专利名称：用于将纳米颗粒输入细胞的载体系统及方法
技术领域：
本发明涉及纳米材料领域，具体地涉及用于在体外或离体状态下通过超声波诱导，利用微气泡的空化效应将纳米颗粒无损、高效输入细胞内，为纳米生物医学的研究提供安全、方便、准确定量控制各种纳米颗粒输入细胞的载体系统及方法。
背景技术：
功能纳米材料对生物医学的影响具有深远的意义，纳米生物医学的发展进程，在很大程度上取决于纳米材料的发展。纳米生物医学应用中纳米材料的种类极其繁多，其具体功能和应用目的也多种多样，如在医学影像对比度增强、组织修复、免疫测定、药物传输和细胞分选等方面有着广阔的应用前景。纳米材料广泛的生物医学应用前景激励着世界各国的研究者对纳米材料的生物学效 应有更深入的认识和操控能力，尤其在细胞层面，因为细胞是生物体结构和功能的基本单位，也是生命活动的基本单位。细胞亦是一个复杂的体系，纳米颗粒进入细胞内的命运、以及对微环境的影响与其能否在生物医学领域应用有着至关重要的影响。纳米颗粒被输送到细胞中的第一步是能够准确到达靶细胞的表面，一旦被输送到细胞表面，纳米颗粒能够跨过细胞膜进入细胞。当前研究纳米颗粒与细胞相互作用的主要方式是共孵育，可利用的纳米颗粒的输运方法的基本技术主要是通过内吞或吞噬机制，在此基础上为了使细胞迅速有效的摄取纳米粒子，亦可通过合理的纳米颗粒表面修饰、纳米化学和纳米颗粒表面连接相关的生物分子等方式实现。然而，这种方法具有特定的特点和限制，在靶细胞培养中实现纳米颗粒的有效输送必须克服一系列的障碍，并避免在靶细胞中产生毒性效果以及能够在细胞中有效传输纳米颗粒以及纳米颗粒装载的功能性成分。如在纳米颗粒与细胞共孵育过程中可能会引起细胞膜破裂，细胞骨架紊乱。还有大量体外研究证实，多种细胞(肾上腺嗜铬细胞瘤、肝癌细胞、肺上皮细胞、巨噬细胞等)吞噬纳米颗粒(如Fe304或Y-Fe2O3等纳米材料)后，细胞内的各种酶的降解会使细胞受到不同程度的损伤，表现为细胞呼吸运动活性降低，分裂分化受阻，细胞凋亡等。因此，有效的输送方法一方面应当保证纳米颗粒更高效聚集到靶细胞膜表面，提高输送效率，还需要调控纳米颗粒进入细胞的途径，从而避免颗粒进入细胞内带来的毒副作用。本发明拟制备膜壳表面装载靶向特异性分子的脂质微气泡，然后将纳米颗粒通过静电吸附等方式偶联到微气泡表面，利用微气泡对超声场的特异性响应以及表面修饰的特异性分子靶标，不仅可有效将纳米颗粒输送到靶细胞表面，而且在较高超声能量作用下，微气泡破泡产生空化效应时的瞬时声穿孔可将纳米颗粒无损输送进入靶细胞内，从而增加纳米颗粒进入细胞的效率和安全性，为纳米生物医学研究纳米材料对细胞的作用影响提供一种新的输送载体系统和方法。
发明内容
技术问题:有微气泡存在时，生物组织或细胞与超声波的相互作用可出现多种生物学效应。当在低声压(< 0.1MPa)作用下时，微气泡有规律的伸缩振动能对超声波进行回波反射，从而用于微气泡超声显影成像；当在高声压(> 0.1MPa)作用下时，微气泡由于剧烈的伸缩振动而发生破裂，导致微气泡周围的生物组织或细胞出现热效应、声穿孔或声辐照力等生物效应，可将外源性物质瞬时输运进入细胞，实现活细胞的诊断和药物治疗等多种功能。因此，本发明制备的微气泡结构可被作为新型的纳米颗粒传输载体系统，实现纳米颗粒高效率、无损输入细胞内，从而在生物医学领域进行应用。
本发明的目的在于提供一种可携带各种纳米颗粒的微气泡结构，并通过调控体外超声辐射参数条件，为实现纳米颗粒或其携带的生物活性成分高效、无损、安全、靶向输入细胞提供新型载体系统及方法。具体目的包括:(1)制备表面携带特异性靶向分子的脂质微气泡结构，并通过静电作用等将拟输运的纳米颗粒吸附到微气泡结构上；(2)通过超声显影技术监测纳米颗粒在细胞表面的聚集；(3)通过调控体外超声辐照参数条件，控制微气泡的破泡，实现纳米颗粒无损、安全输入细胞。
