专利名称：诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞的培养方法
技术领域：
本发明涉及一种诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞的培养方法，以及利用该培养方法得到的角膜缘干细胞联合脱细胞羊膜支架构建组织工程眼表移植物的方法，属于组织工程及眼科领域。
背景技术：
角膜缘干细胞是角膜上皮细胞自我更新、修复及再生的根本基础，也是角结膜之间重要的屏障结构，对于维持角膜透明性、稳定性和正常生理功能的发挥具有极其重要的作用。严重的眼表疾病，如眼表化学伤、炎症、眼表免疫性疾病等，可导致角膜缘干细胞的缺失及屏障结构的破坏，从而引起一系列的眼表反应，角膜上皮反复缺损、糜烂、溃疡、新生血
管长入及假性胬肉形成，最终导致失明。目前角膜缘干细胞移植供体的严重匮乏和体外培养扩增的困难情况，使得众多患者在痛苦的等待中丧失了治疗机会而导致终身失明。因此，寻找适合来源细胞替代角膜缘干细胞、改善角膜缘干细胞缺失对于损伤后角膜上皮的修复及稳定眼表的重建具有重要的临床实践意义。自1998年Thomson等第一次从胚胎中分离培养出人胚胎干细胞以来，胚胎干细胞因其所具有的强大自我更新能力和分化全能性备受科学界的关注，其作为种子细胞，可修复受损部位，恢复机体功能，为一些难治性疾病的治疗提供了新的途径。因此选择人胚胎干细胞作为诱导细胞的来源具有得天独厚的科研优势。现阶段国内外胚胎干细胞定向诱导在眼表方面的研究多关注于终末角膜上皮细胞。2007年Ahmad S等的研究表明采用角膜缘成纤维细胞条件培养基可诱导人胚胎干细胞分化为表达角膜上皮特细胞异性标记物CK3/12的细胞，且在为期21天的分化过程中p63等角膜缘干细胞标记物的表达有高峰出现。Ho_a等则发现利用IV型胶原对小鼠胚胎干细胞进行接触性诱导可在体外获得单层类上皮样细胞，此细胞CK12呈阳性，而鳞状上皮细胞标记物CK14为阴性，且将诱导细胞移植于角膜损伤小鼠模型上24小时可见移植细胞紧密附着于受体角膜基质并完全覆盖损伤表层。但此种诱导方法的成功率仅有不到20%。在国内的研究中，王智崇等通过接触诱导方法，将大鼠胚胎干细胞与表层角膜缘基质共同培养，使前者在体外分化成为单一形态的较大细胞。诱导细胞在移植于裸鼠皮下后可形成细胞复层，电子显微镜下可观察到角膜缘干细胞的部分形态学特征。上述体外及动物实验证实，在体外模拟的角膜上皮微环境中胚胎干细胞具有向角膜上皮细胞定向分化的潜能。但现有胚胎干细胞诱导分化方案诱导效率低下，诱导所得细胞均为终末分化角膜上皮细胞，无正常角膜缘干细胞的表型及体外分化扩增能力，故无法满足因角膜缘干细胞缺乏所致眼表疾病临床治疗的需要。目前国内外尚未见关于人胚胎干细胞来源角膜缘干细胞有效诱导方法的文献报道。综上所述，本领域迫切需要具有正常角膜缘干细胞功能的替代种子细胞来源，以及利用种子细胞构建的适于移植使用的组织工程化眼表植片。
发明内容
针对上述现有技术，为了解决角膜缘干细胞移植供体严重匮乏的现状，本发明建立了一种高效可行的人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞的诱导方法，为组织工程角膜上皮构建提供种子细胞。诱导细胞具有与正常角膜缘干细胞相似的形态和表型，及良好的体外分化增殖能力，可体外传代4代以上；其与脱细胞羊膜支架材料具有良好的生物相容性；在角膜缘干细胞失代偿动物模型中，诱导细胞移植物可有效修复损伤角膜上皮，抑制新生血管生成,减少炎症反应及瘢痕生成。本发明是通过以下技术方案实现的一种诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞的培养方法，步骤如下首先，采用DMEM/F12条件培养基培养人原代角膜缘干 细胞，制备角膜缘干细胞条件培养基；然后，利用该角膜缘干细胞条件培养基联合IV型胶原体外培养诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞。