专利名称：一种ska1基因检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型属于生物技术领域，具体涉及ー种SKAl基因检测试剂盒。
背景技术：
SKAl (The spindle and kinetochore associated complex subunit 丄ノ—因定位于染色体18q21.1，编码含有255个氨基酸、分子量约为30kDa的蛋白。目前对SKAl蛋白结构的研究还不深入，只明确了其在N端具有卷曲螺旋结构域(Rual JF, VenkatesanK，Hao T，et al. Towards a proteome-scale map oi the human protein-proteininteraction network. Nature 2005;437:1173-1178.)。最初质谱分析结果表明，SKAl 蛋白被确定为纺锤体的组成部分(Cheeseman IMj Brew C, Wolyniak M, et al.1mplicationof a novel muitiprotein Damlp complex m outer kinetochore function.j CellBiol. 2001;155:1137-1145.)。后来通过酵母双杂试验，发现了纺锤体着丝点复合物(Thespindle and kinetochore associated complex，SKA)的另ー个亚基SKA2，体外和体内研究結果均表明，SKAl和SKA2相互作用形成稳定的复合体，对于SKA2的稳定以及SKA蛋白在着丝点和微管中的定位是必须的(Hanisch A.，Sillje HHW, Nigg EA. Timely anaphase onsetrequires a novel spinale and kinetochore complex comprising Skal ana Ska2. EMBOJ. 2006;25:5504-5515. )。SKA复合体对于有丝分裂至关重要，可以使所有染色体的着丝点都排列在赤道板平面上，这对于确保染色体均等分配和維持基因组稳定性十分必要。有丝分裂后期，染色体在纺锤体着丝点微管的作用下移向两极，并导致纺锤体检查点沉默，在这个过程中SKAl复合体也是必须的蛋白。然而在当时的研究中，SKAl蛋白在染色体分离中的作用并没有阐述清楚。2009年在Dev Cell和EMBO J杂志上的报道阐述了 SKAl复合体在着丝点和微管界面 上发挥功能，并与微管直接作用，在微管上形成低聚装配体，沿着微管以ー种解聚-偶联的方式运动，參与有丝分裂期间染色体的运动(Welburn JPI, GrishchukEL,BackerしB，et al. The human kinetochore Skai complex facilitates microtubuledepolymerization-coupled motility. Dev Cell 2009;16:374-385. X基因组研究表明，SKAl基因所处的18q21.1与慢性淋巴细胞白血病的发生有关(Crowther-bwanepoel D, Broderick P, Di Bernardo MC, et al. Common variants at2q37. 3, 8q24. 21, 15q21. 3and 16q24.1influence chronic lymphocytic leukemia risk.Nature genetics 2010;42:132-136.)。这意味着SKAl基因可能通过调节有丝分裂过程、细胞周期进展的方式參与肿瘤细胞的恶性増殖。另外，在最初解析SKAl蛋白功能的研究中，以微管解聚药物噻氨酯咕唑(nocodazole)和秋水仙碱(colchicine)处理细胞,发现SKAl蛋白在着丝点中的积聚水平降低；对阻滞于有丝分裂期间的细胞，加nocodazole处理，可导致SKAl蛋白和微管先后从着丝点上脱离；相反地，当细胞免除了 nocodazole的处理吋，SKAl蛋白在着丝点上的定位得以恢复，相应的，纺锤体重新形成。