抗cd20的人单克隆抗体的制作方法

抗cd20的人单克隆抗体的制作方法
【专利摘要】公开了分离的结合并抑制人CD20的人单克隆抗体，以及相关的基于抗体的组合物和分子。所述人抗体可以通过转染瘤或在非人转基因动物，例如，转基因小鼠中进行生产，所述转基因动物能够通过进行V-D-J重组和同种型转换产生多同种型的人单克隆抗体。还公开了含有所述人抗体的药物组合物，产生所述人抗体的非人转基因动物和杂交瘤，以及利用所述人抗体的治疗和诊断方法。
【专利说明】抗CD20的人单克隆抗体
[0001]本申请是申请号为“200380106690.9”，发明名称为“抗CD20的人单克隆抗体”的发明专利申请的分案申请。
[0002]相关申请
[0003]本申请要求递交于2002年10月17日的美国临时申请号60 / 419163，和递交于2003年4月2日的美国临时申请号60 / 460028的优选权，二者标题都是抗⑶20的人单克隆抗体，本文将二者的全部内容并入作为参考。
[0004]发明背景
[0005]⑶20分子(也称为人B淋巴细胞限制性分化抗原或Bp35)是前B细胞和成熟B淋巴细胞上的疏水性跨膜蛋白，分子量大约35kD (Valentine等1989) J.Biol.Ghem.264(19):11282-11287 ;和 Einf ield 等 1988) EMBO J.7 (3):711-717)。CD20 在超过 90% 的来自外周血或淋巴组织的B细胞的表面被发现并且在早期前B细胞发育过程中表达并且保持到浆细胞分化时。⑶20存在于正常B细胞以及恶性B细胞上。特别地，⑶20在超过90%的B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)上表达(Anderson等(1984)，血液63?): 1424-1433)，但在造血干细胞、原B细胞、正常浆细胞或其它正常组织中未发现(Tedder等(1985)，免疫学杂志135(2):973-979)。
[0006]CD20蛋白的8 5个氨基酸的羧基末端区位于细胞质中。该区的长度与其它B细胞特异性表达结构如IgM、IgD和IgG重链或组织相容性抗原II类α或β链相反，所述结构分别具有相对短的3、3、28、15和16个氨基酸的胞质内区(Komaromy等(1983)NAR11:6775-6785)。在羧基端的最后61个氨基酸中，21个为酸性残基，只有2个是碱性的，提示该区具有净余的负电荷。GenBank登录号为NP_690605。
[0007]据认为⑶20可能参与B细胞的激活和分化过程中的早期步骤(Tedder等(1986)Eur.J.1mmunol.16:881-887)并且可以作为一种钙离子通道起作用(Tedder等(1990)J.Cell.Biochem.14D:195)。
[0008]尽管并不确定关于CD20在促进B细胞的增殖和/或分化中的实际作用，它还是为抗体介导的治疗提供了一种重要的靶以控制或杀死参与癌症或自身免疫病症的B细胞。尤其是，在肿瘤细胞，例如，NHL上的⑶20的表达使其成为一种重要的靶以特异性地靶向针对CD20阳性瘤细胞的治疗剂。但是，尽管到目前为止所获得的结果清楚地证实CD20为一种对于免疫疗法有用的靶，它们还显示目前现有的鼠和嵌合抗体并未构成理想的治疗剂。
[0009]因此，存在对于抗CD20的治疗性抗体的需求，所述抗体能够有效预防和/或治疗多种涉及表达⑶20细胞的疾病。
[0010]发明概述
[0011]本发明提供改进的抗体疗法以治疗和/或阻止与表达CD20细胞相关的疾病，包括肿瘤相关疾病，和免疫疾病，包括自身免疫疾病。对本发明包括的抗体进行了改进，它们是完全地人的并且因而，在患者中可能有较小的免疫原性。
[0012]如本文所例示的，发明的人抗体通过许多机制介导表达CD20的B细胞的死亡。在一个实施方案中，在细胞，如慢性B淋巴细胞白血病(Β-CLL)细胞中本发明的人抗体诱导补体依赖的细胞毒性(⑶C)，例如，至少大约20%的⑶C介导的裂解，优选大约30%的⑶C介导的裂解，更加优选大约40 %的CDC介导的裂解。在另一个实施方案中，本发明的人抗体诱导表达CD20的细胞的凋亡。在另一个实施方案中，本发明的人抗体诱导表达CD20的细胞的同型粘着。而且，本发明的人抗体在人效应细胞(例如，单核细胞、单核的细胞、NK细胞和多形核细胞)存在时可以诱导表达CD20的细胞的抗体依赖细胞的细胞毒性(ADCC)。而且，本发明的人抗体在巨噬细胞存在时可以诱导表达CD20的细胞的吞噬作用。本发明的人单克隆抗体可以通过这些机制中的一种或多种起作用。可以被本发明的人抗体杀死的细胞的例子包括，但不限于，表达CD20的B细胞，如致瘤B细胞和参与免疫疾病的B细胞。在一个特定的实施方案中，利用人抗体介导在淋巴瘤，例如非霍奇金淋巴瘤处理中的B淋巴细胞的杀伤。
[0013]本发明的人抗体包括IgGl (例如，IgGl，κ )，IgG3(例如，IgG3，κ )和IgG4(例如，IgG4, κ)抗体。但是，本发明还包括其它的抗体同种型，包括IgG2、IgM、IgAl、IgA2、分泌型IgA、IgD和IgE。抗体可以是完整的抗体或其抗原结合片段，包括，例如，Fab、F(ab’)2、Fv、单链Fv片段或双特异性抗体。而且，抗原结合片段包括结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，它包含(i)融合到免疫球蛋白铰链区多肽上的一种结合结构域多肽(如重链可变区或轻链可变区)，(ii)融合到铰链区上的一种免疫球蛋白重链CH2恒定区，和(iii)融合到CH2恒定区上的免疫球蛋白重链CH3恒定区。这类结合结构域免疫球蛋白融合蛋白在US2003 /0118592和US2003 / 0133939中得到进一步介绍。
[0014]本发明的特定人抗体包括那些称为11B8、2F2和7D8的抗体，为人重链和人κ轻链核酸及其保守的序列修饰物所编码，所述核酸分别在它们的可变区包含如SEQ ID NOs:
1、5或9和SEQ ID NOs:3、7或11中所示的核苷酸序列。在另一个实施方案中，人抗体的特征在于，具有人重链和人κ轻链可变区及其保守的序列修饰物，所述可变区分别包含如SEQ ID NOs:2,6或10和SEQ ID NOs:4、8或12中所示的氨基酸序列。
[0015]仍然在另一个实施方案中，人抗体的特征在于，具有人重链和人κ轻链可变区，所述可变区分别与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4 ;分别与SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8 ;分别与SEQ ID NO:10和SEQ ID NO: 12中所示的氨基酸序列至少90%同源，优选至少95%同源，更加优选至少98%，或至少99%同源。
[0016]本发明的其它特定人抗体包括那些包含具有人重链和轻链CDR1区、人重链和轻链CDR2区和人重链和轻链CDR3区的CDR结构域的抗体，其中
[0017](a)CDRl、CDR2 和 CDR3 人重链包含选自图 53、55*57(SEQ ID NOs: 13-15、19-21和25-27)中所示的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，及其保守的序列修饰物的氨基酸序列，和
[0018](b)CDRl、CDR2 和 CDR3 人轻链包含选自图 53、55*57(SEQ ID NOs:16-18、22-24和28-30)中所示的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，及其保守的序列修饰物的氨基酸序列。
[0019]在本发明中还包括以大约l-ΙΟηΜ或更低的解离平衡常数(KD)由⑶20中解离出来的抗体。这种抗体还包括那 些与相关的细胞表面抗原不交叉反应并且因而不抑制它们的功能的抗体。
[0020]在另一个实施方案中，本发明的抗⑶20抗体可以通过一种或多种下列特性进行特征描述:[0021]a)对于人CD20的特异性；
[0022]b)如通过本文实施例5(图9)中公开的结合实验所测定的，大约ΙΟηΜ或更低，优选大约5nM或更低，更加优选大约1_3ηΜ或更低的对CD20的结合亲和性(KD)；
[0023]c)如通过本文实施例5 (图9)中公开的解离速率实验所测定的，大约K^see—1或更低，优选大约K^sec—1或更低，更加优选大约KTsee—1或更低的由CD20中的解离速率常数(Kd)；
[0024]d)在⑶55 / 59阴性或⑶55 / 59阳性细胞上介导高水平⑶C的能力；
[0025]e)结合⑶20后转位于脂筏上的能力；
[0026]f)抑制表达⑶20的细胞生长的能力；
[0027]g)诱导表达⑶ 20的细胞凋亡的能力；
[0028]h)诱导表达⑶20的细胞同型粘着的能力；
[0029]i)在效应细胞存在时诱导表达⑶20的细胞的ADCC的能力；
[0030]j)延长具有表达⑶20的肿瘤细胞的个体存活的能力；
[0031]k)消除表达⑶20细胞的能力；和/或
[0032]1)消除表达低水平的CD20的细胞仰201的能力。
[0033]本发明的人抗⑶20抗体可以衍生自、连接于或者与其它结合特异性共表达。在一个特定的实施方案中，发明提供一种双特异性或多特异性分子，它包含至少一种对于CD20的第一结合特异性(例如，人抗CD20抗体或其模似物)和一种对于人效应细胞的第二结合特异性，如对于Fc受体(例如，人Fc y RI受体，如Fc y RI或人Fc α受体)或Τ细胞受体，例如CD3的结合特异性。
