专利名称：一种用传代鸡胚成纤维细胞制备猪伪狂犬活疫苗的方法
技术领域：
本发明涉及属于兽用生物制品培育技术领域，具体涉及一种用传代鸡胚成纤维细胞制备猪伪狂犬活苗的方法。
背景技术：
伪狂犬病又称Aujeszky氏病，是由伪狂犬病病毒(Pseudora-bies virus, PRV) 所引起的多种家畜、家禽及野生动物的一种以发热、流产、奇痒(除猪外)、脑脊髓炎为主要症状的急性传染病。该病毒归属疱疫病毒科(Herpesviridae)甲型疱疫病毒亚科 (Alphaherpesvirinae of alphavirinae),因此也成猪疱疫病毒型(Suid herpesvirus)、传染性延髓麻痹病病毒或奇痒症病毒。该病毒的感染谱极广，以表明有40种动物可以被感染，猪是该病毒的最重要的储存宿主和带毒者，因而对该病毒的传播起着重要的作用。 由于被感染动物种类极多，病毒可在自然界反复循环存在，属于典型的自然疫源性疾病，也是极难防制的传染病之一。
猪发生伪狂犬病以后，其临床症状取决于感染猪的年龄、病毒株的毒力感染途径和剂量。成年及母猪主要表现为呼吸症状，多呈一过性，是带毒和排毒的主要来源。可致怀孕母猪流产、产死胎、木乃伊胎儿和种猪不育等综合症候群。15日龄以内的仔猪发病死亡率更高达100%，断奶仔猪发病率可达40%，死亡猪已日益增多。
本病目前尚无特效治疗药物，疫苗的免疫接种是预防和控制伪狂犬病的根本措施，目前国内外已研制出伪狂犬的常规弱毒疫苗、灭活疫苗和基因缺失疫苗，这些疫苗都能在一定程度上减轻或防治伪狂犬病的临床症状，从而减少造成的经济损失。
但是目前猪伪狂犬病毒活疫苗的制备方法中普遍用原代鸡胚成纤维细胞(CEF)培养PRV弱毒的方法，这种方法存在操作过程复杂繁琐、毒价低、批间差大、生产成本高、大量生产受制于SPF蛋的供应，而且容易引入外源病毒或其它污染源、很容易造成疫苗质量不稳定等缺陷。
另外，DF-1细胞系最早由美国明尼苏达大学动物科学系Douglas Foster博士于1998年改良而成的，起源于10日龄的ELL-O (来航)鸡胚成纤维细胞(CEF)，是自发永生性的，可以无限繁殖。它有着成纤维细胞的典型的细胞形态。DF-1细胞逆转录酶阴性，没有禽类肉瘤和白血病病毒的内源性基因序列，所以是非致瘤性的。DF-1细胞系是经美国食品与药物管理局(FDA)授权的全球商业化细胞系，目前已被广泛应用于禽类病毒的增殖、重组蛋白的表达、肿瘤病毒的研究及动物和人类疫苗的生产。DF-1细胞对鸡传染性法氏囊病毒、呼肠孤病毒、禽白血病病毒、劳氏肉瘤病毒、火鸡疱疫病毒均易感，禽类病毒在DF-1 细胞上的病变更加剧烈，更加明显，可以在DF-1细胞上进行复制，并且可以形成明显的细胞病变。DF-1细胞具有很好的增殖潜力，和鸡胚成纤维细胞相比，DF-1细胞的密度可以比大4倍以上。因此，用DF-1细胞生产猪PRV活疫苗是目前的一个主要研究方向。发明内容
本发明的目的是，针对现有技术的不足而提出一种用传代鸡胚成纤维细胞制备猪伪狂犬活疫苗的方法，该方法利用传代鸡胚成纤维细胞(DF-1)代替原代鸡胚成纤维细胞CEF培养PRV弱毒，并对培养工艺进行系统的优化，以克服复杂繁琐、成本过高，且容易造成疫苗质量不稳定的缺陷。本发明的技术方案是通过如下步骤来实现的
(O先制备原代鸡胚成纤维细胞(CEF)，在CEF细胞制备后20-28h，将猪伪狂犬病毒(PRV)弱毒株接种原代鸡胚成纤维细胞(CEF)，得到猪伪狂犬病毒弱毒种毒，收获的猪伪狂犬病毒弱毒种毒的病毒液，反复冻融3次后按常规方法测病毒的半数感染量(TCID5tl)应达到 107 0TCID50/ml 以上。(2)制备传代鸡胚成纤维细胞(DF-1)细胞单层，将DF-1细胞用含8%血清的DMEM培养基进行驯化，放置于37°C，CO2含量为5%的恒温培养箱中培养。其中所述的DMEM培养 基中含1. 5g碳酸氢钠/升，PH调到7. 0-7. 2。