而微管稳定剂紫杉醇(taxol),并没有影响SKAl蛋白在着丝点上的定位(Sauer G, Korner R, HanischA, et al. Proteome analysis oi the human mitotic spindle. Mol Cel丄 Proteomics2005;4:35-43.)。这些研究都提示了 SKAl基因可能影响某些抗肿瘤药物敏感性。因此，了解SKAl基因在肿瘤中的表达情况，具有很强的临床实用价值。
实用新型内容本实用新型所要解决的技术问题就是针对目前对SKAl基因表达检测特异性不强，检测成本较高而且检测方法较复杂的不足之处，提供一种特异性高，使用简便的SKAl基因检测试剂盒。本实用新型解决上述技术问题所采取的技术方案之ー为ー种SKAl基因检测试剂盒，其包括盒体，衬垫，装有PCR缓冲液的试管，装有Taq酶的试管，装有内參标准品的试管，装有SKAl基因上游检测引物的试管，装有SKAl基因下游检测引物的试管，装有内參标准品引物的试管，阴性对照管和阳性对照管，所述的衬垫设置于盒体内，衬垫上设有容器孔，所述的装有PCR缓冲液的试管，装有Taq酶的试管，装有内參标准品的试管，装有SKAl基因上游检测引物的试管，装有SKAl基因下游检测引物的试管，装有内參标准品引物的试管，阴性对照管和阳性对照管放置于容器孔内。其中所述衬垫上的容器孔较佳的为8个，所述的容器孔在衬垫上较佳地为分成两排平行排列。每个容器孔内分别放置上述装有PCR缓冲液的试管，装有Taq酶的试管，装有内參标准品的试管，装有SKAl基因上游检测引物的试管，装有SKAl基因下游检测引物的试管，装有内參标准品引物的试管，阴性对照管和阳性对照管。本实用新型所述SKAl基因检测试剂盒，较佳地还包括一装有去离子水的试管，所述衬垫上还设有装有该去离子水的试管的容器孔。其中所述PCR缓冲液为本领域常规PCR缓冲液。所述PCR缓冲液优选地为5XPCR缓冲液，所述5XPCR缓冲液较佳 地包括dNTPs，MgCl2和荧光染料SYBR Green0其中所述dNTPs为常规dNTPs。所述MgCl2浓度较佳地为4 6mM。其中所述SKAl基因上游检测引物序列为5’ -GATGAGTTCA ATGGTGTTCCTTC-3’ ；SKAl 基因下游检测引物序列为5’ -CCTTTGGTATCCTTCGTTTCTTC-3 。其中所述内參标准品引物为GAPDH 基因 5’ 引物，其序列为5’ -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’ ；GAPDH 基因 3’ 引物，其序列为5’ -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。其中所述Taq酶为本领域常规Taq DNA聚合酶。所述Taq DNA聚合酶较佳地为目前商品化的各种Taq DNA聚合酶。所述Taq DNA聚合酶的生产厂商较佳地为TAKARA，NewEngland biolabs, Invitrogen 或Promega。其中所述内參标准品优选GAPDH基因。其中所述阴性对照为本领域常规的阴性对照，本实用新型优选为无SKAl基因表达的cDNA样本。其中所述阳性对照为本领域常规的阳性对照，本实用新型优选为有SKAl基因表达的cDNA样本。其中所述去离子水为本领域常规去离子水。本实用新型所述SKAl基因检测试剂盒可以高效检测SKAl基因的表达情況。所述检测较佳地在荧光定量PCR仪上进行，所述荧光定量PCR仪较佳地为各种商品化的荧光定量PCR仪。所述突光定量PCR仪的厂商较佳地为Applied Biosystems公司或Bio-rad公司。[0018]本实用新型所述SKAl基因检测试剂盒的保藏条件较佳地为_4°C，尽量减少反复冻融。