[0034]因此，本发明包括结合人⑶20和Fc受体或Τ细胞受体，例如⑶3的双特异性或多特异性分子。Fc受体的例子为，例如，人IgG受体，例如，Fey受体(Fc gamma R)，如Fc y RI (CD64)、Fc y RII (CD32)和 Fc r RIII (CD16)。其它的 Fc 受体，如人 IgA 受体(例如，Fc y RI)，也可以作为靶目标。Fc受体优选位于效应细胞，例如单核细胞、巨噬细胞或激活的单核细胞。在一个优选的实施方案中，双特异性或多特异性分子在不同于受体的免疫球蛋白Fc(例如，IgG或IgA)结合位点上结合到Fc受体上。所以，双特异性或多特异性分子的结合不被免疫球蛋白的生理水平所阻抑。
[0035]仍然在另一个方面，发明的人抗CD20抗体可以衍生自、连接于或者与其它功能性分子，例如，另一种肽或蛋白质(例如，Fab’片段)共表达。例如，本发明的抗体可以功能性连接于(例如，通过化学偶合、基因融合、非共价连接或其它)一种或多种其它分子实体，如另一种抗体(例如，产生一种双特异性或多特异性抗体)、细胞毒素、细胞配体或抗原(例如，产生一种免疫共轭物，如免疫毒素)。本发明的抗体可以连接于其它治疗部分上，例如，放射性同位素、小分子抗癌药物、抗炎剂或免疫抑制剂。因此，本发明包括大量的抗体共轭物、双特异性和多特异性分子和融合蛋白，它们都结合表达CD20的细胞并且能够用于向这些细胞靶向其它分子。
[0036]仍然在另一个方面，本发明提供组合物，例如，药学性和诊断性组合物/试剂盒，包含一种或一组本发明的人单克隆抗体一起配剂的可药用的载体。在一个特定的实施方案中，该组合物包括一组结合不同抗原表位或者具有不同功能特性，如诱导⑶C和诱导凋亡的抗体。[0037]通过将有效量的抗体、免疫共轭物、双特异性/多特异性分子或组合物与细胞接触从而抑制该细胞的生长和/或杀死该细胞，可以将本发明的人抗体、免疫共轭物、双特异性或多特异性分子和组合物用于多种方法中以抑制表达CD20的细胞的生长和/或杀死表达CD20的细胞。在一个实施方案中，该方法包括在效应细胞存在时杀死表达CD20的细胞，例如，通过⑶C、凋亡、ADCC、吞噬作用，或这些机制的两种或多种的组合。优选杀死或抑制这些细胞，而不杀死或抑制不表达CD20但可能例如表达一种结构相关的细胞表面抗原的(即，没有相关的交叉反应性但功能性地区分细胞表面抗原)细胞的活性。利用本发明的人抗体可以抑制或杀死的表达CD20的细胞包括，例如，致瘤B细胞。
[0038]因此，通过向患有这类疾病的患者给药，可以用本发明的人抗体治疗和/或预防许多涉及表达CD20的细胞的疾病。可以治疗(例如，改善)或预防的例示性的疾病包括，但不限于，致瘤性疾病和免疫疾病，例如，自身免疫疾病。可以治疗和/或预防的致瘤性疾病的例子包括B细胞淋巴瘤，例如，NHL，包括前体B细胞成淋巴细胞白血病/淋巴瘤和成熟B细胞瘤，如B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL) /小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、B细胞原淋巴细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)，滤泡淋巴瘤(FL)，包括低级、中级和高级FL，皮肤毛囊中心淋巴瘤，边缘区B细胞淋巴瘤(MALT型，结节和脾型)，毛细胞白血病，扩散大B细胞淋巴瘤，Burkitt淋巴瘤，浆细胞瘤，浆细胞骨髓瘤，移植后淋巴增生性疾病，Waldenstrom巨球蛋白血症和退行发育性大细胞淋巴瘤(ALCL)。可以治疗和/或预防的涉及表达CD22细胞的免疫疾病的例子包括牛皮癣、牛皮癣性关节炎、皮肤炎、系统性硬皮病、炎症性肠疾病(IBD)、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、呼吸窘迫综合征、脑膜炎、脑炎、色素层炎、肾小球肾炎、湿疹、哮喘、动脉粥样硬化、白细胞粘连缺乏、多发性硬化症、Raynaud综合征、Sjgren综合征、青少年起病型糖尿病、Reiter病、Behcet病、免疫复合性肾炎、IgA肾病、IgM多发性神经病、免疫介导的血小板减少症，如急性特发性血小板减少性紫癜和慢性特发性血小板减少性紫癜,溶血性贫血、重症肌无力、狼疮性肾炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎(RA)、特应性皮炎、`天疱疮、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、Wegener肉芽肿病、Omenn氏综合征，慢性肾功能衰竭、急性传染性单核细胞增多症、HIV和疱疹病毒关联疾病。进一步的例子为急性呼吸窘迫综合征和choreoretinitis。还有进一步的例子是由病毒，如Epstein-Barr病毒(EBV)感染B细胞引发的疾病和病症。
[0039]在发明的一个特定的实施方案中，用化疗剂、辐射或药剂对给药抗体的个体作进一步处理，所述药剂调节，例如，增强或抑制Fc受体,例如，Fca受体或Fcy受体的表达或活性，如一种细胞因子。在治疗中用作给药的典型细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒-巨噬细胞集落刺激因子、Y干扰素(IFN- y )和肿瘤坏死因子(TNF)。在其它药剂中典型的治疗剂包括抗瘤剂如阿霉素、顺钼、博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥和环磷酰胺。
[0040]仍然在另一个方面，本发明提供一种优选在早期，体外或体内检测样品或个体中CD20的存在，从而例如诊断CD20相关疾病的方法。这还可以对于监测疾病和治疗效果以及对于确定和调整施用抗体的剂量有用。体内方法可以利用成像技术如PET(正电子发射断层照相术)或SPECT(单光子发射计算机X线断层扫描术)进行。在一个实施方案中，这通过将待测样品，优选和对照样品一起，与本发明的人单克隆抗体在允许形成抗体和CD20间的复合物的条件下接触而实现。随后检测复合物的形成(例如，利用FACS分析或蛋白质印迹)。当和测试样品一起使用一种对照样品时，在两种样品中都对复合物进行检测并且在样品之间复合物形成中的任何统计学显著的差异都是测试样品中CD22D存在的指征。
[0041]仍然在另一个方面中，本发明提供一种转基因非人动物，如转基因小鼠，它表达结合CD20的人单克隆抗体。在一个特定的实施方案中，转基因非人动物是一种转基因小鼠，它具有编码本发明抗体的全部或部分的包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组。可以用纯化的或高浓度的CD20抗原制品和/或表达CD20的细胞对该转基因非人动物进行免疫。优选地，通过进行V-D-J重组和同种型转化，该转基因非人动物，例如转基因小鼠，能够产生多种⑶20的人单克隆抗体同种型(例如，IgG，IgA和/或IgM)同种型转化可以是经典的或非经典的同种型转化。
[0042]因此，仍然在另一个方面，本发明提供了从如上所述的表达人抗CD20抗体的转基因非人动物，例如，转基因小鼠中分离的B细胞。分离的B细胞随后可以通过与永生化细胞融合而进行永生化，以提供一和人抗CD20抗体的来源(即，杂交瘤)。这种杂交瘤(即，产生人抗⑶20的)也包括在本发明的范围之内。
[0043]如本文所例示的，本发明的抗体可以直接从表达该抗体的杂交瘤中获得，或者可以在宿主细胞(例如，CH0细胞、NS / 0细胞或淋巴细胞)中进行克隆和重组表达。宿主细胞的另外的例子为微生物，如大肠杆菌(E.coli)，和真菌，如酵母。或者，它们可以通过在转基因非人动物或植物中进行重组生产。因此，在另一个方面，本发明提供了生产结合到人CD20上的人单克隆抗体的方法。在一个实施方案中，该方法包括用纯化的或高浓度的人⑶20抗原制品和/或表达人⑶20的细胞免疫一种如前所述的转基因非人动物，例如，转基因小鼠(例如，具有包含编码抗CD20抗体的全部或部分的人重链转基因和人轻链转基因的基因组)。随后获得B细胞(例如，脾B细胞)并且与骨髓瘤细胞融合以形成分泌抗CD20人单克隆抗体的永生 的杂交瘤细胞。
[0044]仍然在另一个方面，本发明提供编码人抗CD20抗体(例如，其可变区)的核酸分子，以及包含本发明的核酸的重组表达载体，和用载体转染的宿主细胞。本发明还包括通过培养这些宿主细胞来生产抗体的方法。本发明所提供的特定核酸包含SEQ ID N0s:l、5或9和SEQ ID NOs:3、7或11中所示的核苷酸序列，它们分别编码人抗CD20抗体2F2、7D8和11B8的重链和轻链。
[0045]由下面的详细介绍和权利要求书，本发明的其它特征和益处将是显而易见的。
[0046]附图简述
[0047]图1显示用作重组生产人单克隆抗体2F2和11B8的pCON Y If /可变重载体。
[0048]图2显示用作重组生产人单克隆抗体2F2和11B8的pCONK If /可变轻载体。
[0049]图3显示用作重组生产人单克隆抗体2F2和11B8的二基因克隆载体(pCON Y If /κ 2F2)。
[0050]图4是利用流式细胞分析比较人单克隆抗体2F2、7D8和11B8结合到Raji，Daudi，和⑶20转染的NS / 0细胞和亲本NS / 0细胞的图。
[0051]图5A和5B利用流式细胞分析显示2F2与来自三个人供体的PBMC的结合。
[0052]图6是比较1251_标记的2F2和1251_标记的11B8与Ramos_EHRB细胞的结合亲和性的图。
[0053]图7A和7B显示与1251_标记的利妥希玛(嵌合性抗CD20抗体，IDEC)和1251_标记的B1 (术语B1相应于Bexxar?的未标记形式,它是mI_标记的鼠抗人⑶20抗体,Coulter)比较1251-标记的2F2和1251-标记的11B8对于Ramos-EHRB细胞(A)和Daudi细胞(B)的
结合 ?