(3)当DF-1细胞传代后约40 48h，细胞密度为90-100%单层时，将制备的PRV弱毒种毒按O. 8% 1% (v/v)的接种剂量接种到DF-1细胞单层，加入含2%血清的DMEM培养基，继续放置于37°C，CO2含量为5%的恒温培养箱中继续培养。其中所述的DMEM培养基中含1. 5g碳酸氢钠/升，PH调到7. 0-7. 2。(4)接种病毒后DF-1细胞会产生细胞病变，观察细胞病变，当细胞病变达到85%时，收获病毒液。(5)将收获的病毒液按1:1的比例与冻干保护剂混合，经真空冷冻冻干，即成猪伪狂犬活疫苗。其中所述的冻干保护剂中每IOOml含有5g蔗糖和IOg的脱脂奶粉。其中以上步骤2、3中所述的血清为国产血清，选为杭州四季青胎牛血清、武汉三利胎牛血清、兰州民海优级新生牛血清和济南劲牛新生牛血清中至少一种。其中本发明中所述的猪伪狂犬弱毒株为Bartha K61毒株，购自于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本发明所述的一种用传代鸡胚成纤维细胞制备猪伪狂犬活疫苗的方法，利用传代鸡胚成纤维细胞(DF-1)代替CEF培养PRV弱毒，并对培养工艺进行优化，例如当DF-1细胞传代后40 48h,细胞为90%到刚刚铺满单层时接种病毒,得到的病毒液毒价较高，当种毒毒价在IO7.0TCID50M IO7.5TCID50M之间时，接种剂量为O. 8% 1% (v/v)时，得到的毒价较高等。使该方法具有培养PRV病毒的操作更加简便，得到的病毒滴度更高，疫苗质量更加稳定、生产成本更低等优点。
具体实施例方式为了使本发明的技术方案更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例
本实施例中所用的猪伪狂犬弱毒株为Bartha K61毒株，购自于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。传代鸡胚成纤维细胞(DF-1)购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。将DF-1细胞用国产血清和培养基进行驯化时，培养和驯化DF-1细胞时选择了国内几个厂家的血清，分别为杭州四季青胎牛血清、武汉三利胎牛血清、兰州民海优级新生牛血清和济南劲牛新生牛血清。在驯化初期DF-1细胞不能很好的适应国产血清和国产培养基，增出现细胞产生大量空泡的现象。将这四种国产血清中均加入一定量的进口血清，进行连续传代，最终使DF-1细胞逐渐适应国产血清，将四种血清培养驯化的DF-1细胞进行细胞状态的对比，包括细胞形态、生长速度、贴壁速度、边缘折光率等因素判断，发现4种血清培养DF-1细胞状态差别不大，因为济南劲牛的新生牛血清成本较低，适合大规模生产中降低成本的要求，因此，该方案最终确定培养DF-1细胞时用济南劲牛的新生牛血清。
培养和驯化DF-1细胞时选择了国内清大天一的DMEM培养基代替。使用清大天一 DMEM培养基粉剂13. 78克和1. 5克的碳酸氢钠溶于IL水中，调PH到7. O到7. 2之间，培养的DF-1细胞前向每升培养基中加入80ml的济南劲牛新生牛血清。
具体实施步骤如下1、制备PRV弱毒种毒，用9 11日龄的SPF鸡胚去头、四肢和内脏，制备鸡胚成纤维细胞。将猪伪狂犬病毒(PRV)弱毒株接种原代鸡胚成纤维细胞(CEF)，培养约72h，待细胞病变达到80%时收获病毒液， 将收获的病毒液反复冻融3次，得到猪伪狂犬病毒弱毒种毒。同时测定PRV弱毒种毒的TCID5tl，测定的PRV种毒的毒价为107_4TCID5(l/ml。