技术方案: 本发明的第一方面，用于将纳米颗粒输入细胞的载体系统，其特征在于:该载体系统为脂质微气泡，其通过以下步骤制备: (1)将选自蛋黄卵磷脂EPC、卵磷脂PC、大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC、聚乙二醇化二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC-PEG、聚乙二醇化二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPE-PEG、胆固醇Chol中的一种或多种均匀混合于氯仿溶剂中以制备混合液； (2)将混合液置于旋转蒸发干燥器中蒸发干燥，然后置于干燥器中移除痕量溶剂，得到干燥的脂质膜； (3)将干燥的脂质膜加入磷酸盐缓冲液，置于震荡仪中振荡以水化该脂质膜； (4)将水化的脂质膜置于超声空化仪中，向水化的脂质膜中通入气体的同时进行超声空化，得到微气泡溶液； (5)使用磷酸盐缓冲液洗涤微气泡溶液，然后加入抗生物素蛋白，在0°C振荡；再经磷酸盐缓冲液洗涤后，加入细胞特异性抗体，在0°C振荡，最后再次加入磷酸盐缓冲液进行洗涤，即获得所述载体系统。
优选地，所述脂质微气泡呈球状，其粒径为100 ηπΓ5 μ m，更优选为200 ηπΓ μ m0
优选地，在步骤(2)中将混合液置于旋转蒸发干燥器中于30°C下蒸发干燥。
优选地，在步骤(3)中置于震荡仪中振荡30 min-2 h。
优选地，在步骤(4)中超声空化10-60 min，超声空化功率为80-180 W。
优选地,在步骤(4)中通入的气体为氮气、氩气、氧气或全氟化碳。
优选地，在步骤(5)中加入抗生物素蛋白时在0°C振荡30 min-2 h ;加入细胞特异性抗体时在(TC振荡30 min-2 h。
本发明所述的抗生物素蛋白和细胞特异性抗体是指生物技术领域中常见的抗生物素蛋白和细胞特异性抗体。抗生物素蛋白包括链霉抗生物素蛋白等，细胞特异性抗体包括血管表皮生长因子(VEGFR)、P-选择素、细胞表面粘附分子(VCAM-1)、新生血管抗体(RGD)、整合素(αν β 3)、叶酸等。上述仅是列举，并不表示对抗生物素蛋白和细胞特异性抗体范围的限制。本发明的第二方面，用于将纳米颗粒输入细胞的方法，其特征在于包括以下步骤:
A、通过层层自组装正负电荷吸附相互作用或通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、戊二醛或N-琥珀酰亚胺基-3- (2-吡啶二硫基)丙酸酯将纳米颗粒与微气泡表面化学偶联，将纳米颗粒吸附到上述的用于将纳米颗粒输入细胞的载体系统的微气泡表面上；
B、使用磷酸盐缓冲液洗涤经过培养的细胞，然后加入步骤A的载体系统中，室温放置一段时间后再次使用磷酸盐缓冲液洗涤，得到吸附微气泡的细胞溶液；
C、将吸附微气泡的细胞溶液置于超声场中进行超声处理，超声波的发射选用平阵探头或聚焦探头，频率为0.5-10 MHz，声强为0.1-2 MPa。优选地，步骤A所述纳米颗粒为超顺磁纳米颗粒(Magnetic nanoparticles,MNPs)、银纳米颗粒、金纳米颗粒或量子点纳米颗粒。超顺磁纳米颗粒主要包括四氧化三铁(Fe3O4)> Y _ 二氧化_■铁(Y - Fe2O3X优选地，步骤C中频率为1-6 MHz，声强为0.5-1.5 MPa。本发明所述脂质微气泡作为纳米颗粒输入细胞的载体系统的机理为:微气泡内部包裹的气体赋予了该微气泡具有响应超声波辐射的特性，当微气泡携带纳米颗粒到达细胞表面后，可在低强度超声波辐照条件下进行超声成像观察。同时利用微气泡在高强度超声能量辐照条件下，微气泡的破泡可以释放装载的纳米颗粒，实现纳米颗粒高效转载进入细胞，而毒副作用较小。