专利名称：一种高效表达重组普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌及其获得方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体是一种高效表达重组普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌及其获得方法。
背景技术：
普鲁兰酶(Pullulanase，EC3.2.1.41)可专一性地水解多糖的α-1，6_糖苷键，使支链淀粉型多糖的分支链脱离主链，在淀粉加工工业中有着重要的用途。与α-淀粉酶、糖化酶配合使用生产医用葡萄糖时，可将淀粉彻底降解为葡萄糖，并可使葡萄糖的结晶明显加快，提高设备利用率。与β_淀粉酶配合使用，几乎可以将淀粉100%地转化成麦芽糖，从而得到0.8g/ml以上的超高麦芽糖浆；在啤酒生产中添加普鲁兰酶可提高糖的利用率，缩短糖化时间。目前，我国工业上所用的普鲁兰酶主要是从丹麦诺维信公司进口，商品名为piOmozyme，是应用最广、产量最大的普鲁兰酶，占领了中国乃至世界上的大部分市场份额。promozyme由基因重组的地衣芽孢杆菌生产，基因来源为嗜酸普鲁兰芽孢杆菌，发酵产酶水平约100-400U/ml。该菌株所产的普鲁兰酶受温度影响较大，在60°C酶活最大，45°C和65°C时活力为60°C的二分之一，30°C时相对酶活仅为20%，而70°C相对酶活已经小于10%。此酶对pH的适应范围也较耐热产硫梭菌所产的普鲁兰酶窄，最适pH为5.0，pH为4.0和6.0时相对酶活降至50%以下。而长野芽孢杆菌中的普鲁兰酶在60°C时测得最适pH为5.0，在PH4.5条件测得最适温度为62.50C ;此酶热稳定性较好，在pH4.5、60°C与淀粉水解物共同保存232h仍有50%的残余酶活，而来源于嗜酸普鲁兰芽孢杆菌的普鲁兰酶同样条件下保存121个小时就损失50%的活力。1999年Teague ff.Martin等人克隆长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因，并在原核生物表 达系统枯草芽孢杆菌中利用质粒重组表达，发酵113h后最高酶活可达813U/ml，产生的重组普鲁兰酶具有很好的应用特性。来源于嗜热菌的普鲁兰酶也是一个研究热点。这类普鲁兰酶有较好的耐热性能，可以拓宽此酶在淀粉水解领域的应用范围。例如来源于粘液硫还原球菌(Desulfurococcusmucosus)的普鲁兰酶的最适温度为85°C，在80°C酶活可以在四个小时内基本保持不变，在85°C的酶活半衰期为50分钟。2000年Fiona Duffner等人克隆了粘液硫还原球菌普鲁兰酶基因，并在枯草芽孢杆菌表达系统中利用质粒重组表达。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)不产内毒素，无致病能力，是一种食品级的安全微生物。同时，由于它具有高效的蛋白表达和分泌能力，已被广泛应用于酶制剂等生物制品的生产。外源蛋白的表达通常通过质粒或整合两种方式实现，其中整合表达具有稳定性好，生产过程无需使用抗生素等优点，是酶制剂产业化的重点研究方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够高效表达重组普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌菌株及其获得方法。利用整合质粒将普鲁兰酶表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组中，构建整合型重组枯草芽孢杆菌，利用该菌在液体培养基中进行发酵，得到普鲁兰酶。本发明解决上述技术问题的技术方案如下:一种能够以整合型的方式表达普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌菌株，菌株染色体中包含外源普鲁兰酶表达元件；所述的外源普鲁兰酶表达元件包含如下组分:能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子，能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断和普鲁兰酶基因；所述的能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子为来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重叠启动子P43,或来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)甘油三磷酸脱氢酶基因glpD的启动子；所述的能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断为来源于高温产硫化氢梭状芽孢杆菌(Clostridium thermosulfurogenes)的β -淀粉酶基因信号肽DNA片断，或来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的α-乙酰乳酸脱羧酶基因信号肽DNA片断；所述的海藻糖合成 酶基因为来源于长野芽胞杆菌(Bacillus naganoensis)的普鲁兰酶基因，或来源于粘液硫还原球菌(Desulfurococcus mucosus)的普鲁兰酶基因。