[0054]图8是比较1251_标记的11B8T、1251-标记的2F2、125I_标记的利妥希玛和1251_标记的B1的解离速率的图。
[0055]图9显示在Ramos-EHRB细胞中2F2、11B8T和利妥希玛的F(ab’)2片段的解离速率。
[0056]图10A和10B利用流式细胞分析显示由2F2T、11B8T、7D8、利妥希玛和Daudi细胞
(A)以及SU-DHL-4细胞(B)的同型对照抗体(HuMab_KLH)在不同的时间点进行的CDC(功能性 off-rate)。
[0057]图11A-E利用流式细胞分析显示在不同细胞系中由2F2和利妥希玛诱导的⑶C的动力学。
[0058]图12A-D利用流式细胞分析显示在不同细胞系中由2F2和利妥希玛诱导的CDC作为在两种不同抗体浓度上的补体浓度(正常的人血清(NHS))的功能。
[0059]图13A-D利用流式细胞分析显示在不同细胞系中由2F2和利妥希玛进行的CDC的浓度依赖性诱导。
[0060]图14A和14B显示在Daudi细胞⑷和Raii细胞⑶中由2F2、2F2T、11B8T、B1和利妥希玛进行的CDC的浓度依赖性诱导。
[0061]图15A和15B是比较由人单克隆抗体2F2、7D8和11B8以及利妥希玛进行的Daudi细胞(表达低水平CD55 / 59的细胞)的CDC的图；(A)显示未洗涤细胞的百分比裂解而
(B)显示在加入血清之前进行洗涤的细胞的裂解。
[0062]图16A和16B是比较由人单克隆抗体2F2、7D8和11B8以及利妥希玛进行的Raji细胞(表达高水平⑶55 / 59的细胞)的⑶C的图；(A)显示未以抗⑶55和抗⑶59抗体阻抑的细胞的裂解而(B)显示以抗CD55和抗CD59抗体阻抑的细胞的裂解。
[0063]图17A-C显示在Rajii细胞中由2F2和利妥希玛诱导的⑶C中⑶55和⑶59的作用。(A)显示在加入抗⑶55抗体之后裂解细胞的百分率，(B)显示在加入抗⑶59抗体之后裂解细胞的百分率，而(C)显示加入抗⑶55和抗⑶59抗体二者之后裂解细胞的百分率。
[0064]图18A-D显示通过流式细胞分析所测定的在不同细胞系中由2F2和利妥希玛进行的补体因子Clq的结合。
[0065]图19A-D显示通过流式细胞分析所测定的在不同细胞系中由2F2和利妥希玛进行的补体因子片段C4c的沉积。
[0066]图20显示在PMNs、MNCs、血浆或全血存在时由2F2、利妥希玛和11B8T进行的ARH-77细胞的裂解。
[0067]图21显示在PMNs、MNCs、血浆或全血存在时由2F2、利妥希玛和11B8T进行的Β-CLL细胞的裂解。
[0068]图22显示在PMNs、MNCs、血浆或全血存在时由2F2、利妥希玛和11B8T进行的HCL(毛细胞白血病)细胞的裂解。
[0069]图23显示在PMNs、MNCs、血浆或全血存在时由2F2和利妥希玛进行的Β-ALL细胞的裂解。[0070]图24显示在PMNs、MNCs、血浆或全血存在时由2F2、利妥希玛和11B8T进行的滤泡淋巴瘤(FL)细胞的裂解。
[0071]图25显示在PMNs、MNCs、血浆或全血存在时由2F2、利妥希玛和11B8T进行的套细胞的裂解。
[0072]图26显示在全血存在时由2F2和利妥希玛进行的ARH-77细胞的浓度依赖性裂解。
[0073]图27显示由2F2T、11B8T和利妥希玛进行的ARH-77细胞的MNC介导的裂解。
[0074]图28显示由2F2T、11B8T和利妥希玛进行的Raji细胞的MNC介导的裂解。
[0075]图29A、B和C是利用FRET分析和Triton-X不溶性测试显示在用2F2、7D8或11B8温育之后脂筏中CD20的集聚的图。
[0076]图30利用FRET分析显示在用2F2、利妥希玛或11B8T温育之后脂筏中⑶20的集聚。
[0077] 图31显示在用TritonX-lOO(TX)处理和用2F2、利妥希玛或11B8T温育之后保留在不可溶的筏部分中的⑶20的比例。
[0078]图32显示在用2F2、利妥希玛或11B8T刺激Daudi细胞之后在筏和非筏膜部分之间⑶20的分布。
[0079]图33A-G利用流式细胞分析显示由2F2、7D8和11B8进行的Daudi细胞的凋亡。
[0080]图34利用流式细胞分析显示由2F2U1B8T、利妥希玛或B1进行的Raii细胞凋亡的诱导。
[0081]图35A利用流式细胞分析显示由2F2T、11B8T、利妥希玛或B1进行的Daudi细胞凋亡的诱导。
[0082]图35B利用流式细胞分析显示由人单克隆抗体2F2T、11B8T、利妥希玛和B1进行的Daudi细胞的早期和晚期凋亡。
[0083]图36A-E利用光学显微镜显示由2F2、7D8和11B8进行的Ramos-EHRB细胞的同型粘着。
[0084]图37利用光学显微镜显示由2F2、利妥希玛和B1进行的Daudi细胞的同型粘着。
[0085]图38是显示用Daudi细胞注射并且用2F2或7D8处理的SCID小鼠百分比存活率的图。
[0086]图39显示用Tanoue细胞注射并且用2F2、利妥希玛或B1处理的SCID小鼠的百分比存活率。
[0087]图40显示用Daudi细胞注射并且用不同浓度的2F2或利妥希玛处理的SCID小鼠的百分比存活率。
[0088]图41显示用Daudi细胞注射并且用11B8T或B1处理的SCID小鼠的百分比存活率。
[0089]图42显示在39天(用10 μ g的B1、利妥希玛、11B8T、2F2T或huIgGl处理之后31天)时SCID小鼠中肿瘤细胞的生物发光图像。如在小鼠的黑色和白色身体图像中所涂布的生物发光以红色代表(小鼠中的暗区域)(光强度> 50光子每分钟)。
[0090]图43通过整合身体表面的光信号显示在给药10 μ g B1、利妥希玛、11B8T、2F2T或huIgGl之后的第25、32、39和46天，以及第8天量化的每只小鼠中的肿瘤质量。[0091]图44A-C 显示以不同的剂量 4X1.25mk / kg⑷、4X6.25mg / kg(B)或4X12.50mg / kg(C)静脉内给药2F2或利妥希玛之后在食蟹猴外周血中⑶20+细胞的流式细胞分析。
[0092]图45A-C 显示以不同的剂量 4X1.25mk / kg⑷、4X6.25mg / kg(B)或4X12.50mg / kg(C)静脉内给药2F2或利妥希玛之后在食蟹猴外周血中⑶21+细胞的流式细胞分析。
[0093]图46A-C 显示以不同的剂量 4X1.25mk / kg⑷、4X6.25mg / kg(B)或4X12.50mg / kg(C)静脉内给药2F2或利妥希玛之后在食蟹猴淋巴节中⑶20+细胞的流式细胞分析。
[0094]图47A-C 显示以不同的剂量 4X1.25mk / kg⑷、4X6.25mg / kg⑶或4X 12.50mg / kg(C)静脉内给药2F2或利妥希玛之后在食蟹猴外周血中表达0)20^0023+004(^^020+的细胞的流式细胞分析。
[0095]图48A-E显示如流式细胞分析所测定的利妥希玛(A)、2F2⑶、11B8 (C)、B1⑶或同种型对照抗体(E)与表达野生型(WT)⑶20、突变体⑶20 (AxP)或WT⑶20以及突变体⑶20 (AxP) 二者的CH0细胞的结合。
[0096]图49A-F显示2F2、11B8T、B1或利妥希玛与突变体P172S vs.WTCD20 (A)的百分比结合，2F2T、11B8T、B1、CAT (CAT 13.6E12，一种小鼠单克隆 IgG2A 抗 CD20 抗体，Diatec.Com)、对照同种型抗体(KLH)或利妥希玛与突变体⑶20 (AxP) vs.WT⑶20 (B)的百分比结合，2F2、11Β8Τ、Β1或利妥希玛与突变体N166D vs.WT CD20 (C)的百分比结合，2F2T、CAT或利妥希玛与突变体N166D vs.WT CD20(D)的百分比结合，2F2T、2F2、11B8T、B1或利妥希玛与突变体N163D vs.WT CD20(E)的百分比结合，和2F2T、CAT或利妥希玛与突变体N163D vs.WT⑶20(F)的百分比结合。`
[0097]图50显示如通过ELISA所测定的2F2T、7D8和同种型对照抗体与三种抗独特型抗体的结合，所述三种抗体是相对于2F2培育的抗2F2sabl.1，抗2F2sabl.2和抗2F2sabl.3。
[0098]图51显示如通过ELISA所测定的11B8T与抗独特型抗体的结合,所述抗体是相对于11B8T培育的但不结合抗独特型抗2F2抗体的抗11B8T sab2.2、抗11B8T sab2.3、抗11B8T sab2.4、抗 11B8T sab2.5 和抗 11B8T sab2.6。
[0099]图52A-C显示如通过ELISA所测定的2F2T与三种抗独特型抗体的剂量依赖型结合，所述三种抗体是相对于2F2培育的抗2F2sabl.1 (A)、抗2F2sabl.2 (B)和抗2F2sabl.3(C)。
[0100]图53显示人单克隆抗体2F2重链V区的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)和轻(κ )链V区的氣基酸序列(SEQ ID NO:4),标明了 Q)R区。
[0101]图54显示人单克隆抗体2F2重链V区的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)和轻(κ)链V区的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)。
[0102]图55显示人单克隆抗体7D8重链V区的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)和轻(κ )链V区的氣基酸序列(SEQ ID N0:8),标明了 Q)R区。
[0103]图56显示人单克隆抗体7D8重链V区的核苷酸序列(SEQ ID NO:5)和轻(κ )链V区的核苷酸序列(SEQ ID NO:7)。
[0104]图57显示人单克隆抗体11B8重链V区的核苷酸序列(SEQ ID NO:10)和轻(κ )链V区的核苷酸序列(SEQ ID NO:12)。
[0105]图58显示人单克隆抗体11B8重链V区的核苷酸序列(SEQ ID NO:9)和轻(κ )链V区的核苷酸序列(SEQ ID NO:11)。
[0106]发明详述
[0107]本发明提供治疗和诊断各种涉及表达CD20细胞的病症的改良的基于抗体的疗法。本发明的疗法使用特异性结合存在于CD20上的抗原表位的分离的人单克隆抗体。本发明包括的分离的人单克隆抗体包括IgA、IgGl-4、IgE、IgM和IgD抗体。
