专利名称：鉴别中国与欧洲牛肝菌的分子特异性标记引物及方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴别中国牛肝菌Boletus roseoflavus与欧洲牛肝菌B.appendiculatus的分子特异性标记引物，以及一种利用该引物对中国与欧洲牛肝菌标本进行快速辨别的方法。
背景技术：
Boletus roseoflavus 和 B.appendiculatus 均隶属于牛肝菌目 Boletales 下Boletus 属的 Appendiculati Konrad & Maubl.ex Lannoy & EstadSs 类群。到目前为止，仅发现B.roseoflavus分布于中国，B.appendiculatus分布于欧洲。中国B.roseoflavus的鉴别特征为菌盖淡粉红色、紫红色、玫瑰红色，菌肉暴露在空气中不变蓝，或缓慢变蓝，菌孔受伤后立刻变蓝，担孢子的平均长宽比小于3。欧洲B.appendiculatus的鉴别特征为菌盖浅色到深褐色，不带有粉红色彩；菌肉暴露在空气中显著变蓝，菌孔受伤变蓝；担孢子的平均长宽比小于3。这二个种在菌盖颜色上存在明显差异，但子实体形态特征较为相似，菌肉、菌孔的变色反应也很接近。自2005年以来，分布于浙江的B.roseoflavus标本被我国的菌物学家错误地冠以了欧洲B.appendiculatus的种名，国内一些文献对此有过记载。事实上，B.roseoflavus与B.appendiculatus并非同种，迄今在中国尚未发现有真正的B.appendiculatus存在,这一结论后来也得到了分子数据的支持。对B.roseoflavus与B.appendiculatus这二个相似种辨别的主要特征是宏观上的子实体颜色差异和变色 反应以及生境。但由于颜色差异易受生境、气候、土壤、子实体生长期、生理状况等的影响而常常导致主观判别上的偏差，而对于长期保藏的干标本，特别是对古老标本、模式标本的重新鉴别研究，仅凭颜色差异更是难以准确鉴定。因此，在大型真菌分类研究上，分子技术已成为了对标本辅助鉴定的重要手段。真菌的核糖体基因rRNA的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS)的保守性基本上表现为种内相对一致，种间差异比较明显，这一特点使得ITS区段不仅适合于属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析，而且非常适合于真菌物种的分子鉴定。对B.roseoflavus和B.appendiculatus的ITS区测序结果显示，B.roseoflavus 和 B.appendiculatus 的 ITS1-5.8S-1TS2 序列长度分别为 690_706bp 和600-690bp，很难利用通用引物对(如ITS1/ITS4或ITS5/ITS4)的PCR扩增、普通电泳来进行准确辨别。对这二个相似种的ITS序列比对显示二者的局部序列存在较大差异，这为设计ITS特异引物，针对性地扩增ITS特异片段，以方便用于这二个相似种的分子辅助鉴定提供了可能性。
发明内容
本发明目的是提供一种可鉴别中国牛肝菌B.roseoflavus和欧洲牛肝菌B.appendiculatus的分子特异性标记引物，以及一种利用该引物对中国和欧洲牛肝菌进行快速辨别的方法。
本发明采用的技术方案是:一种鉴别中国牛肝菌B.roseoflavus和欧洲牛肝菌B.appendiculatus的分子特异性标记引物，其核苷酸序列如下:上游引物:5'-CTTGCTCAGCCCAACTCAACG-3'下游引物:5'-ATCTCTGGGTGGAGCATGTGCACG-3'该引物对是采用PCR技术,经过对中国牛肝菌标本B.roseoflavus和欧洲牛肝菌标本B.appendiculatus的核糖体基因ITS区序列的克隆测序，以得到的ITS序列进彳丁喊基差异比对，并以此设计ITS特异性引物对。以该引物对B.roseoflavus和B.appendiculatus标本进行PCR扩增，可从B.roseoflavus中获得625bp大小的特异性片段。本发明还涉 及所述的分子特异性标记引物在鉴别中国牛肝菌B.roseoflavus和欧洲牛肝菌B.appendiculatus中的应用。