本实用新型所述SKAl基因检测试剂盒的较佳应用实例为首先通过提取组织总RNA，逆转录获得cDNA。其次，用无菌去离子水将标准品稀释为IX IO8 IX IO12拷贝/ml。第三步，配制荧光定量PCR反应液1μ I检测样品，样品分别为第一步所得逆转录产物cDNA，标准品(GAPDH基因)，阴性对照(不含SKAl基因的cDNA样本)和阳性对照(含有SKAl基因的cDNA样本)，5μ I 5XPCR缓冲液，Ιμ SKAl基因检测引物，I μ I内参标准品引物，O. 5μ I Taq DNA聚合酶和16. 5 μ I去离子水。反应液总体积为25 μ 1，在荧光定量PCR仪上进行反应。qPCR反应程序优选地为(I) 95O I 分钟，(2)95°C5 秒，(3)60°C 20秒，读板，其中步骤(2) (3)重复40个循环；(4) 65°C 95°C，每循环提高O. 5°C，维持5秒后读板，绘制熔解曲线。根据熔解曲线分析扩增产物，确定无非特异性扩增，根据所得的标准曲线，分别计算样本中SKAl基因和GAPDH的表达量(拷贝/μ 1)，SKAl基因与GAPDH表达量的比值即为SKAl基因的表达指数。 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本实用新型各较佳实例。本实用新型所用试剂和原料均市售可得。本实用新型的积极进步效果在于本实用新型提供的SKAl基因检测试剂盒通过优化设计SKAl基因的引物和PCR条件，克服了普通荧光定量PCR检测步骤复杂，假阳性率高的缺陷，不仅保证了荧光定量PCR反应的高灵敏性，而且使被检测基因的特异性大大提高。所述SKAl基因检测试剂盒设计合理，无需针对SKAl基因设计荧光探针，检测操作方便而且节约成本。
图1为SKAl基因检测试剂盒结构不意图。图2 (A)为阴性对照的SKAl基因扩增曲线图。其中a为阴性对照重复1，b为阴性对照重复2，c为阴性对照重复3。图2 (B)为阴性对照的SKAl基因熔解曲线图。其中a为阴性对照重复1，b为阴性对照重复2，c为阴性对照重复3。图3 (A)为阳性对照的SKAl基因扩增曲线图。其中d为阳性对照重复1，e为阳性对照重复2，f为阳性对照重复3。图3 (B)为阳性对照SKAl基因熔解曲线图。其中d为阳性对照重复1，e为阳性对照重复2，f为阳性对照重复3。图4 (A)为检测样本的SKAl基因扩增曲线图。其中g为检测样本重复1，h为检测样本重复2，i为检测样本重复3。图4 (B)为检测样本SKAl基因熔解曲线图。其中g为检测样本重复I, h为检测样本重复2，i为检测样本重复3。图5 (A)为阴性对照GAPDH基因扩增曲线图。其中a为阴性对照重复I，b为阴性对照重复2，c为阴性对照重复3。图5 (B)为阳性对照GAPDH基因扩增曲线图。其中d为阳性对照重复l，e为阳性对照重复2，f为阳性对照重复3。图5 (C)为检测样本GAPDH基因扩增曲线图。其中g为检测样本重复1，h为检测样本重复2，i为检测样本重复3。图6 (A)为阴性对照GAPDH基因熔解曲线图。其中a为阴性对照重复I，b为阴性对照重复2，c为阴性对照重复3。图6 (B)为阳性对照GAPDH基因熔解曲线图。其中d为阳性对照重复l，e为阳性对照重复2，f为阳性对照重复3。图6 (C)为检测样本GAPDH基因熔解曲线图。其中g为检测样本重复1，h为检测样本重复2，i为检测样本重复3。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本实用新型，但并不因此将本实用新型限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。所述的室温为本领域常规的室温温度，较佳地为20 40°C。逆转录试剂盒=TAKARA大连，商品编号D6110A，7500型定量PCR仪美国ABI公司，Trizol 试剂，DEPC 水美国 Invitrogen 公司，异丙醇，乙醇，氯仿试剂上海国药集团化学试剂有限公司，SYBR Green 突光染料美国 Ivitrogen 公司。