[0108]在一个实施方案中抗体为IgGl抗体，更特定地是一种IgGl，κ或IgGl，λ同种型。在另一个实施方案中抗体为IgG3抗体，更特定地是一种IgG3，κ或IgG3，λ同种型。还在另一个实施方案中抗体为IgG4抗体，更特定地是一种IgG4, κ或IgG4, λ同种型。仍然在另一个实施方案中抗体为IgAl或IgA2抗体。
[0109]仍然在在另一个实施方案中抗体为IgM抗体。
[0110]在一个实施方案中，通过进行V-D-J重组和同种型转化在能够产生多种⑶20的人单克隆抗体同种型的非人类转基因动物，例如，转基因小鼠中生产人抗体。因此，本发明的方面不仅包括抗体、抗体片段及其药物组合，还包括非人类转基因动物、B细胞、宿主细胞和产生单克隆抗体的杂交瘤。这种转基因动物还可以是产生如在US2003 / 0017534中公开的抗体的转基因兔。因此，本发明还包括特异性结合CD20的人多克隆抗体。在一个实施方案中发明涉及结合CD20上表位的多克隆抗体，所述多克隆抗体(i)不包含或需要172位置上的氨基酸残基脯氨酸；(?)不包含或需要170位置上的氨基酸残基丙氨酸或172位置上的脯氨酸；(iii)包含或需要163位置上的氨基酸残基天冬酰胺或166位置上的天冬酰胺；
(iv) 不包含或需要172位置上的氨基酸残基脯氨酸，但包含或需要163位置上的氨基酸残基天冬酰胺或166位置上的天冬酰胺；或(v)不包含或需要170位置上的氨基酸残基丙氨酸或172位置上的脯氨酸，但包含或需要163位置上的氨基酸残基天冬酰胺或166位置上的天冬酰胺。
[0111]在另一个实施方案中发明涉及具有一种或多种下列特性的人多克隆抗体:(i)以至少与人⑶20相同的亲和性结合突变体P172S⑶20 (172位置上的脯氨酸突变为丝氨酸)(?)以至少与人⑶20相同的亲和性结合突变体AxP (170位置上的丙氨酸突变为丝氨酸，172位置上的脯氨酸突变为丝氨酸)与人⑶20相比于10yg / ml的抗体浓度显示与突变体N166D的减弱50%或更多的结合；和/或(iv)与人⑶20相比于10 μ g / ml的抗体浓度显示与突变体N163D的减弱50%或更多的结合。
[0112]还在另一个实施方案中发明涉及结合人CD20的第一胞外小环中的抗原表位的人多克隆抗体。仍然在另一个实施方案中发明还包括结合CD20上不连续抗原表位的人多克隆抗体。在进一步的实施方案中发明涉及结合CD20上不连续抗原表位的人多克隆抗体，它具有部分第一细胞外小环和部分第二细胞外环。仍然在进一步的实施方案中发明涉及结合CD20上不连续抗原表位的人多克隆抗体，它具有第一细胞外小环的残基AGIYAP和第二胞外环的残基MESLNFIRAHTPYI。
[0113]发明包括利用发明的抗体检测表达CD20的细胞的方法。还提供利用发明的抗体阻抑或抑制CD20诱导的活性，例如增殖和/或分化活性的方法，它在与CD20相关的病症，如致瘤性疾病(例如，B细胞淋巴瘤)和自身免疫疾病(例如，RA、Chrohn氏病和Wegener氏肉芽肿病)的治疗中是有用的。
[0114]为了可以更加容易地理解本发明，首先定义某些术语。其它的定义在整个详述中
全A屮
? 口 ΠΡ ο
[0115]术语“⑶20”和“⑶20抗原”在本文中可以交换使用，包括人⑶20的任何变异体、亚型和物种同源物，它被细胞天然地表达或表达于用CD20基因转染的细胞上。本发明的抗体结合到⑶20抗原上介导通过灭活⑶20杀死表达⑶20的细胞。可以通过一种或多种下列机制杀死表达⑶20的细胞:
[0116]表达⑶20的细胞的补体依赖性细胞毒性(⑶C);
[0117]表达⑶20的细胞的凋亡；
[0118]表达⑶20的细胞的效应细胞吞噬作用；或
[0119]表达⑶20的细胞的效应细胞抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
[0120]如本领域中所认识的，⑶20的同义词包括Β淋巴细胞抗原⑶20、Β淋巴细胞表面抗原 BU Leu-16, Bp35、BMS 和 LF5。
[0121 ] 如本文所用的，术语“抑制生长”(例如，指细胞的)意在包括与不和抗⑶20抗体接触的相同细胞的生长比较，当与抗CD20抗体接触时细胞生长的可测量的降低，例如至少大约 10 % ,20 % ,30 % ,40 % ,50 % ,60 % ,70 % ,80 % ,90 % ,99 % 100 % 的细胞培养物生长的抑制。这种细胞生长的降低能够以`多种机制发生，例如，效应细胞吞噬作用、ADCCXDC和/
或凋亡。
[0122]术语“筏”指位于细胞质膜外片区的富含鞘磷脂和富含胆固醇的膜微域。某些蛋白质在这种域内联合的能力可以影响蛋白质的功能。例如，在用本发明的抗体结合之后，将CD20易位到脂筏中，在质膜中产生了高密度的CD20抗原-抗体复合物。这种高密度的CD20抗原-抗体复合物可以使得在CDC期间有效激活补体系统成为可能。
[0123]如本文所称的术语“抗体”包括完整的抗体及其任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或单链。抗体表示包括通过二硫键相互连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白。每一个重链由一个重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。每一个轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。所述VL和VH区可以进一步划分成被称为互补决定区(CDR)的高变区，和散布在其中的被称为构架区(FR)的更保守的部分。每一个VH和VL都由三个CDRs和四个FRs组成，从氨基末端到羧基末端的排列顺序如下:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。所述重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。所述抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一种组分(Clq)。
[0124]如本文所使用的术语抗体的“抗原结合部分”(或者简称为抗体部分)表示保留了与一种抗原(例如，CD20)特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。已经显示，抗体的抗原结合功能可以通过完整长度抗体的片段实施。术语抗体的“抗原结合部分”所包括的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的一价片段；(ii)F(ab/ )2片段，在铰链区通过二硫键连接的包括两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的一个臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989), Nature341 ;544_546) ； (vi)分离的互补决定区(CDR)，和(vii)优选通过合成的连接子联结的两种或多种分离的CDRs的组合。而且，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由分离的基因编码的，但可以利用重组方法通过合成的连接子将它们结合在一起，以使它能够产生单一的蛋白链，其中，VL和VH区配对形成单价分子(被称为单链 Fv (scFv);参见例如，Bird 等,(1988), Science242:423-426 ;和 Huston等，(1988)，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883)。这种单链抗体同样被认为包括在术语抗体的“抗原结合部分”的含义范围内。另一个例子是结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，包含(i)融合到免疫球蛋白铰链区多肽上的一种结合结构域多肽(如重链可变区或轻链可变区)，(?)融合到铰链区上的一种免疫球蛋白重链CH2恒定区，和(iii)融合到CH2恒定区上的免疫球蛋白重链CH3恒定区。这类结合结构域免疫球蛋白融合蛋白在US2003 /0118592和US2003 / 0133939中得到进一步介绍。这些抗体片段是利用本领域技术人员所公知的常规技术获得的，并且以筛选完整抗体的相同方法筛选所述片段的用途。
[0125]术语“抗原表位”意为一种能够特异性结合到一种抗体上的蛋白质决定簇。抗原表位通过由分子的化学活性表面簇如氨基酸或糖侧链组成并且通过具有特异性的三维结构特性，以及特异性的电荷特性。构象性和非构象性抗原表位的区别在于在变性溶剂存在时前者的结合丧失，而后者则不然。
[0126]如本文所用的术语“不连续抗原表位”，意为一种由蛋白质原始序列中的两个独立区所形成的构象性抗原表位。
[0127]术语“双特异性分子”意在包括诸如蛋白质、肽、或蛋白质或肽复合物的具有两种不同的结合特异性的任何制剂。例如，所述分子可以结合(a)细胞表位抗原和(b)位于效应细胞表面上的Fc受体，或与之相互作用。术语“多特异性分子”或“异特异性分子”意在包括诸如蛋白质、肽、或蛋白质或肽复合物的具有两种以上不同的结合特异性的任何制剂。例如，所述制剂可以结合(a)细胞表面抗原，(b)效应细胞表面上的Fc受体，和(c)至少一种其它成分，或与之相互作用。因此，本发明包括，但不限于针对细胞表面抗原，如⑶20和针对效应细胞上的其它靶，如Fc`受体的双特异性、三特异性、四特异性和其它多特异性分子。
[0128]术语“双特异性抗体”还包括双抗体(diabodies)。双抗体是二价双特异性抗体，其中，VH和VL结构域是在单一的多肽链上表达的，但是所使用的连接子太短，以至于不能使这两个结构域在同一个链上配对，从而迫使这两个结构域与另一个链上的互补结构域配对，并产生两个抗原结合部位(参见例如，Holliger, P.等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 ；Poljak, R.J.等，(1994) Structure〗:1121-1123)。
[0129]术语“人抗体衍生物”指该抗体的任何修饰形式，例如该抗体和另一种制剂或抗体的共轭物。