本发明还涉及一种利用所述分子特异性标记引物鉴别中国牛肝菌B.roseoflavus和欧洲牛肝菌B.appendiculatus的方法，所述方法包括:提取待测牛肝菌标本基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现625bp的DNA条带,则待测牛肝菌为B.roseoflavus,若电泳结果未出现625bp的DNA条带，则待测牛肝菌为B.appendiculatus ；所述分子特异性标记引物序列为:上游引物:5'-CTTGCTCAGCCCAACTCAACG-3'下游引物:5'-ATCTCTGGGTGGAGCATGTGCACG-3'所述方法关键在于扩增引物的选择、DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。需要说明的是，本发明分子特异性标记引物和检测方法仅适用于中国牛肝菌B.roseoflavus和欧洲牛肝菌B.appendiculatus的鉴别，即待测标本是限定为中国牛肝菌标本B.roseoflavus和欧洲牛肝菌标本B.appendiculatus的范围内的，本领域普通技术人员可根据子实体形态特征和颜色先进行初步的判断，再将判断为B.roseoflavus或B.appendiculatus的牛肝菌标本用本发明方法进行鉴别。在过去的很多年里，中国牛肝菌B.1Oseoflavus标本被错误鉴定为欧洲牛肝菌B.appendiculatus种，对二者的正确辨别主要通过子实体颜色和变色反应上的些许差异，但对颜色差异的判别具有很强的主观性，常常出现偏差，而且对于干标本，特别是古老标本已很难仅仅通过颜色差异来准确鉴定。采用本发明方法，可对相似种B.roseoflavus和B.appendiculatus进行快速的分子鉴定,方法简单、快捷、准确，是形态特征辨别的有效辅助。所述PCR扩增反应体系组成如下(总体积25 μ L):
权利要求
1.一种鉴别中国牛肝菌B.roseof Iavus和欧洲牛肝菌B.appendiculatus的分 子特异性标记引物，其核苷酸序列如下: 上游引物:5' -CTTGCTCAGCCCAACTCAACG-3' 下游引物:5' -ATCTCTGGGTGGAGCATGTGCACG-3'。
2.如权利要求1所述的分子特异性标记引物在鉴别中国牛肝菌B.1Oseoflavus和欧洲牛肝菌B.appendiculatus中的应用。
3.一种利用权利要求1所述分子特异性标记引物鉴别中国牛肝菌B.roseoflavus和欧洲牛肝菌B.appendiculatus的方法，所述方法包括:提取待测牛肝菌标本基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现625bp的DNA条带,则待测牛肝菌为B.roseoflavus,若电泳结果未出现625bp的DNA条带,则待测牛肝菌为B.appendiculatus ;所述分子特异性标记引物序列为: 上游引物:5' -CTTGCTCAGCCCAACTCAACG-3' 下游引物:5' -ATCTCTGGGTGGAGCATGTGCACG-3'。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR扩增条件如下:94°C预变性6min后；94°C变性40s，60°C退火40s，72°C延伸2min，共30个循环；最后于72°C补平7min，终止温度为4°C。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于方法如下: (1)取待测牛肝菌标本子实体，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待测牛肝菌的基因组DNA ； (2)以步骤(I)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记 引物作为扩增引物，进行PCR扩增: PCR反应体系每25 μ L组成如下:
全文摘要
本发明提供了一种可鉴别中国牛肝菌B.roseoflavus和欧洲牛肝菌B.appendiculatus的分子特异性标记引物，以及一种利用该引物对中国牛肝菌B.roseoflavus和欧洲牛肝菌B.appenidculatus进行快速辨别的方法。所述分子特异性标记引物核苷酸序列如下上游引物5′-CTTGCTCAGCCCAACTCAACG-3′下游引物5′-ATCTCTGGGTGGAGCATGTGCACG-3′本发明的有益效果主要体现在本发明分子特异性标记引物可对近缘种中国牛肝菌B.roseoflavus和欧洲牛肝菌B.apPendiculatus进行快速的分子鉴定，方法简单、快捷、准确，是形态特征辨别二种牛肝菌的有效辅助。
文档编号C12Q1/68GK103173541SQ20131003833
公开日2013年6月26日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者王丽玲, 李海波, 钱华, 魏海龙, 胡传久 申请人:浙江省林业科学研究院