在这个过程中，超声场中微气泡的振动一方面促进了细胞的胞吞作用，另一方面，能够利用微气泡在细胞周围产生的强烈微射流和剪切应力，导致细胞膜表面瞬时穿孔或组织渗透性增加，从而有效促进纳米颗粒瞬时无损进入细胞内。本发明所述细胞主·要包括肝癌细胞系、乳腺癌细胞系等肿瘤细胞以及淋巴细胞。收集培养的细胞后加入上述载体系统，放置一段时间后，洗脱未偶联到细胞表面的微气泡，实现纳米颗粒在细胞周围的聚集，得到表面吸附携带纳米颗粒的微气泡的细胞溶液。通过超声成像观察细胞表面携带纳米颗粒的微气泡的分布情况。有益效果:
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种简便及对细胞具有低毒副作用的载体和方法将纳米颗粒转载进入细胞。此种微气泡由于超声场导向实现靶向运输，不仅在运送过程中不会使纳米颗粒分布到其他部位，而且可通过微气泡在细胞周围的破泡使纳米颗粒快速、高效率输入细胞内。本发明的有益效果主要包括以下两个方面:
(I)本发明所述的靶向微气泡能够通过表面的功能性蛋白质携带纳米颗粒并将纳米颗粒运送到细胞周围，从而提高了纳米颗粒在细胞周围的聚集效率，同时利用微气泡的超声显影能够通过超声图像对细胞周围分布的纳米颗粒进行影像学观察。(2)本发明所述微气泡聚集到细胞周围后，在超声波辐照条件下破泡，能够瞬时无损将细胞周围的纳米颗粒输入细胞内，在纳米颗粒高效率输入细胞的前提下，能够避免当前纳米颗粒与细胞长时共孵育方式引起的细胞膜破裂，细胞骨架紊乱以及细胞凋亡等毒副作用。从而为利用纳米颗粒标记细胞进行活细胞成像，以及纳米颗粒装载生物活性成分释放进入活细胞实现生物活性成分的传输等研究方面提供新型的载体系统和方法。说明书附1说明携带纳米颗粒的微气泡以及在细胞表面特异性吸附的光学显微图像。
图2说明通过体外建立和调控超声波参数条件，实现纳米颗粒输入细胞的实验装置的示意性说明。
具体实施方式
由上述可知，本发明提供了一种用于将纳米颗粒输入细胞的载体系统和方法，该纳米颗粒通过吸附到微气泡结构并被运送到细胞表面后，利用超声波微气泡的破泡将纳米颗粒瞬时高效率输送到细胞内部。
本发明描述了为在体外输送纳米颗粒而设计的微气泡载体系统，该微气泡利用表面修饰的特异性细胞靶向分子以及在超声场作用下的响应作用，从而聚集到细胞周围；被输送的纳米颗粒则通过静电吸附等方式被微气泡载体系统携带。该微气泡载体系统具有三个令人满意的特征。它可以通过静电吸附等方式将拟输送的纳米颗粒装载上去。它可以利用表面修饰的靶向分子实现将纳米颗粒运载到细胞周围。最重要的是它可以对超声场产生响应，在低强度超声辐照下，进行超声成像，在高强度超声辐照下，实现破泡并将细胞周围的纳米颗粒高效率输入细胞内。
所述微气泡的外壳对于在稳定的胶状溶液中保持微气泡之间很好地分离是非常重要的。各种缓冲液和细胞培养基的稳定性对于微气泡在通过各种生物化学耦合技术进行表面修饰的有用性和有效性以及对活细胞的效果方面很关键。对于细胞识别分子在微气泡表面的化学耦合，通过NHS (N-羟基磺酸琥珀酰亚胺酯)、戊二醛结合其它化学方法，带有氨基的靶向分子可以被引入到能够进行化合物偶联的所述微气泡的表面。要在体外或离体状态下被输送至细胞的纳米颗粒可以通过共价相互作用、静电相互作用结合到外壳上。如果输送的纳米颗粒表面带负电荷，则很容易地利用携带正电荷微气泡膜壳分子如氨基聚乙二醇分子吸附到微气泡结构表面。