[0130]如本文所用的，如果该抗体获自一种使用人免疫球蛋白序列的系统的话，例如，通过免疫一种携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或通过筛选人免疫球蛋白基因文库，人抗体“源自”特定的种系序列，并且其中选择的人抗体在氨基酸序列上与由该种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列至少90%，更加优选至少95%，甚至更加优选至少96%、97%、98%或99%相同。一般地，源自特定人种系序列的人抗体会显示与该种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列不超过10个氨基酸的差异，更加优选地，不超过5个，或甚至更加优选地，不超过4、3、2或1个氨基酸的差异。
[0131]如本文所用的，术语“异源抗体”是指两种或多种抗体、其衍生物或连接在一起的抗原结合区，至少其中的两个具有不同的特异性。这种不同的特异性包括对效应细胞上Fc受体的结合特异性，和诸如肿瘤细胞的靶细胞上的抗原或表位的结合特异性。
[0132]如本文所用的，术语“人抗体”意在包括具有源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机的或位点特异性的诱变或通过体内体细胞突变导入的突变)。不过，本文所使用的术语“人抗体”并不包括这样的抗体:其中，源于另一种哺乳动物，如小鼠的的⑶R序列业已嫁接到人框架序列上。
[0133]如本文所使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”表示具有单一分子组合物的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物表现出对一种特定表位的单一的结合特异性和亲和力。因此，术语“人单克隆抗体”表示具有源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的表现出单一结合特异性的抗体。在一个实施方案中，人单克隆抗体是通过杂交瘤产生的，所述杂交瘤包含获自转基因或转染色体非人动物，例如转基因小鼠的B细胞，所述B细胞具有包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组并且融合于一种永生化细胞。
[0134]如本文所用的术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如(a)从人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如，小鼠)体内或由该基因制备的杂交瘤分离的抗体(在下面的I节中进一步说明)；(b)由表达该抗体的转化的宿主细胞，例如，由一种转染瘤中分离的抗体，(c)从重组的组合人抗体文库中分离的抗体和(d)通过涉及到将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列上的任何其它方法制备、表达、产生或分离的抗体。这种重组人抗体具有源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。不过，在某些实施方案中，可以将这类重组人抗体进行体外诱变(或在使用人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，因此，所述重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列:尽管所述序列源于并相关于人种系VH和VL序列，但是它可能并非天然体内存在于人抗体种系成分中。
[0135]如本文所用的，术语“转染瘤”包括表达所述抗体的重组真核宿主细胞，如CH0细胞、NS / 0细胞、HEK293细胞、植物细胞或真菌，包括酵母。
[0136]如本文所用的，术语“异源抗体”是相对产生这种抗体的转基因非人生物定义的。该术语表示这样一种抗体:该抗体的氨基酸序列或编码核酸序列对应发现于不包括所述转基因非人动物的生物中的序列，并且通常来自除了所述转基因非人动物之外的物种。
[0137]如本文所用的，“异源杂合抗体”表示具有不同生物的轻链和重链的抗体。例如，具有与鼠类轻链结合的人重链的抗体就是异源杂合抗体。这种异源杂合抗体的例子包括嵌合抗体和人源化抗体，如上所述。
[0138]如本文所用的，“分离的抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性结合CD20的分离的抗体基本上不含能特异性结合除了 CD20的抗原的抗体)。不过，特异性结合人CD20的抗原表位、亚型或变异体的分离的抗体可能具有对其它相关抗原，例如来自其它物种的抗原(例如，CD20物种同源物)的交叉反应性。而且，分离的抗体可能基本上不含其它细胞物质和/或化合物。在本发明的一个实施方案中，在一种充分定义的组合物中将具有不同特异性的“分离的”单克隆抗体组合在一起。
[0139]如本文所用的，术语“特异性结合”表示抗体与预定的抗原结合。一般，所述抗体的结合亲和力相应于大约1X 10_7M或更小的KD，并且与预定抗原的结合亲和力比与除了所述预定抗原或密切相关抗原之外的非特异性抗原(例如，BSA，酪蛋白)的结合亲合力高至少两个数量级。在本文中，短语“识别一种抗原的抗体”和“对一种抗原特异的抗体”可以与术语“特异性结合一种抗原的抗体”互换使用。
[0140]如本文所用的，术语“Kd" (sec^)意指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。所述值也称为Κ-值。
[0141]如本文所用的，术语“Ka" (M^Xsec-1)意指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率常数。所述值也称为Κ.值。
[0142]如本文所用的，术语“KD" (Μ)意指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。
[0143]如本文所用的，术语“ΚΑ" (Μ-1)意指特定抗体-抗原相互作用的缔合平衡常数，并且它通过Ka除以Kd来获得。
[0144]如本文所用的，“同种型”表示由重链恒定区基因编码的抗体类型(例如，IgM或IgGl)。
[0145]如本文所用的，“同种型转换”表示一种抗体的类型或同种型从一种Ig类型转变成另一种Ig类型的现象。
[0146]如本文所用的，“非转换同种型”表示在没有发生同种型转换时所产生的重链的同种型类型；编码非转换同种型的CH基因一般紧挨着功能性重排VDJ基因下游的第一个CH基因。业已将同种型转换划分成经典的或非经典的同种型转换。经典的同种型转换是通过重组事件发生的，它包括位于所述转基因上的至少一个转换序列区。非经典同种型转换可以通过诸如人σ μ和Σ μ (δ-相关的缺失)之间的同源重组完成。其它的非经典转换机制，如转基因间和/或染色体间的重组也可能发生，并实现同种型转换。
[0147] 如本文所用的，术语“转换序列”表示负责转换重组的DNA序列。一般为μ转换区的“转换供体”序列将会在转换重组期间将要缺失的构建体区的5'末端(即上游)。“转换受体”区将位于将要缺失的构建体区和置换的恒定区(例如，Υ、ε等)之间。由于没有经常发生重组的特定位点，一般无法根据所述构建体预测最终的基因序列。
[0148]如本文所用的，“糖基化形式”被定义为与蛋白，更具体的是与免疫球蛋白共价结合的碳糖单位的形式。当本领域普通技术人员认为异源抗体的糖基化形式与来自获得所述转基因的CH基因的物种相比更类似于所述非人转基因动物物种的糖基化形式时，异源抗体的糖基化形式可以被鉴定为基本类似于由所述非人转基因动物物种所产生的抗体上天然存在的糖基化形式。
[0149]如本文所用的，用在一种客体上的术语“天然存在的”表示一种物体可以在自然界中找到的事实。例如，可以从天然来源分离，并且没有在实验室中做过人为有意修饰的、存在于一种生物(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
[0150]如本文所用的术语“重排的”表示重链或轻链免疫球蛋白基因座的一种构象，其中在编码基本完整的VH或VL结构域的构象中，V片段的位置分别紧挨着D-J或J片段。可以通过与种系DNA比较确定重排的免疫球蛋白(抗体)基因座；重排的基因座具有至少一个重组的七聚体/九聚体同源元件。
[0151]如本文所用的关于V片段的术语“未重排的”或“种系构象”表示这样一种构象，其中V片段不是重组的，以便它紧挨着D或J片段。
[0152]如本文所用的，术语“核酸分子”意在包括DNA和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选双链DNA。[0153]如本文所用的关于与CD20结合的抗体或抗体部分(例如，Vh、'、CDR3)的核酸的术语“分离的核酸分子”意在表示这样一种核酸分子，其中编码完整抗体或抗体部分的核苷酸序列不含编码能结合除了 CD20以外的抗原的完整抗体抗体部分的核苷酸序列，其它序列可以天然存在于人基因组DNA上的核酸侧翼。在一个实施方案中，人抗⑶20抗体包括2F2、7D8或11B8的核苷酸或氨基酸序列，以及分别具有SEQ ID Nos:1、5或9和SEQ ID Nos:3、7或11所示序列的重链(VH)和轻链(')可变区。
[0154]如本文所公开和要求的，SEQ ID NOs: 1_30中所示的序列包括“保守性序列修饰物”，即，不显著影响或改变由该核苷酸序列编码或包含该氨基酸序列的抗体结合特性的核苷酸和氨基酸序列修饰物。这类保守性序列修饰物包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如定点突变和PCR介导的突变将修饰引入SEQ ID NOs:1-30中。保守性氨基酸取代包括这种取代，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域进行定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)，β分支的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，优选用来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基来代替在人抗CD20抗体中预定的非必需氣基酸残基。
[0155]本发明还包括SEQ ID NOs:1_30中所示的氨基酸序列的“衍生物”及其保守性序列修饰物，其中例如通过酰化或糖基化作用对一种或多种氨基酸残基进行衍化，而不显著地影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特性。