所述“采用DMEM/F12条件培养基培养人原代角膜缘干细胞，制备角膜缘干细胞条件培养基”的具体方法如下采用DMEM/F12条件培养基培养人原代角膜缘干细胞，每日换液；当相邻角膜缘干细胞克隆团开始融合时，用移液枪吸取培养基上清并通过O. 22 μ m滤器进行过滤，即为角膜缘干细胞条件培养基。所述DMEM/F12条件培养基是在普通的DMEM/F12培养基基础上添加以下物质制成的胎牛血清，人表皮生长因子，氢化可的松，胰岛素，转铁蛋白和牛垂体提取物；其中，添加后，胎牛血清占总液体量的10% (在本专利申请中，如无特别说明，溶液百分比均表示添加物在终溶液中的体积分数)，牛垂体提取物占总液体量的O. 2%，人表皮生长因子的浓度为5ng/ml,氢化可的松的浓度为O. 18 μ g/ml,胰岛素的浓度为5 μ g/ml,转铁蛋白的浓度为
5μ g/mlο所述人原代角膜缘干细胞是通过以下方法制备得到的取角膜环组织，用含青霉素-链霉素的PBS平衡盐溶液(青霉素和链霉素的终末浓度各为100U/ml,下同)冲洗消毒，去除角膜内皮及后弹力层，将剩余角膜组织置于2. 4U/ml DispaseII内，于37°C 5%C02孵箱内孵育90分钟；用显微镊子分离角膜上皮组织；收集分离获得的角膜上皮组织，于O. 25%胰酶(将O. 25g胰酶溶于PBS平衡盐溶液，定容至IOOml制备而成)37°C消化10分钟，即得角膜缘干细胞的单细胞悬液，以lX103/cm2的密度接种于经丝裂霉素C处理过的3T3细胞上，即得人原代角膜缘干细胞。所述“利用该角膜缘干细胞条件培养基联合IV型胶原体外培养诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞”的具体方法如下利用角膜缘干细胞条件培养基联合IV型胶原体外模拟角膜缘微环境，采用诱导培养基培养人胚胎干细胞6 12天(优选9天)，诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞；其中，I) IV型胶原的使用方式为每直径35_培养皿内添加ImlIV型胶原(终浓度O. 5mg/ml )，包被培养皿2小时以上，在接种人胚胎干细胞前吸除包被液体，进行细胞培养；2)诱导培养基是由75%的角膜缘干细胞条件培养基和25%的DMEM/F12条件培养基(含胎牛血清等添加剂)所组成的。利用本发明的诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞的培养方法得到的角膜缘干细胞，经体外光学显微镜观察、电子显微镜观察、实时定量聚合酶链式反应、免疫荧光、流式细胞分析及克隆形成率测定等证实诱导细胞具有与正常角膜缘干细胞相似的形态和表型，并表现出良好的体外分化增殖能力，可体外传代4代以上。本发明得到的角膜缘干细胞，可以作为种子细胞用于制备角膜移植物，具体应用时，方式如下( I)将新鲜人羊膜用含青霉素-链霉素的PBS平衡盐溶液(青霉素和链霉素的终末浓度各为100U/ml)冲洗消毒，用O. 25%胰酶37°C消化30分钟，去除羊膜细胞，得到脱细胞羊膜支架材料，用眼科剪于解剖显微镜下将脱细胞羊膜支架材料裁剪为直径3cm的圆片；(2)用O. 125%胰酶(将O. 125g胰酶溶于PBS平衡盐溶液，定容至IOOml制备而成)于37°C消化诱导干细胞(角膜缘干细胞)5分钟，制备成单细胞悬液，然后按I. 5X104个细胞/cm2将其接种于裁剪好的脱细胞羊膜支架材料上(支架材料接种面积约为7cm2，接种总量约为10. 5X105个细胞)，体外培养2周，其中，浸没培养7天，气液界面培养7天，即可形成具有复层上皮样结构的诱导细胞移植物。