在本发明的一个实施方式中描述了一种方法，其中，使用本发明的微气泡在体外或离体状态下将物质输送到培养的细胞中。所需要的一种或多种纳米颗粒通过静电作用或化学共价作用结合到所述的表面。将微气泡/纳米颗粒复合物与细胞进行混合。所述的微气泡表面可以携带能结合到祀细胞表面特定的祀位点的亲和分子。所述的纳米颗粒通过微气泡的破泡在细胞膜表面形成的瞬时声穿孔，纳米颗粒能够从微气泡载体上快速进入细胞。在超声场辐照前，微气泡与细胞的孵育时间将影响输送过程，因此，对于特定的细胞系需要分别优化孵育时间。此外，超声场施加的频率、声强和作用时间也应根据特定的细胞系进行优化，以使纳米颗粒能够高效率输入细胞内，但是对细胞的毒副作用最低。
处理后的细胞被纳米颗粒自动标记，根据输入不同纳米颗粒的不同性质可进行相应的纳米生物医学应用研究。若输送的是量子点纳米颗粒，则可以通过光学成像的方法进行观察纳米颗粒在细胞内的分布。如输送的是磁性纳米颗粒，则可以通过核磁共振成像对纳米颗粒进入细胞后的分布进行跟踪观察。
在下文中给出了优选的实施方式。然而，本发明可以包括多种不同的形式，不应当认为本发明限于本文中列出的说明性的实施方式。而且，提供的这些实施方式是为了使公开充分，并使本领域的技术人员更充分地理解本发明的范围。
实施例1:用于将纳米颗粒输入细胞的载体系统，其特征在于:该载体系统为脂质微气泡，其通过以下步骤制备:
(1)将蛋黄卵磷脂EPC均匀混合于氯仿溶剂中以制备混合液；
(2)将混合液置于旋转蒸发干燥器中于30°C下蒸发干燥，然后置于干燥器中移除痕量溶剂，得到干燥的脂质膜；
(3)将干燥的脂质膜加入磷酸盐缓冲液，置于震荡仪中振荡30min-2 h以水化该脂质
膜；
(4)将水化的脂质膜置于超声空化仪中，向水化的脂质膜中通入氮气的同时进行超声空化10-60 min，超声空化功率为80-180 W，得到微气泡溶液；
(5)使用磷酸盐缓冲液洗涤微气泡溶液，然后加入抗生物素蛋白，在0°C振荡30min-2h ;再经磷酸盐缓冲液洗涤后，加入细胞特异性抗体血管表皮生长因子(VEGFR)，在0°C振荡30 min-2 h，最后再次加入磷酸盐缓冲液进行洗涤，即获得所述载体系统。用于将纳米颗粒输入细胞的方法，其特征在于包括以下步骤:
(1)将表面携带氨基正电荷的Y-Fe2O3纳米溶液加入表面携带负电荷的上述载体系统中，室温振荡30 min-2 h后，获得表面携带Fe2O3纳米颗粒的微气泡载体系统；
(2)使用磷酸盐缓冲液洗涤经过培养的细胞，然后加入步骤(I)的载体系统中，室温放置一段时间后再次使用磷酸盐缓冲液洗涤，得到吸附微气泡的细胞溶液；
(3)将吸附微气泡的细胞溶液置于超声场中进行超声处理，超声波的发射选用平阵探头或聚焦探头，频率为8 MHz ，声强为0.1MPa0实施例2
用于将纳米颗粒输入细胞的载体系统，其特征在于:该载体系统为脂质微气泡，其通过以下步骤制备:
(1)将卵磷脂PC和大豆卵磷脂均匀混合于氯仿溶剂中以制备混合液；
(2)将混合液置于旋转蒸发干燥器中于30°C下蒸发干燥，然后置于干燥器中移除痕量溶剂，得到干燥的脂质膜；
(3)将干燥的脂质膜加入磷酸盐缓冲液，置于震荡仪中振荡30min-2 h以水化该脂质
膜；
(4)将水化的脂质膜置于超声空化仪中，向水化的脂质膜中通入氩气的同时进行超声空化10-60 min，超声空化功率为80-180 W，得到微气泡溶液；
(5)使用磷酸盐缓冲液洗涤微气泡溶液，然后加入抗生物素蛋白，在0°C振荡30min-2h;再经磷酸盐缓冲液洗涤后，加入细胞特异性抗体P-选择素，在(TC振荡30 min-2 h，最后再次加入磷酸盐缓冲液进行洗涤，即获得所述载体系统。用于将纳米颗粒输入细胞的方法，其特征在于包括以下步骤:
(1)将表面携带柠檬酸负电荷的银纳米溶液加入表面携带正电荷的上述载体系统中，室温振荡30 min-2 h后，获得表面携带银纳米颗粒的微气泡载体系统；
(2)使用磷酸盐缓冲液洗涤经过培养的细胞，然后加入步骤(I)的载体系统中，室温放置一段时间后再次使用磷酸盐缓冲液洗涤，得到吸附微气泡的细胞溶液；
