增的条件90°C变性30 S、53°C退20 S，72°C延伸30 S ;然后将得到的基因分别连接到pBR327质粒中；将质粒转化到Yarrowia Iipolytica中，使其在细胞内大量拷贝；这样Yarrowia Iipolytica中4_磷酸赤藓糖激酶和赤藓糖还原酶的合成量大大增加,有利于赤藓糖醇的生产；将转化成功的Yarrowia Iipolytica进一步富集培养,制成试管斜面在4°C冰箱中保存待用； (2)培养基制备优化得到的培养基配比按重量计分别为一水葡萄糖30%-40%，柠檬酸铵 1%-2%，七水硫酸镁 O. 01%-0. 08%,氯化铜 O. 0003%-0. 0006%, 110°C，灭菌 20min ； (3)培养条件优化由于培养条件对于微生物的代谢有很大的影响，所以必须对Yarrowia Iipolytica的培养条件从温度、通风两个方面进行了重复试验与优化；温度在28°C -31 °C时其他副产物最少；每分钟的通风量为料液体积的20%-50%时，YarrowiaIipolytica细胞到达稳定期的时间比较短，最终获得的闻广菌，最终获得的闻广菌，并利于赤藓糖醇的生产。
全文摘要
一种赤藓糖醇生产菌的选育方法，属于微生物技术领域。该方法采用基因工程的手段对菌种进行改造以增加4-磷酸赤藓糖激酶和赤藓糖还原酶的基因数量，然后对培养基组成及配比进行优化，原料中添加氯化铜，优化培养条件、对原本赤藓糖醇产量极低的Yarrowialipolytica菌株进行选育，从而获得了Yarrowialipolytica赤藓糖醇高产菌株。其具体选育方法步骤包括(1)基因工程改造、(2)培养基制备、(3)培养条件优化，获得高产赤藓糖醇生产菌菌种。本发明通过基因工程改造，避免了传统工艺的盲目性，同时减轻了后续大量的筛选检测工作，Yarrowialipolytica中4-磷酸赤藓糖激酶和赤藓糖还原酶的合成量大大增加，有利于赤藓糖醇的生产。大大提高了赤藓糖醇生产菌的选育效率、菌种活力及产量。
文档编号C12N1/19GK102911889SQ20121046341
公开日2013年2月6日 申请日期2012年11月17日 优先权日2012年11月17日
发明者王星云, 邱学良, 李 雨, 王成福, 秦海青, 李毅 申请人:山东福田药业有限公司