采用lmol/L纯碱烧伤兔角膜40秒，制备兔角膜缘干细胞失代偿模型，烧伤I月后将诱导细胞植片(本发明所得到的具有复层上皮样结构的诱导细胞移植物)移植于损伤眼表，移植3月后诱导细胞植片可有效修复损伤眼表，抑制新生血管生成，减少炎症反应及瘢痕生成。本发明建立了一套高效可行的人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞的诱导方案，为组织工程角膜上皮构建提供种子细胞；建立了一种采用诱导细胞联合脱细胞羊膜支架构建组织工程眼表的方法，为组织工程化眼表的构建奠定了坚实的基础。
图I为人原代角膜缘干细胞和诱导细胞的光学显微镜图片，其中，a :人原代角膜缘干细胞光学显微镜图片山诱导细胞光学显微镜图片，图中可见，诱导细胞排列紧密，呈铺路石样，与正常人角膜缘干细胞形态相似。图2为诱导细胞联合脱细胞羊膜支架材料体外构建组织工程眼表移植物HE染色图片，图中可见，形成了复层上皮样结构。图3为诱导细胞移植术前和术后3月的裂隙灯图片，其中，a :移植术前裂隙灯图片，图中可见，角膜上皮缺损，大量新生血管张入；b :移植术后3月裂隙灯图片，图中可见，损伤角膜上皮修复，无明显新生血管张入。图4为诱导细胞移植术前和术后3月的共聚焦显微镜图片，其中，a :移植术前共聚焦显微镜图片，图中可见，正常角膜上皮结构破坏，新生血管张入及高反光的瘢痕组织山移植术后3月裂隙灯图片，图中可见，移植细胞排列紧密，呈铺路石样，瘢痕组织范围局限，未见新生血管。图5为诱导细胞联合脱细胞猪角膜支架材料体外构建组织工程眼表移植物HE染色图片，图中可见，形成了复层上皮样结构。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例I诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞，并制备角膜移植物将新鲜人羊膜用含100U/ml青霉素-链霉素的PBS平衡盐溶液冲洗消毒后，用O. 25%胰酶于37°C消化30分钟，移液枪吹打去除羊膜细胞，得到脱细胞羊膜支架材料，用眼科剪于解剖显微镜下将脱细胞羊膜支架材料裁剪为直径3cm的圆片。采用诱导培养基培养人胚胎干细胞9天，使其分化为角膜缘干细胞样细胞(如图Ib所示)，用O. 125%胰酶于37°C消化诱导细胞5分钟，制备单细胞悬液，按I. 5X104个细胞/cm2将其接种于裁剪好的脱细胞羊膜支架材料上(支架材料接种面积约为7cm2，接种总量约为10. 5X105个细胞)，体外培养2周，其中，浸没培养7天，气液界面培养7天，即可形成具有复层上皮样结构的细胞角膜移植物，如图2所示。所述“采用诱导培养基培养人胚胎干细胞9天，使其分化为角膜缘干细胞样细胞”具体步骤如下利用角膜缘干细胞条件培养基联合IV型胶原体外模拟角膜缘微环境，采用诱导培养基培养人胚胎干细胞9天，诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞；其中，I) IV型胶原的使用方式为每直径35mm培养皿内添加ImlIV型胶原，终浓度O. 5mg/ml，包被培养皿2小时以上，在接种人胚胎干细胞前吸除包被液体，进行细胞培养；2)诱导培养基是由·75%的角膜缘干细胞条件培养基和25%的DMEM/F12条件培养基所组成的。所述角膜缘干细胞条件培养基是通过以下方法制备得到的采用DMEM/F12条件培养基培养人原代角膜缘干细胞，每日换液；当相邻角膜缘干细胞克隆团开始融合时，取培养基上清，即为角膜缘干细胞条件培养基。所述DMEM/F12条件培养基是在普通的DMEM/F12培养基基础上添加以下物质制成的胎牛血清，人表皮生长因子，氢化可的松，胰岛素，转铁蛋白和牛垂体提取物；其中，添加后，胎牛血清占总液体量的10%，牛垂体提取物占总液体量的O. 2%，人表皮生长因子的浓度为5ng/ml,氢化可的松的浓度为O. 18 μ g/ml,胰岛素的浓度为5 μ g/ml,转铁蛋白的浓度为 5 μ g/mlο所述人原代角膜缘干细胞是通过以下方法制备得到的取角膜环组织，用含青霉素-链霉素的PBS平衡盐溶液冲洗消毒，去除角膜内皮及后弹力层，将剩余角膜组织置于2. 