(3)将吸附微气泡的细胞溶液置于超声场中进行超声处理，超声波的发射选用平阵探头或聚焦探头，频率为0.5 MHz，声强为2 MPa。
实施例3 用于将纳米颗粒输入细胞的载体系统，其特征在于:该载体系统为脂质微气泡，其通过以下步骤制备: (O将卵磷脂(PO、聚乙二醇化二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPE-PEG)、胆固醇均匀混合于氯仿溶剂中以制备混合液； (2)将混合液置于旋转蒸发干燥器中于30°C下蒸发干燥，然后置于干燥器中移除痕量溶剂，得到干燥的脂质膜； (3)将干燥的脂质膜加入磷酸盐缓冲液，置于震荡仪中振荡30min-2 h以水化该脂质膜； (4)将水化的脂质膜置于超声空化仪中，向水化的脂质膜中通入氧气的同时进行超声空化10-60 min，超声空化功率为80-180 W，得到微气泡溶液； (5)使用磷酸盐缓冲液洗涤微气泡溶液，然后加入抗生物素蛋白，在0°C振荡30min-2h ;再经磷酸盐缓冲液洗涤后，加入细胞特异性抗体细胞表面粘附分子(VCAM-1)，在0°C振荡30 min-2 h，最后再次加入磷酸盐缓冲液进行洗涤，即获得所述载体系统。
用于将纳米颗粒输入细胞的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)利用上述载体系统中微气泡表面的聚乙二醇(PEG)长链，通过碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联剂将聚乙二醇带有的羧基与Y - Fe2O3颗粒表面的氨基结合，获得表面携带Y - Fe2O3纳米颗粒的微气泡载体系统； (2)使用磷酸盐缓冲液洗涤经过培养的细胞，然后加入步骤(I)的载体系统中，室温放置一段时间后再次使用磷酸盐缓冲液洗涤，得到吸附微气泡的细胞溶液； (3)将吸附微气泡的细胞溶液置于超声场中进行超声处理，超声波的发射选用平阵探头或聚焦探头，频率为4 MHz，声强为0.8 MPa。
实施例4 用于将纳米颗粒输入细胞的载体系统，其特征在于:该载体系统为脂质微气泡，其通过以下步骤制备: (1)将蛋黄卵磷脂(EPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、聚乙二醇化二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC-PEG)和胆固 醇均匀混合于氯仿溶剂中以制备混合液； (2)将混合液置于旋转蒸发干燥器中于30°C下蒸发干燥，然后置于干燥器中移除痕量溶剂，得到干燥的脂质膜； (3)将干燥的脂质膜加入磷酸盐缓冲液，置于震荡仪中振荡30min-2 h以水化该脂质膜； (4)将水化的脂质膜置于超声空化仪中，向水化的脂质膜中通入氧气的同时进行超声空化10-60 min，超声空化功率为80-180 W，得到微气泡溶液； (5)使用磷酸盐缓冲液洗涤微气泡溶液，然后加入抗生物素蛋白，在0°C振荡30min-2h;再经磷酸盐缓冲液洗涤后，加入细胞特异性抗体新生血管抗体(RGD)，在0°C振荡30min-2 h，最后再次加入磷酸盐缓冲液进行洗涤，即获得所述载体系统。
用于将纳米颗粒输入细胞的方法，其特征在于包括以下步骤: (I)将表面携带柠檬酸负电荷的金纳米溶液加入表面携带正电荷的上述载体系统中，室温振荡30 min-2 h后，获得表面携带金纳米颗粒的微气泡载体系统；(2)使用磷酸盐缓冲液洗涤经过培养的细胞，然后加入步骤(I)的载体系统中，室温放置一段时间后再次使用磷酸盐缓冲液洗涤，得到吸附微气泡的细胞溶液；
(3)将吸附微气泡的细胞溶液置于超声场中进行超声处理，超声波的发射选用平阵探头或聚焦探头，频率为1MHz，声强为1.5 MPa。实施例5