上述的重组枯草芽孢杆菌菌株的方法，该方法的步骤为:将普鲁兰酶表达元件克隆到枯草芽孢杆菌整合质粒上，得到的重组质粒转化宿主枯草芽孢杆菌，挑选外源基因通过双交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组枯草芽孢杆菌。上述的枯草芽孢杆菌整合质粒为整合质粒PMLK83及其衍生质粒，或pAXOl及其衍生质粒；上述的宿主枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌168衍生菌株，包括1A751，WB600,和WB800。用此以整合型的方式表达普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌菌株来生产普鲁兰酶的操作步骤如下:I) 一级种的制备:将枯草芽孢杆菌基因工程菌株单菌落在4ml LB液体培养基37°C、220rpm培养过夜，所得的菌种为一级种；2) 二级种的制备:将一级种接种于800ml LB液体培养基，于37°C，220rpm培养至0D600为0.6左右(培养4 5小时)；3)三级种的制备:将二级种接种到80L LB液体发酵罐中，37°C，以柠檬酸、NaOH控pH7.0左右，通风搅拌，溶氧控制在20 30%，培养至0D600为0.6左右(培养5 6小时)；4)生产罐发酵:将三级种接种到3T发酵罐中，LB液体培养基，36 38°C，通风搅拌，溶氧控制在20 30%，以柠檬酸、NaOH控pH6 8，培养约26小时，IOOOOg离心力离心除菌，用截留分子量5000 10000超滤膜浓缩上清液后，即得普鲁兰酶浓缩原液。本发明首次将普鲁兰酶表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体中，以该菌作为菌种，常规的生产工艺，发酵生产普鲁兰酶。本发明的优点是:本发明利用食品安全的表达系统生产普鲁兰酶，整合型表达的菌株所含的外源基因能够稳定传代和高效表达，产品达到食品要求，产品无抗菌活性。
具体实施例方式避免表达系统中质粒不稳定的最有效途径是使用枯草芽孢杆菌整合质粒，将外源基因整合到枯草芽孢杆菌染色体中，外源基因随染色体的复制而复制和表达，这样外源基因在宿主中可保持较好的稳定性。本发明用到的整合质粒PMLK83和pAXOl购自美国俄亥俄州立大学Bacillus遗传保藏中心(BGSC, http://www.bgsc.0rg)。pMLK83质粒有两段与枯草芽孢杆菌淀粉酶基因同源的DNA序列(同源臂)，在这两段同源臂中有新霉素抗性基因；pAX01质粒有两段与枯草芽孢杆菌β-半乳糖苷酶基因同源的DNA序列(同源臂)，在这两段同源臂中有红霉素抗性基因。另外这两种质粒有大肠杆菌复制子而无枯草芽孢杆菌复制子，因此能在大肠杆菌中复制而不能在枯草芽孢杆菌中复制。质粒转化到枯草芽孢杆菌时，通过新霉素或红霉素抗性选择，只有整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组菌才能生长，这样就筛选出重组子。下面结合实施例对本发明作进一步描述。但需要说明的是，实施例并不构成对本发明要求保护范围的限制。实施例1本实例将包含来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重叠启动子P43启动子，来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的α-乙酰乳酸脱羧酶基因信号肽DNA片断和来源于长野芽胞杆菌(Bacillus naganoensis)的普鲁兰酶基因单顺反子的普鲁兰酶表达元件克隆到整合质粒PMLK83。1.构建重组质粒pMLK83-P43根据Genbank中注释的启动子P43序列，设计上游引物为5’ attgctggacgcttatggac3’ 和下游弓 I 物为 5’ cgggatccattcctctcttacctataat3>。PCR反应体系IOOul:DNA 模板(枯草芽孢杆菌1A751总DNA) Iul (约20ng)，5 X PrimeSTARBuffer20ul, 10pmol/ul dNTP2ul, lOpmol/ul 正反向引物各为 2ul, 2.5U/ul PrimeSTARHSDNA 聚合酶 lul，添加 ddH20 至 100ul。PCR 反应程序:94 °C 5min ；94°C 30s, 60 °C 30s,72°C lmin，30个循环；72°C IOmin ;4°C保存。PCR片段和质粒pMLK83用限制性内切酶BamH1、Hind III分别进行双酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5a中，经筛选鉴定获得重组质粒PMLK83-P43。2.