实施例1SKAl基因检测试剂盒结合图1，本实 用新型所述SKAl基因检测试剂盒包括盒体1，衬垫2，装有PCR缓冲液的试管3，装有Taq酶的试管4，装有内参标准品的试管5，装有SKAl基因上游检测引物的试管6，装有SKAl基因下游检测引物的试管7，装有内参标准品引物的试管8，阴性对照管9和阳性对照管10。其中衬垫2设置于盒体I内，衬垫2上设有8个容器孔，所述的容器孔在衬垫2上分成两排平行排列。每个容器孔内分别放置上述装有PCR缓冲液的试管3，装有Taq酶的试管4，装有内参标准品的试管5，装有SKAl基因上游检测引物的试管6，装有SKAl基因下游检测引物的试管7，装有内参标准品引物的试管8，阴性对照管9和阳性对照管10。其中PCR缓冲液的成分包括SYBR Green荧光染料，MgCl2和dNTPs。其中，SKAl基因上游检测引物序列为5’ -GATGAGTTCA ATGGTGTTCCTTC-3’ ；SKAl 基因下游检测引物序列为5’ -CCTTTGGTATCCTTCGTTTCTTC-3’。其中内参标准品引物为3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因检测引物GAPDH 基因 5’ 引物，其序列为5，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’ ；GAPDH 基因 3’ 引物，其序列为5’ -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。其中内参标准品是GAPDH基因。其中阴性对照为无SKAl表达的cDNA样本，阳性对照为有SKAl表达的cDNA样本。本试剂盒保存于_4°C，尽量减少反复冻融。实施例2SKA1基因检测试剂盒对肺癌组织中SKAl基因表达的检测I组织总RNA提取(I)取200mg临床病理标本肺癌组织，放到1. 5ml EP管中，加入ImlTrizol剪碎。(2)震荡 30s。(3)加O. 2ml氯仿，剧烈摇动15s,室温5min。[0059](4) 12000rpm, 4°C 离心，15min。(5)吸上层无色水相，移入另一 EP管中(约O. 5ml)。(6)加等体积异丙醇，-20°C，30min。(7) 12000rpm,4°C离心，IOmin,得到 RNA 沉淀。(8)弃上清，加75%乙醇1ml，混匀。(9) 12000rpm,4°C离心，lOmin。(10)重复步骤(8)- (9)(11)弃上清，室温干燥IOmin。(12)将沉淀溶于 8 μ I DEPC水，取 2 μ I 测 0D260/0D280，RNA浓度为 3. 95 μ g/μ I。2逆转录合成cDNA 采用TAKARA反转录试剂盒，商品号D6110A，在PCR管(EP管冲配制15 μ I混合液OligodT (IOppM) 7. 5 μ 1，dNTP Mixture (IOmM) I μ 1，前述步骤所得总 RNA 产物 O. 5 μ g，其余部分为DEPC处理过的水。将上述反应体系在72°C处理10分钟，置于冰上。在上述PCR管(EP管)中配制以下反转录反应液上述变性、退火后反应液15 μ 1，5XPrime Script 缓冲液 4 μ I, RNA 酶抑制剂(40U/μ I) O. 5 μ I, Prime Script 逆转录酶(200U/ μ I) 0. 5 μ I,反应液总体积为20 μ I。逆转录反应程序为(I) 42 °C，50 分钟，(2) 50°C，10 分钟，(3) 95°C，10 分钟，(4)置于冰上。所得逆转录产物可以保存于-20°C冰箱，或直接进行检测。3荧光定量PCR检测SKAl基因表达采用实施例1所述SKAl基因检测试剂盒。首先配制荧光定量PCR反应液1 μ I检测样品，样品分别为步骤2所得逆转录产物cDNA、阴性对照(不含SKAl基因的cDNA样本)和阳性对照(含有SKAl基因表达的cDNA样本)，引物分别为SKAl基因上游检测引物、SKAl基因下游检测引物和内参标准品引物。