用于将纳米颗粒输入细胞的载体系统，其特征在于:该载体系统为脂质微气泡，其通过以下步骤制备:
(1)将大豆卵磷脂、卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、聚乙二醇化二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC-PEG)和胆固醇均匀混合于氯仿溶剂中以制备混合液；
(2)将混合液置于旋转蒸发干燥器中于30°C下蒸发干燥，然后置于干燥器中移除痕量溶剂，得到干燥的脂质膜；
(3)将干燥的脂质膜加入磷酸盐缓冲液，置于震荡仪中振荡30min-2 h以水化该脂质
膜；
(4)将水化的脂质膜置于超声空化仪中，向水化的脂质膜中通入全氟化碳的同时进行超声空化10-60 min，超声空化功率为80-180 W，得到微气泡溶液；
(5)使用磷酸盐缓冲液洗涤微气泡溶液，然后加入抗生物素蛋白，在0°C振荡30min-2h;再经磷酸盐缓冲液洗涤后，加入细胞特异性抗体叶酸，在0°C振荡30 min-2 h，最后再次加入磷酸盐缓冲液进行洗涤，即获得所述载体系统。用于将纳米颗粒输入 细胞的方法，其特征在于包括以下步骤:
(1)利用上述载体系统中微气泡表面的两端分别是氨基和羧基的聚乙二醇与叶酸结合，然后通过碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联剂将聚乙二醇带有的羧基与表面带有半胱氨酸修饰的量子点纳米颗粒结合，获得表面携带量子点纳米颗粒的微气泡载体系统；
(2)使用磷酸盐缓冲液洗涤经过培养的细胞，然后加入步骤(I)的载体系统中，室温放置一段时间后再次使用磷酸盐缓冲液洗涤，得到吸附微气泡的细胞溶液；
(3)将吸附微气泡的细胞溶液置于超声场中进行超声处理，超声波的发射选用平阵探头或聚焦探头，频率为6 MHz，声强为0.5 MPa。取样观察初检实施例1-5的载体系统微气泡浓度为(f 10)X IO7个/ml，粒径分布为I 5 μ m。结果表明，通过超声场处理，80-90%的微气泡破裂，80-90%的纳米颗粒从微气泡上释放出来。说明，通过超声场的辐照，纳米颗粒能够实现从微气泡表面的释放，有利于颗粒高效率进入细胞。携带还得请杨芳点)乙二醇个例子一般和前面权利要求相区别、冲液的样品一个样品共价作用或范德华力作用将金纳米通入氧气型的装将实施例1-5方法处理后的溶液用磷酸盐缓冲液洗涤，通过清洗细胞分离未进入细胞的纳米颗粒。再将细胞样品培养过夜。用胰酶消化每一个样品，采用MTT法测定细胞活性、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒测定细胞的凋亡情况。在上述实施例中保证纳米颗粒高效率输入细胞的的同时细胞仍显示高活性，其存活率为70%-90%。采用暗场显微镜、颗粒染色光学显微镜、颗粒携带FITC荧光成分后的荧光显微镜、透射电镜(TEM)等方式对经过超声辐照处理后的细胞进行纳米颗粒在细胞内运输分布的检测，可以看出纳米颗粒能够容易地且快速地进入细胞，并均匀地分布在整个细胞中。
采用根据本发明的基于携带纳米颗粒是微气泡，提供了一种性能良好的纳米颗粒载体系统，该系统通过超声场辐照条件参数的控制实现了纳米颗粒在细胞中的特异性吸收和富集。 ·
权利要求