构建重组质粒 pMLK83-P43-bnPul人工合成如下DNA片断:I GGATCCATGA AAAAAAATAT CATCACTTCT ATCACATCTC TGGCTCTGGT51 TGCCGGGCTG TCTTTGACTG CTTTTGCAGC TACAACGGAT GGGAACACCA101 CAAACATCGT AGTCCATTAT TTTCGTCCTA GTGGGGATTA TACGGATTGG151 AATCTTTGGA TGTGGCCGGA GAACGGTGAT GGGGCTGAGT ATGATTTTAA201 TCAACCGACT GATTCTTATG GGGAGGTTGC AAGTGTGGAC ATTCCTGGAA251 ACCCAAGTCA AGTAGGGATT ATTGTCCGTA AAGGAAATTG GGATGCGAAA301 GACATTGATA GTGACCGCTA CATCGATTTA AGCAAAGGGC ATGAGATTTG351 GCTCGTCCAA GGAAACAGCC AGATTTTCTA TAGTGAAAAG GATGCTGAGG401 CAGCCGCACA ACCTGCTGTA AGTAACGCTT ATTTAGATGC TTCCAACCAA
权利要求
1.一种能够以整合型的方式表达普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，其获得方法为: 将普鲁兰酶表达元件克隆到枯草芽孢杆菌整合质粒上，得到的重组质粒转化宿主枯草芽孢杆菌，挑选外源基因通过双交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组枯草芽孢杆菌； 所述的外源普鲁兰酶表达元件包含如下组分:能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子，能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断和普鲁兰酶基因； 所述的能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子为来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重叠启动子P43,或来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)甘油三磷酸脱氢酶基因glpD的启动子； 所述的能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断为来源于高温产硫化氢梭状芽孢杆菌(Clostridium thermosulfurogenes)的β -淀粉酶基因信号肽DNA片断，或来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的α-乙酰乳酸脱羧酶基因信号肽DNA片断； 所述的海藻糖合成酶基因为来源于长野芽胞杆菌(Bacillus naganoensis)的普鲁兰酶基因，或来源于粘液硫还原球菌(Desulfurococcus mucosus)的普鲁兰酶基因； 所述的枯草芽孢杆菌整合质粒为整合质粒PMLK83及其衍生质粒，或pAXOl及其衍生质粒; 所述的宿主枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌168衍生菌株，包括1A751，WB600,和WB800。
2.根据权利要求1所 述的一种能够以整合型的方式表达普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，用其来生产普鲁兰酶的操作步骤如下: 1)一级种的制备:将菌株单菌落在4mlLB液体培养基37°C、220rpm培养过夜，所得的囷种为一级种； 2)二级种的制备:将一级种接种于800mlLB液体培养基，于37°C，220rpm培养至0D600为0.6左右(培养4 5小时)； 3)三级种的制备:将二级种接种到80LLB液体发酵罐中，37°C，以柠檬酸、NaOH控PH7.0左右，通风搅拌，溶氧控制在20 30%，培养至0D600为0.6左右(培养5 6小时)； 4)生产罐发酵:将三级种接种到3T发酵罐中，LB液体培养基，36 38°C，通风搅拌，溶氧控制在20 30%，以柠檬酸、NaOH控pH6 8，培养约26小时，IOOOOg离心力离心除菌，用截留分子量5000 10000超滤膜浓缩上清液后，即得普鲁兰酶浓缩原液。
全文摘要
本发明公开了一种高效表达重组普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌及其获得方法。具体是将普鲁兰酶表达元件以同源重组的方式整合到枯草芽孢杆菌染色体中构建整合型重组枯草芽孢杆菌，以此重组枯草芽孢杆菌为菌种，在营养培养基中发酵生产普鲁兰酶。本发明的优点是本发明利用食品安全的表达系统表达生产普鲁兰酶，整合型表达的菌株所含的外源基因能够稳定传代和表达，产品达到食品要求，产品无抗菌活性。
文档编号C12N1/21GK103224949SQ20131017469
公开日2013年7月31日 申请日期2013年5月13日 优先权日2013年5月13日
发明者李晓明, 黄日波, 韦玉琴, 李丛, 蒙健宗, 梁莲华, 陆迪, 廖东庆, 韦航 申请人:南宁邦尔克生物技术有限责任公司