2、DF_1细胞长满单层后，进行细胞传代。先用PBS洗涤两次，加入适量胰蛋白酶消化液，平放IOs左右，观察细胞消化情况，如果发现细胞层出现模糊不清，则弃掉胰酶，加入适量的培养液(含8%血清的DMEM)，用玻璃吸管轻轻吹打至细胞分散为单个细胞。种子细胞瓶数与被接种细胞瓶数可按1:2的比例进行传代。传代后的DF-1细胞置37°C的5%C02的恒温培养箱中培养；3、DF-1细胞在培养箱中培养约48h，取出细胞观察细胞状态机密度。传代的DF-1细胞状态良好，细胞密度约为90% 100%。此时将DF-1细胞弃去培养液，用PBS洗涤2次，然后将制备的PRV弱毒种毒以O. 8%的浓度接种DF-1细胞单层，置37°C的含5%C02的恒温培养箱中吸附lh，弃去病毒液，加入细胞维持液，置37°C的含5%C02的恒温培养箱中继续培养。 培养约96h时，观察细胞病变约达到85%收获病毒，细胞表现为细胞变圆、脱落。
4、收获的病毒液经无菌检验，病毒含量测定，安全检验合格后，按1:1的比例加入 5%的蔗糖脱脂乳及适量的抗生素定量分装，经真空冷冻冻干，即成猪伪狂犬活疫苗。
权利要求
1.一种用传代鸡胚成纤维细胞制备猪伪狂犬活疫苗的方法，其特征在于培养方法及步骤如下(O先制备原代鸡胚成纤维细胞(CEF)，在CEF细胞制备后20-28h，将猪伪狂犬病毒 (PRV)弱毒株接种原代鸡胚成纤维细胞(CEF)，得到猪伪狂犬病毒弱毒种毒；(2)制备传代鸡胚成纤维细胞(DF-1)细胞单层，将DF-1细胞用8%血清的DMEMDMEM培养基进行驯化，放置于37°C，CO2含量为5%的恒温培养箱中培养；(3)当DF-1细胞传代后40 48h，细胞密度为90-100%单层时，将制备的PRV弱毒种毒按O. 8% 1% (v/v)的接种剂量接种到DF-1细胞单层，加入含2%血清的DMEM培养基， 放置于37°C，CO2含量为5%的恒温培养箱中继续培养；(4)接种病毒后DF-1细胞会产生细胞病变，观察细胞病变，当细胞病变达到85%时，收获病毒液；(5)将收获的病毒液按1:1的比例与冻干保护剂混合，经真空冷冻冻干，即成猪伪狂犬活疫苗。
2.根据权利要求1所述的一种用传代鸡胚成纤维细胞制备猪伪狂犬活疫苗的方法，其特征在于步骤(I)收获的猪伪狂犬病毒弱毒种毒的病毒液，反复冻融3次后按常规方法测病毒的半数感染量(TCID5tl)达到107_°TCID5Q/ml以上。
3.根据权利要求1所述的一种用传代鸡胚成纤维细胞制备猪伪狂犬活疫苗的方法，其特征在于所述的DMEM培养基为国内清大天一的DMEM培养基，其中含1. 5g碳酸氢钠/升， DMEM培养基调PH到7. 0-7. 2。
4.根据权利要求1中所述的一种用传代鸡胚成纤维细胞制备猪伪狂犬活疫苗的方法， 其特征在于其中步骤(2)、(3)中所述的血清为国产血清，选为杭州四季青胎牛血清、武汉三利胎牛血清、兰州民海优级新生牛血清和济南劲牛新生牛血清中至少一种。
5.根据权利要求1所述的一种用传代鸡胚成纤维细胞制备猪伪狂犬活疫苗的方法，其特征在于步骤(5)中，所述的冻干保护剂中每IOOml含有5g蔗糖和IOg的脱脂奶粉。
6.根据权利要求1或2中所述的一种用传代鸡胚成纤维细胞制备猪伪狂犬活疫苗的方法，其特征在于所述的猪伪狂犬弱毒株为Bartha K61毒株。
全文摘要
本发明公开了用传代鸡胚成纤维细胞制备猪伪狂犬活疫苗的方法，首先将猪伪狂犬病毒(PRV)弱毒株接种原代鸡胚成纤维细胞(CEF)，得到猪伪狂犬病毒弱毒种毒，然后制备DF-1细胞单层，将制备的PRV弱毒种毒接种DF-1细胞单层，置于恒温培养箱中培养，最后观察细胞病变选择合适的时间收获病毒液，收获的病毒液经真空冷冻冻干，即成猪伪狂犬活疫苗。该方法利用传代鸡胚成纤维细胞(DF-1)代替原代鸡胚成纤维细胞CEF培养PRV弱毒，并对培养工艺进行系统的优化，使该方法具有培养PRV病毒的操作更加简便，得到的病毒滴度更高，疫苗质量更加稳定、生产成本更低等优点。
文档编号C12R1/93GK102988974SQ20121054179
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者徐明明, 杨灵芝, 张静 申请人:山东滨州沃华生物工程有限公司