[0156]另外，本发明包括这样的抗体，其中在Fc区进行变换以便改变所述抗体的功能特性或药物动力学特性。这类变换可能导致Clq结合和CDC或Fc R R结合ADCC的降低或增强。例如，在重链恒定区的位置234、235、236、237、297、318、320和322可以进行取代，由此引发效应物功能的变化，同时与`未修饰的抗体相比(参看US5，624，821和US5，648，260)保持结合抗体的能力。
[0157]通过修饰Ig恒定区或类Ig恒定区的补救受体表位使得该分子不包含完整的CH2区或完整的Ig Fc区，参见US6，121，022和”6，194，551，也可以提高抗体的体内半衰期。另外体内半衰期还可以通过在Fc区中制造突变，例如，通过在位置252取代苏氨酸为亮氨酸，通过在位置254取代苏氨酸为丝氨酸，或通过在位置256取代苏氨酸为苯丙氨酸，参见US6, 277，375，而得以提高。
[0158]另外，可以修饰抗体的糖基化形式以便改变抗体的效应物功能。例如，可以在一种转染瘤中表达抗体，所述转染瘤不添加正常情况下附于Fc区的位置297上的天冬酰胺的岩藻糖，从而导致在NK细胞存在时抗体的增强的ADCC，参见Shield等(2002) JBC, 277:26733。另外，可以进行半乳糖基化修饰以便改进CDC。
[0159]或者，在另一个实施方案中，可以通过如饱和诱变在全部和部分抗⑶20抗体编码序列上随机引入突变，并且可以筛选得到的修饰抗CD20抗体的结合活性。
[0160]因此，由本文公开的(重链和轻链可变区)核苷酸序列编码的和/或包含本文公开的(重链和轻链可变区)氨基酸序列(即，SEQ ID NOs:1-30)的抗体，包括由已经进行过保守性修饰的相似序列编码的或包含相似序列的基本上相似的抗体。可以在如下面提供的SEQ ID NOs:1-30所公开的部分序列(即，重链和轻链可变区)的基础上进一步讨论如何能够生成这类基本上相似的抗体。[0161]对于核酸来说，术语“基本同源性”表示在对两种核酸或其设计的序列进行优化排列和比较时，在具有适当的核苷酸插入和缺失情况下，其核苷酸的相同性至少为大约80%，通常至少为大约90-95%，更优选至少为大约98-99.5%。或者，当所述片段在选择性杂交条件下与所述链的互补体杂交时，就存在基本同源性。对于核苷酸和氨基酸序列来说，术语“同源性”表示在具有适当的核苷酸插入和缺失情况下进行优化排列和比较时两种核酸或氨基酸序列之间的相同性。或者，当DNA片段在选择性杂交条件下与所述链的互补体杂交时，就存在基本同源性。
[0162]两种序列之间的相同性百分比是这两种序列所共有的相同位点的数量的函数(即％同源性=相同位点的数量/位点的总数量X100)，考虑到了为了对这两种序列进行优化比对而需要引入的空位数量和每一个空位的长度。两种序列之间的序列比较和相同性百分比的确定，可
[0163]以利用在下面的非限定性实施例中所公开的数学算法完成。
[0164]两种核苷酸序列之间的相同性百分比可以利用GCG软件包中的GAP程序(可以在http: / / www.gcg.com获得)确定，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权数为40、50、60、70或80，长度权数为1、2、3、4、5或6。两种核苷酸或氨基酸序列之间的相同性百分比还可以用 E.Meyers 和 ff.Miller 的算法确定(Comput.Appl.Biosc1.,4:11-17, (1988))，该方法业已整合到ALIGN程序(2.0版)中，使用PAM120加权残基表，空位长度罚分为12，而空位罚分为4。另外，两种氨基酸序列之间的相同性百分比可以用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453, (1970))算法确定，该方法业已整合到GCG软件包中的GAP程序中(可以从http: / / www.gcg.com获得)，使用Blossum62距阵或PAM250距阵,空位权数为16、14、12、10、8、6 或 4，而长度权数为 1、2、3、4、5 或 6。
[0165]还可以将本发明的核酸和蛋白序列用作“查询序列”对公共数据库进行检索，以便，例如，鉴定相关的序列。所述检索可以用Altschul等的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)完成(1990.J.Mol.Biol.215:403-10)。BLAST核苷酸检索可以通过NBLAST程序完成，得分等于100，字长等于12，以便获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白检索可以通过XBLAST程序完成，得分=50，字长=3，以便获得与本发明蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有空位的排列，可以使用Altschul等所公开的空位BLAST (1997，NucleicAcids Res.25(17):3389-3402)。在采用 BLAST 和空位 BLAST 程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http: / / www.ncb1.nlm.nih.gov。
[0166]所述核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中，或者以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过标准技术使核酸从诸如其它细胞核酸或蛋白的其它细胞成分或其它污染物中纯化出来时，它就是“分离的”或“成为基本上纯的”，所述标准技术包括碱/ SDS处理、氯化铯带型、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其它技术。参见F.Ausubel等，编辑.Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and WileyInterscience, New York，1987。[0167]尽管本发明的核酸组成经常是以来自cDNA、基因组或其混合物的天然序列(修饰过的限制位点等除外)存在，但可以用标准技术对其进行诱变，以便提供基因序列。对于编码序列来说，所述诱变可以按照需要影响氨基酸序列。具体地讲，包括大体上同源于或源于本文所述的天然V、D、J、恒定、转换和其它诸如此类的序列的DNA序列(其中，“源于”表示一种序列与另一种序列相同或者是由另一种序列修饰物而成)。
[0168]当一种核酸分子与另一种核酸序列置于功能性关系时，它就是“可操作地连接的”。例如，如果启动子或增强子能影响编码序列的转录的话，它们就是与编码序列可操作地连接的。就转录调控序列而言，可操作地连接意味着所连接的DNA序列是相邻的，并且有必要连接两个蛋白编码区，相邻并且存在于读框内。对于转换序列来说，可操作地连接表示有关序列能够影响转换重组。
[0169]如本文所用的，术语“载体”意在表示能够转运业已连接在它上面的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它表示在它上面可以连接其它DNA片段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中，可以将其它DNA片段连接在病毒基因组上。某些载体能够在导入了这种载体的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞时能够整合到宿主细胞的基因组中，并因此与宿主基因组一起复制。另外，某些载体能够指导与它可操作地连接的基因的表达。在本文中，所述载体被称为“重组表达载体”(或简单地称之为“表达载体”)。一般，应用于重组DNA技术中的表达载体通常是质粒形式的。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常使用载体的形式。不过，本发明还包括所述其它形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒)，这些病毒行使等同的功能。
[0170]如本文所用的，术语“重组宿主细胞”(或简单地称之为宿主细胞)意在表示业已导入了重组表达载体的细胞。应当理解的所述术语不仅仅表示特定的个体细胞，而且还包括所述细胞的后代。由于在延续的世代中因为突变或环境影响可能发生某些修饰，事实上，所述后代可能与亲代细胞不相 同，但这种细胞仍然属于本文所使用的术语“宿主细胞”的范围。重组宿主细胞包括，例如，转染瘤，如CH0细胞、NS / 0细胞和淋巴细胞。
[0171]如本文所用的，术语“个体”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳类和非人哺乳类，如非人灵长类、羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。
[0172]术语“转基因的，非人动物”表示一种非人动物，它具有包含一种或多种人重链和/或轻链转基因或转染色体(整合或非整合入动物的天然基因组DNA中)的并且能够表达完整人抗体的基因组。例如，转基因小鼠可以具有人轻链转基因和人重链转基因或人重链转染色体，从而小鼠在用⑶20抗原和/或表达⑶20的细胞进行免疫时产生人抗⑶20抗体。人重链转基因可以整合入小鼠的染色体DNA中，如转基因的，例如，HuMAb小鼠，如HCo7或HCol2小鼠的情况，或者人重链转基因可以保持于染色体外，如W002 / 43478中所述的转染色体(例如，KM)小鼠的情况。通过进行V-D-J重组和同种型转换这类转基因和转染色体小鼠能够产生相对于CD20的多同种型的人单克隆抗体(例如，IgG、IgA和/或IgE)。
[0173]在下面的各小节中将对本发明的各个方面作更详细的说明。
[0174]1.抗CD20的人抗体的生产
[0175]可以通过多种技术，包括传统的单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein,Nature256:495, (1975)的标准体细胞杂交技术来生产本发明的人单克隆抗体。尽管体细胞杂交法在理论上是优选的，但是可以利用生产单克隆抗体的其它技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化或利用人抗体基因文库的噬菌体呈现技术。