1.用于将纳米颗粒输入细胞的载体系统，其特征在于:该载体系统为脂质微气泡，其通过以下步骤制备: (1)将选自蛋黄卵磷脂EPC、卵磷脂PC、大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC、聚乙二醇化二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC-PEG、聚乙二醇化二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPE-PEG、胆固醇Chol中的一种或多种均匀混合于氯仿溶剂中以制备混合液； (2)将混合液置于旋转蒸发干燥器中蒸发干燥，然后置于干燥器中移除痕量溶剂，得到干燥的脂质膜； (3)将干燥的脂质膜加入磷酸盐缓冲液，置于震荡仪中振荡以水化该脂质膜； (4)将水化的脂质膜置于超声空化仪中，向水化的脂质膜中通入气体的同时进行超声空化，得到微气泡溶液； (5)使用磷酸盐缓冲液洗涤微气泡溶液，然后加入抗生物素蛋白，在0°C振荡；再经磷酸盐缓冲液洗涤后，加入细胞特异性抗体，在0°C振荡，最后再次加入磷酸盐缓冲液进行洗涤，即获得所述载体系统。
2.根据权利要求1所述的用于将纳米颗粒输入细胞的载体系统，其中所述脂质微气泡呈球状，其粒径为100 ηπΓ5 μ m，更优选为200 ηπΓ μ m。
3.根据权利要求1所述的用于将纳米颗粒输入细胞的载体系统，其中在步骤(2)中将混合液置于旋转蒸发干燥器中于30°C下蒸发干燥。
4.根据权利要求1所述的用于将纳米颗粒输入细胞的载体系统，其中在步骤(3)中置于震荡仪中振荡30 min-2 h。
5.根据权利要求1所述的用于将纳米颗粒输入细胞的载体系统，其中在步骤(4)中超声空化10-60 min，超声空化功率为80-180 W。
6.根据权利要求1所述的用于将纳米颗粒输入细胞的载体系统，其中在步骤(4)中通入的气体为氮气、IS气、氧气或全氟化碳。
7.根据权利要求1所述的用于将纳米颗粒输入细胞的载体系统，其中在步骤(5)中加入抗生物素蛋白时在(TC振荡30 min-2 h ;加入细胞特异性抗体时在(TC振荡30 min-2 h。
8.用于将纳米颗粒输入细胞的方法，其特征在于包括以下步骤: A、通过层层自组装正负电荷吸附相互作用或通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、戊二醛或N-琥珀酰亚胺 基-3- (2-吡啶二硫基)丙酸酯将纳米颗粒与微气泡表面化学偶联，从而将纳米颗粒吸附到权利要求1-8中任一项所述的用于将纳米颗粒输入细胞的载体系统的微气泡表面上； B、使用磷酸盐缓冲液洗涤经过培养的细胞，然后加入步骤A的载体系统中，室温放置一段时间后再次使用磷酸盐缓冲液洗涤，得到吸附微气泡的细胞溶液； C、将吸附微气泡的细胞溶液置于超声场中进行超声处理，超声波的发射选用平阵探头或聚焦探头，频率为0.5-10 MHz，声强为0.1-2 MPa。
9.根据权利要求8所述的用于将纳米颗粒输入细胞的方法，其中步骤A所述纳米颗粒为超顺磁纳米颗粒(Magnetic nanoparticles, MNPs)、银纳米颗粒、金纳米颗粒或量子点纳米颗粒。
10.根据权利要求8所述的用于将纳米颗粒输入细胞的方法，其中步骤C中频率为1-6MHz，声强为 0.5-1.5 MPa。
全文摘要
本发明涉及用于将纳米颗粒输入细胞的载体系统，所述载体系统通过以下方法制备首先通过一种或多种磷脂制备脂质膜，然后将水化的脂质膜超声空化得到微气泡溶液，最后加入抗生物素蛋白和细胞特异性抗体。本发明还涉及用于将纳米颗粒输入细胞的方法，具体步骤为将纳米颗粒吸附到上述载体系统的微气泡表面上，然后加入经过培养的细胞，最后将吸附微气泡的细胞溶液置于超声场中进行超声处理。本发明利用微气泡的空化效应将纳米颗粒无损、高效输入细胞内，为纳米生物医学的研究提供安全、方便、准确定量控制各种纳米颗粒输入细胞的载体系统及方法。
文档编号C12N5/09GK103243073SQ201310174739
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月13日 优先权日2013年5月13日
发明者杨芳, 顾宁 申请人:东南大学