内参标准品引物不与SKAl引物同时使用，而是同一次qPCR中分别使用内参标准品引物及SKAl上游引物和下游引物。正反向引物混合物O. 8μ1，5μ1 PCR缓冲液，O. 5μ I Taq DNA聚合酶和17. 7 μ I去离子水，反应液总体积为25 μ I。将装有不同样品的PCR管放入荧光定量PCR仪进行反应，PCR反应程序为(I) 95O I 分钟，(2)95°C5 秒，(3)60°C 20秒，读板，其中步骤(2) (3)重复40个循环；(4) 65°C 95°C，每循环提高O. 5°C，维持5秒后读板，绘制溶解曲线。结果分析根据荧光定量PCR结果绘制阴性对照，阳性对照以及检测样本中SKAl基因的扩增曲线和熔解曲线，同时绘制内参标准品GAPDH基因的扩增曲线和熔解曲线，其结果分别如图2 (A、B)，图3 (A、B)，图4 (A、B)，图5 (A、B、C)和图6 (A、B、C)所示。将荧光定量PCR数据进行统计分析，根据熔解曲线分析扩增产物，确定无非特异性扩增。从阳性对照样品扩增曲线可知，SKAl基因检测试剂盒能特异性检测SKAl基因阳性标准分子，其检测结果为阳性，而阴性对照样品没有规则扩增曲线，检测结果为阴性。对荧光定量PCR结果数据使用法进行分析，阳性对照中SKAl基因表达平均数值为1，误差为(±0. 0426)，肺癌组织中SKAl基因表达平均数值也同样为1，误差为(±0.0767)，阴性对照由于未扩增出条带，所以表达数值为(_)。其数据分析结果如表I和表2所示。 表I荧光定量PCR扩增结果
权利要求1.一种SKAl基因检测试剂盒，其特征在于，其包括盒体(I )，衬垫(2)，装有PCR缓冲液的试管(3)，装有Taq酶的试管(4)，装有内参标准品的试管(5)，装有SKAl基因上游检测弓I 物的试管(6)，装有SKAl基因下游检测引物的试管(7)，装有内参标准品引物的试管(8)，阴性对照管(9)和阳性对照管(10)，所述的衬垫(2)设置于盒体(I)内，衬垫(2)上设有容器孔，所述的装有PCR缓冲液的试管(3)，装有Taq酶的试管(4)，装有内参标准品的试管(5)， 装有SKAl基因上游检测引物的试管(6 )，装有SKAl基因下游检测引物的试管(7 )，装有内参标准品引物的试管(8)，阴性对照管(9)和阳性对照管(10)放置于容器孔内。
2.如权利要求1所述的SKAl基因检测试剂盒，其特征在于，所述衬垫(2)上的容器孔有8个，每个容器孔内分别放置装有PCR缓冲液的试管(3)，装有Taq酶的试管(4)，装有内参标准品的试管(5)，装有SKAl基因上游检测引物的试管(6)，装有SKAl基因下游检测引物的试管(7)，装有内参标准品引物的试管(8)，阴性对照管(9)和阳性对照管(10)。
3.如权利要求2所述的SKAl基因检测试剂盒，其特征在于，所述的容器孔在衬垫(2) 上分成两排平行排列。
4.如权利要求1所述的SKAl基因检测试剂盒，其特征在于，所述的SKAl基因检测试剂盒还包括一装有去离子水的试管，所述衬垫(2)上还设有装有所述去离子水的试管的容器孔。
专利摘要本实用新型公开了一种SKA1基因检测试剂盒，其包括盒体(1)，衬垫(2)，其中衬垫(2)设置于盒体(1)内，衬垫(2)上设有容器孔。每个容器孔内分别放置装有PCR缓冲液的试管(3)，装有Taq酶的试管(4)，装有内参标准品的试管(5)，装有SKA1基因上游检测引物的试管(6)，装有SKA1基因下游检测引物的试管(7)，装有内参标准品引物的试管(8)，阴性对照管(9)和阳性对照管(10)。该检测试剂盒使用简便，检测特异性高。
文档编号C12Q1/68GK202881273SQ2012205698
公开日2013年4月17日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者姚阳, 沈赞, 劳昕元, 余文熙 申请人:上海黄离生物科技有限公司