[0176]用于制备分泌人单克隆抗体的杂交瘤的优选动物体系是鼠类体系。在小鼠中生产杂交瘤是一种业已完善的方法。免疫方案和分离用于融合的免疫化的脾细胞的技术为本领域所公知。融合配偶体(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合方法同样是众所周知的。
[0177]在一种优选实施方案中，抗CD20的人单克隆抗体可以用携带所述人免疫系统的一部分而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠来产生。这些转基因或转染色体小鼠在本文中分别称为“HuMAb”小鼠和KM小鼠，并且在本文中总称为“转基因小鼠”。
[0178]HuMAb小鼠含有编码未重排的人重链(μ和y)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微型基因座，同时还含有使内源μ和κ链基因座失活的定向突变(Lonberg，N.等，(1994)，Nature368 (6474):856-859)。因此，所述小鼠表现出小鼠IgM或κ的表达减弱，并且在免疫应答时，所导入的人重链和轻链转基因发生类型转换和体细胞突变，产生高亲和力IgG κ单克隆抗体(Lonberg, N.等，(1994),同上；综述见于Lonberg, N.等，(1994), Handbook of Experimental Pharmacology113:49-101 ；Lonberg, N.和 Huszar,D.(1995), Intern.Rev.1mmunol.Vol.13:65-93,和 Harding, F.和 Lonberg, N., (1995)，Ann.N.Y.Acad.Sci764:536-546)。在 Taylor, L.等，(1992) Nucleic Acids Research20:6287-6295 ；Chen, J.等，(1993)International Immunology5:647-656 ；Tuaillon 等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:3720-3724 ；Cho1.等，(1993)Nature Genetics4:117-123 ；Chen, J.等，(1993)EMBO J.12:821-830 ；Tuaillon 等，(1994) J.1mmunol.152:2912-2920 ;Lonberg 等，(1994)Nature368(6474):856-859 ；Lonberg, N., (1994)Handbookof Experimental Pharmacology113:49-101 ；Taylor, L.等，(1994)InternationalImmunology6:579-591 ；Lonberg, N.and Huszar, D.(1995)Intern.Rev.Tmmuno 1.Vol.13:65-93 ；Harding, F.和 Lonberg, N.， (1995)Ann.N.Y.Acad.Sci764:536-546 ；Fishwild,D.等(1996)Nature Biotechnologyl4:845-851 中详细介绍了 HuMab 小鼠的制备。还参见美国专利 5545806 ；5569825 ；5625126 ；5633425 ；5789650 ；5877397 ；5661016 ；5814318 ；5874299 ；和5770429 ;以上所有专利均属于Lonberg ;以及属于Surani等的美国专利5545807 ；W098 / 24884、W094 / 25585、W093 / 1227、W092 / 22645、W092 / 03918 和W00I / 09187。
[0179]KM小鼠包含人重链转染色体和人κ轻链转基因。还在KM小鼠中破裂内源性小鼠重链和轻链基因，从而小鼠的免疫导致产生人免疫球蛋白而非小鼠免疫球蛋白。KM小鼠的构建以及它们培育人免疫球蛋白的应用在W002 / 43478中进行了详细介绍。
[0180]免疫
[0181] 为了制备CD20的完整的人单克隆抗体，可以通过Lonberg，N.等(1994)同上:856-859 ;Fishwild，D.等(1996)同上和W094 / 24884中所述的方法用富集的CD20抗原制品和/或表达⑶20的细胞对包含免疫球蛋白基因的转基因或转染色体小鼠(例如，HCol2、HCo7或KM小鼠)进行免疫。或者，可以用编码人⑶20的DNA免疫小鼠。优选地，在第一次输注时，所述小鼠为6-16周龄。例如，可以通过腹膜内注射方式用CD20抗原的富集制品(5-50 μ g)对HuMab小鼠进行免疫。在用CD20抗原的纯化或富集制剂进行免疫能产生抗体时，还可以用表达CD20的细胞，例如，一种细胞系来免疫小鼠以促进免疫反应。
[0182]用各种抗原积累的经验业已表明，当用存在于完全弗氏佐剂中的表达⑶20的细胞通过腹膜内(IP)或皮下(SC)起始免疫，然后每隔一周用存在于PBS中的表达CD20的细胞进行IP免疫(一共多达10次)时，所述HuMAb转基因小鼠应答最强。在免疫接种过程中，可以通过眼眶后取血获得的血浆样品监测免疫应答。可以通过FACS分析对所述血浆进行筛选(如下所述的)，并且可以将具有足够滴度的抗CD20人免疫球蛋白的小鼠用于融合。在宰杀并取出脾脏之前3天，可以通过静脉内注射表达CD20的细胞对所述小鼠进行加强免疫。
[0183]制备产生抗CD20的人单克隆抗体的杂交瘤
[0184]为了制备生产抗人CD20的人单克隆抗体的杂交瘤，可以从免疫小鼠中分离脾细胞和淋巴节细胞并且与合适的免疫化细胞系相融合，如小鼠骨髓瘤细胞系。随后可以对得到的杂交瘤筛选抗原特异性抗体的生产。例如，通过50%的PEG使来自免疫过的小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液与SP2 / 0-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1580)融合。以大约2 X105每孔的密度将细胞铺在平底微量滴定板上，然后在选择培养基中孵育2周，该培养基含有10%胎克隆血清，5-10% origen杂交瘤克隆因子(IGEN)和IX HAT (Sigma)。大约2周之后在HAT被HT取代的培养基中培养细胞。然后通过ELISA筛选每一个孔中的包含人κ轻链的抗体，并且通过FACS利用表达⑶20的细胞筛选⑶20的特异性。一旦发生了广泛的杂交瘤的生长，通常在10-14天之后对培养基进行观察。将抗体分泌杂交瘤重新铺平板，再次筛选，并且如果人IgG抗CD20单克隆抗体仍然呈阳性的话，可以通过限制稀释亚克隆至少2次。然后在体外培养稳定的亚克隆，以便在组织培养基中制备抗体用于鉴定。
[0185]生产抗CD20的人单克隆抗体的转染瘤的制备
[0186]利用，例如本领域公知的重组DNA技术和基因转染方法的组合，还可以在宿主细胞转染瘤中生产本发明的人抗体(Morrison，S.(1985) Science229:1202)。
[0187]例如，在一个实施方案中，可以将目的基因，例如，人抗体基因连接入一种表达载体中，如在W087 / 04462、W089 / 01036和EP338841中公开的GS基因表达系统或其它本领域公知的表达系统所用的真核表达质粒。可以将纯化的具有克隆的抗体基因的质粒导入真核宿主细胞如CH0细胞、NS / 0细胞或HEK293细胞或其它真核细胞像源于植物的细胞、真菌或酵母的细胞中。用于导入这些基因的方法可以是本领域所公开的方法，如电转化、月旨染、脂转染胺或其它的方法。将这些抗体基因导入宿主细胞中后，可以鉴定并筛选表达该抗体的细胞。这些细胞代表转染瘤，随后可以对其进行扩增以增加它们的表达水平并进行提高以生产抗体。
[0188]生产抗⑶20的人单克隆抗体的其它重组方法
[0189]选择性地，可以将克隆的抗体基因表达于其它表达系统中，包括原核细胞，如微生物，如大肠杆菌(E.coli)以生产单链Fv抗体，藻类以及昆虫细胞。另外，抗体可以在转基因非人动物，如在羊和免的奶中或在鸡蛋中，或在转基因植物中进行生产。见，例如Verma, R.等(1 998).Antibody engineering:Comparison of bacterial, yeast, insectand mammalian expression systems.J.1mmuyzol.Meth.216: 165-181 ;Pollock等(1999).Transgenic milk as a method for the production of recombinant antibodies.J.1mmunol.Meth.231:147-157 ;和 Fischer, R.等(1999).Molecular farming ofrecombinant antibodies in plants.Biol.Chem.380:825_839。
[0190]利用部分抗体序列表达完整抗体
[0191]抗体主要经位于6个重链和轻链互补决定基区域(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此，单个抗体间CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列有更多变化。因为CDR序列负责大多数抗体-抗原的相互作用，所以通过构建表达载体表达重组抗体是可能的，这些载体包括来自特殊的自然发生的抗体的CDR序列，其移植到来自带有不同性质的不同抗体的框架序列上，这些抗体模仿特定的天然发生的抗体的性质(见，例如，Riechmann,L.等(1998)Nature332:323-327 Jones, P.等(1986) Nature321:522-525 ;和 Queen，C.等(1989) Proc.Natl.Acad.Sc1..U.S.A.86:10029-10033)。该框架序列能从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库中获得。这些种系序列将区别于成熟抗体基因序列，因为它们将不包括完整装配的可变基因，这些可变基因在B细胞成熟过程中由V (D) J连接形成。种系基因序列在个别的甚至是整个可变区也将区别于高亲和性所有二级抗体。但是，体细胞突变不是均匀分布在可变区。例如，体细胞突变在框架区域1的氨基端部分和在框架区域4的羧基端部分相对不常见。而且，许多体细胞突变不会显著地改变抗体的结合特性。为此，没有必要为了再生出一种完整的含有与原始抗体相似的结合特性的重组抗体，获得特定抗体的完整DNA序列(参见W099 / 45962)。跨越⑶R区的部分重链和轻链序列通常足够用于本目的。部分序列用于测定哪些种系可变的和连接的基因区段有助于重组抗体可变基因。种系序列然后用在填充可变区域的丢失部分。重链和轻链的前导序列在蛋白成熟过程中被切下，因而不为最终抗体的性质作贡献。为了加入丢失的序列，可以将克隆的cDNA序列与合成的寡核苷酸通过连接或PCR扩增进行结合。或者，整个可变区能合成为一组短小、重叠的寡核苷酸合成并由PCR扩增组合从而产生一个完整的合成可变区克隆。本方法具有某些益处如消除或包括特定的限制性位点，或特定密码子的最优化。