4U/mlDispaseII内，于37°C 5%C02孵箱内孵育90分钟；用显微镊子分离角膜上皮组织；收集分离获得的角膜上皮组织，于O. 25%胰酶37°C消化10分钟，即得角膜缘干细胞的单细胞悬液，以lX103/cm2的密度接种于经丝裂霉素C处理过的3T3细胞上，即得人原代角膜缘干细胞(如图Ia所示)。实施例2构建的组织工程化眼表修复化学损伤角膜上皮将环形滤纸片于lmol/L纯碱内浸泡20秒，用无菌纱布吸去多余液体，置于兔眼表烧灼40秒后，予大量无菌生理盐水冲洗眼表，制备兔角膜缘干细胞失代偿模型。烧伤I月后，选择构建成功的兔角膜缘干细胞失代偿模型，显微镜下小心去除新生血管纤维膜，清理植床，将诱导细胞植片(实施例I制备)置于准备好的植床上，用10-0尼龙线在植片边缘进行缝合固定。术后每3日于裂隙灯下观察植片情况，每I月于共聚焦显微镜下观察细胞生长情况。移植3月后处死实验动物行组织学检测，如图3所示。实施例3构建的组织工程化眼表修复机械损伤角膜上皮利用板层刀于显微镜下环形切除兔角膜缘组织，制备兔角膜缘干细胞失代偿模型。手术损伤I月后，选择构建成功的兔角膜缘干细胞失代偿模型，显微镜下小心去除新生血管纤维膜，清理植床，将诱导细胞植片(实施例I制备)置于准备好的植床上，用10-0尼龙线在植片边缘进行缝合固定。术后每3日于裂隙灯下观察植片情况，每I月于共聚焦显微镜下观察细胞生长情况。移植3月后处死实验动物行组织学检测，如图4所示。实施例4体外联合脱细胞猪角膜支架构建组织工程化前板层收集新鲜猪角，用含青霉素-链霉素的平衡盐溶液冲洗消毒，显微镜下将猪角膜处理为直径10毫米的组织片。将处理的组织片置于O. 5%SDS溶液中于4°C搅拌24小时，再使用无菌平衡盐溶液漂洗组织片8次，每次时间为2小时，共计16小时，即可获得脱细胞猪角膜支架材料。使用O. 125%胰酶消化诱导细胞，制备单细胞悬液，按I. 5X104个细胞/cm2将其接种于脱细胞猪角膜支架材料上(支架材料接种面积约为O. 8cm2，接种总量约为I. 2X104个细胞)体外气液界面培养2周，其中浸没培养7天，气液界面培养7天，可形成具有复层上皮样结构的诱导细胞移植物，如图5所示。在实施例2中，诱导细胞植片可有效修复损伤眼表，抑制新生血管生成，减少炎症
反应及瘢痕生成。在实施例4中，培养2周后，诱导细胞可在脱细胞猪角膜支架上形成具有复层上皮样结构的诱导细胞移植物。以上实施例表明，本发明构建的诱导分化方法可有效诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞，且诱导移植物在移植动物上起到了良好的修复作用，具有广阔的开发前景。
权利要求
1.一种诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞的培养方法，其特征在于步骤如下首先，采用DMEM/F12条件培养基培养人原代角膜缘干细胞，制备角膜缘干细胞条件培养基；然后，利用该角膜缘干细胞条件培养基联合IV型胶原体外培养诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞； 所述“采用DMEM/F12条件培养基培养人原代角膜缘干细胞，制备角膜缘干细胞条件培养基”的具体方法如下采用DMEM/F12条件培养基培养人原代角膜缘干细胞，每日换液；当相邻角膜缘干细胞克隆团开始融合时，取培养基上清，即为角膜缘干细胞条件培养基； 所述“利用该角膜缘干细胞条件培养基联合IV型胶原体外培养诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞”的具体方法如下利用角膜缘干细胞条件培养基联合IV型胶原体外模拟角膜缘微环境，采用诱导培养基培养人胚胎干细胞6 12天，诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞；其中，I) IV型胶原的使用方式为每直径35mm培养皿内添加ImlIV型胶原，终浓度0. 5mg/ml，包被培养皿2小时以上，在接种人胚胎干细胞前吸除包被液体，进行细胞培养；2)诱导培养基是由75%的角膜缘干细胞条件培养基和25%的DMEM/F12条件培养基所组成的。
2.根据权利要求I所述的诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞的培养方法，其特征在于所述DMEM/F12条件培养基是在普通的DMEM/F12培养基基础上添加以下物质制成的胎牛血清，人表皮生长因子，氢化可的松，胰岛素，转铁蛋白和牛垂体提取物；其中，添加后，胎牛血清占总液体量的10%，牛垂体提取物占总液体量的0. 2%，人表皮生长因子的浓度为5ng/ml,氢化可的松的浓度为0. 18 u g/ml,胰岛素的浓度为5 y g/ml,转铁蛋白的浓度为 5 u g/ml o
3.根据权利要求I所述的诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞的培养方法，其特征在于所述人原代角膜缘干细胞是通过以下方法制备得到的取角膜环组织，用含青霉素-链霉素的PBS平衡盐溶液冲洗消毒，去除角膜内皮及后弹力层，将剩余角膜组织置于2. 4U/mlDispaseII内，于37°C 5%C02孵箱内孵育90分钟；用显微镊子分离角膜上皮组织；收集分离获得的角膜上皮组织，于0. 25%胰酶37°C消化10分钟，即得角膜缘干细胞的单细胞悬液，以lX103/cm2的密度接种于经丝裂霉素C处理过的3T3细胞上，即得人原代角膜缘干细胞。
4.利用权利要求I 3中任一项所述的诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞的培养方法得到的角膜缘干细胞。
5.权利要求4所述的角膜缘干细胞作为种子细胞用于制备角膜移植物的用途。
6.根据权利要求5所述用途，其特征在于具体应用时，方式如下 (1)将新鲜人羊膜用含青霉素-链霉素的PBS平衡盐溶液冲洗消毒，用0.25%胰酶37°C消化30分钟，去除羊膜细胞，得到脱细胞羊膜支架材料； (2)用0.125%胰酶于37°C消化角膜缘干细胞5分钟，制备成单细胞悬液，然后将其接种于脱细胞羊膜支架材料上，体外培养2周，其中，浸没培养7天，气液界面培养7天，即可形成具有复层上皮样结构的诱导细胞移植物。
7.一种角膜移植物，其特征在于是通过以下方法制备得到的 (I)将新鲜人羊膜用含青霉素-链霉素的PBS平衡盐溶液冲洗消毒，用0. 25%胰酶37°C消化30分钟，去除羊膜细胞，得到脱细胞羊膜支架材料；(2)用O. 125%胰酶于37°C消化权利要求4的角膜缘干细胞5分钟，制备 成单细胞悬液，然后将其接种于脱细胞羊膜支架材料上，体外培养2周，其中，浸没培养7天，气液界面培养7天，即可形成具有复层上皮样结构的诱导细胞移植物，即为角膜移植物。
全文摘要
本发明公开了一种诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞的培养方法，步骤如下首先，采用DMEM/F12条件培养基培养人原代角膜缘干细胞，制备角膜缘干细胞条件培养基；然后，利用该角膜缘干细胞条件培养基联合IV型胶原体外培养诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞。利用本发明的方法得到的角膜缘干细胞，经体外光学显微镜观察、电子显微镜观察、实时定量聚合酶链式反应、免疫荧光、流式细胞分析及克隆形成率测定等证实诱导细胞具有与正常角膜缘干细胞相似的形态和表型，并表现出良好的体外分化增殖能力，可体外传代4代以上，可以作为种子细胞用于制备角膜移植物。
文档编号C12N5/074GK102952779SQ201210501228
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日
发明者吴欣怡, 朱婧, 杨洪玲 申请人:山东大学