[0192]来自杂交瘤的重链和轻链转录物的核苷酸序列被用于设计一重叠组的合成寡核苷酸从而产生合成的带有与天然序列相同氨基酸编码能力的V序列。合成的重链和κ轻链序列能在三个方面与自然序列 相区别:重复核苷酸碱基的链被中断以便有利于寡核苷酸合成和PCR扩增；依据Kozak规则引入最佳翻译起始位点(Kozak，1991，J.Biol.Chem.266，19867-19870，);和翻译起始位点上游的Hindlll位点改造。
[0193]对于重链和轻链可变区，最佳的编码和对应的非编码链的序列分裂成30-50个核苷酸区段，所述分裂大致发生于对应非编码寡核苷酸的中点。因此，对每个链来说，寡核苷酸都能装配成跨越150-400个核苷酸区段的重叠双链组。随后使用该组作为模板生产150-400个核苷酸的PCR扩增产物。一般，一个单一可变区寡核苷酸组将裂解为两个组，这两个组单独扩增以生成两个重叠的PCR产物。然后这些重叠产物由PCR扩增组合形成完整的可变区。它还有可能在PCR扩增中包括重链或轻链恒定区域的重叠片段(包括κ轻链的Bbsl位点或、重链的Agel位点)，从而生成能够轻易克隆到表达载体构建体中的片段。
[0194]随后将重构的重链和轻链可变区与克隆的启动子、引导序列、翻译起始序列、恒定区、3’未翻译序列、多腺苷酸化序列和转录终止序列组合形成表达载体构建体。重链和轻链表达构建体能组合成一个单一载体，将该载体共转染、按顺序转染或单独转染进宿主细胞中，然后融合形成表达两个链的宿主细胞。[0195]用于构建表达载体表达人IgG κ的质粒描述如下。构建质粒以使得PCR扩增的V重链和Vk轻链cDNA序列能用于重构完整的重链和轻链小基因。这些质粒能用作完整地表达人或嵌合IgGl κ或IgG4K抗体。构建相似的质粒用于表达其它重链同种型，或用于表达含有入轻链的抗体。[0196]因而，在发明的另一方面，将发明的人抗⑶20抗体，例如，11B8、2F2或7D8的结构特征用于产生结构相关的人抗CD20抗体，它至少保留本发明抗体的一种功能特征，如结合⑶20。更具体地，可以将11B8、2F2或7D8的一种或多种⑶R区与已知的人框架区和⑶Rs重组结合以产生本发明的其它的、重组性设计的人抗CD20抗体。
[0197]因此，在另一个实施方案中，本发明提供一种制备抗⑶20抗体的方法，包括:(1)人重链框架区和人重链⑶R，其中至少一种人重链⑶Rs包含选自图53、55或57中所示的⑶R氨基酸序列的氨基酸序列(或对应SEQ ID NOs: 13-15、19-21或25-27中的氨基酸序列)；和(2)人轻链框架区和人轻链CDR，其中至少一种人轻链CDR包含选自图53、55或57中所示的的CDRs氨基酸序列的氨基酸序列中所示的氨基酸序列(或对应SEQ ID NOs:16-18,22-24或28-30中的氨基酸序列)；其中该抗体保留结合⑶20的能力。
[0198]利用标准的结合测试，如在实施例中给出的那些(例如，FACS分析)来测定抗体结合⑶20的能力。
[0199]由于在本领域中众所周知抗体重链和轻链CDR3区在抗体对抗原的结合特异性/亲和性中发挥着特别重要的作用，所以如上制备的本发明的重组抗体优选包含2F2、7D8或11B8的重链和轻链⑶R3。另外该抗体可以包含2F2、7D8或11B8的⑶R2。另外该抗体可以包含2F2、7D8或11B8的⑶R1。因此，本发明进一步提供抗⑶20抗体，包含:(1)人重链框架区、人重链⑶R1区、人重链⑶R2区和人重链⑶R3区，其中人重链⑶R3区是如图53、55或57中所示的2F2、7D8或11B8的CDR3(或对应SEQ ID NOs: 15、21或27中的氨基酸序列)；
(2)人轻链框架区、人轻链CDR1区、人轻链CDR2区和人轻链CDR3区，其中人轻链CDR3区是如图53、55或57中所示的2F2、7D8或11B8的CDR3(或对应SEQ ID NOs: 18、24或30中的氨基酸序列)，其中该抗体结合⑶20。该抗体可以进一步包含2F2、7D8或11B8的重链⑶R2和/或轻链⑶R2。该抗体可以进一步包含2F2、7D8或11B8的重链⑶R1和/或轻链⑶R1。
[0200]优选地，上述工程化的抗体的⑶Rl、2和/或3包含本文公开的2F2、7D8或11B8的⑶R确切氨基酸序列。不过，普通技术人员会理解从2F2、7D8或11B8的⑶R确切氨基酸序列而来的一些偏差是可能的，同时仍然保持有效结合CD20的抗体的能力(例如，保守性取代)。因此，在另一个实施方案中，工程化的抗体可以由与一种或多种2F2、7D8或11B8的⑶R例如90%、95%、98%或99.5%相同的一种或多种⑶R组成。
[0201]除了简单地结合⑶20之外，工程化的抗体如即些上述的抗体可以对于它们保有其它本发明的抗体的功能特性进行选择，如
[0202](1)从⑶20上的低解离速率；
[0203](2)结合CD20的高亲和力；
[0204](3)结合⑶20上的独特表位，和/或特异性定向结合⑶20，和/或结合⑶20的特异性形式；
[0205](4)在⑶55 / 59阴性或⑶55 / 59阳性细胞上介导高水平的⑶C ；
[0206](5)结合⑶20后转位到脂筏中；[0207](6)抑制表达⑶20的细胞生长；
[0208](7)诱导表达⑶20的细胞凋亡；
[0209](8)诱导表达⑶20的细胞同型粘着；
[0210](9)延长具有表达⑶20的肿瘤细胞的个体存活；
[0211](10)与效应细胞混合时介导CD20靶的ADCC ；
[0212](11)消除表达⑶20细胞的能力；和/或
[0213](12)消除表达低水平的CD20的细胞(CD20ta)的能力。
[0214]人单克隆抗体结合⑶20的鉴定
[0215]为了纯化人抗CD20抗体，可以将选择的杂交瘤生长于两升的旋转烧瓶中，用于单克隆抗体纯化。在用蛋白A-琼脂糖(针对IgGl抗体)(Pharmacia, Piscataway, NJ)或抗人IgG涂布的琼脂糖或对于IgG3的蛋白质G-琼脂糖进行亲和层析之前，可以对上清液进行过滤并浓缩。可以通过凝胶电泳和高效液相层析检查洗脱的IgG，以确保纯度。可以将所述缓冲液换成PBS，并且可以通过0D280使用1.43的消光系数测定浓度。可以将所述抗体分装，并且在-80°C下保存。
[0216]为了确定所选择的人抗CD20单克隆抗体是否结合独特的表位，可以使用定点突变和多点突变。
[0217]为了确定纯化抗体的同种型，可以进行同种型ELISAs。可以在4°C下用10微克/毫升的抗人Ig将微量滴定板孔涂布过夜。在用5% BSA封闭之后，在环境温度下让所述平板与10微克/毫升单克隆抗体或 纯化的同种型对照反应2小时。然后用人IgGl或人IgM特异性碱性磷酸酶共轭的探针与所述孔反应。在洗涤之后，用PNPP底物(1毫克/毫升)使所述平板显影，并在405-6500D下分析。
[0218]为了证明抗CD20抗体在免疫小鼠血清中的存在或单克隆抗体与表达CD20的活细胞的结合，可以使用流式细胞分析。简单地讲，将表达CD20的细胞系(生长于标准生长条件下)与各种浓度的在包含0.1% BSA和0.02%叠氮化钠的PBS中的单克隆抗体混合，于4°C孵育30分钟。在洗涤之后，将细胞与荧光素标记的抗人IgG抗体在与一抗染色相同的条件下进行反应。可以通过FACScan仪器利用单一活细胞上的光散射和侧面散射特性分析所述样品。可以利用使用荧光显微镜的其它测定方法，作为流式细胞仪测定的补充或替代。可以按上述方法对细胞进行染色，并且通过荧光显微镜检查。该方法可以观察单细胞，但根据抗原密度灵敏度可能降低。
[0219]可以通过western印迹进一步检验抗⑶20的人IgGs与⑶20抗原的反应性。简单地讲，可以制备来自表达CD20的细胞的细胞提取物，并且进行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳之后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用20%的小鼠血清封闭，并且用待试验的单克隆抗体作探针检测。可以用抗人IgG碱性磷酸酶检测人IgG结合，并且用 BCIP / NBP 底物片(Sigma Chem.C0.，St.Louis, MO)显影。
[0220]抗CD20的人单克隆抗体的吞噬作用和细胞杀伤活性
[0221]除了能特异性结合⑶20之外，还可以检测人单克隆抗⑶20抗体介导对表达⑶20细胞的吞噬作用和杀伤作用的能力。在体外对单克隆抗体活性的检测，可以在体内模型试验之前提供初步的筛选。简单地讲，可以通过Ficoll Hypaque密度离心，然后裂解污染红细胞纯化来自健康供体的多型核细胞(PMN)、NK细胞或其它效应细胞。可以将洗涤过的PMNs悬浮在添加了 10%加热灭活的胎牛血清的RPMI中，并且以各种效应细胞与肿瘤细胞的比例(效应细胞:肿瘤细胞)与51Cr标记过的表达CD20的细胞混合。然后可以以各种浓度添加纯化的人抗CD20IgGs。可以用无关的人IgG作阴性对照。根据所用的效应细胞，测定可以在37°C下进行4-20小时。可以通过测定释放到培养上清液中的51Cr分析样品的细胞裂解作用。还可以通过相互组合的方式测定抗CD20单克隆抗体，以便确定多种单克隆抗体是否增强细胞裂解。
[0222]也可以在活体模型(例如，小鼠)上检验与CD20结合的人单克隆抗体，以便测定它们控制表达CD20的肿瘤细胞的生长的效力。例如，这些抗体可以根据以下标准进行选择，这些标准并不是排他性的:
[0223]1.与活的表达⑶20的细胞结合；
[0224]2.从⑶20上的低解离速率；
[0225]3.结合CD20的高亲和力；
[0226]4.结合⑶20上的独特表位，和/或特异性定向结合⑶20，和/或结合⑶20的特异性形式；
[0227]5.表达CD20的细胞的调理；
[0228]6.在人效应细胞存在时介导表达⑶20的细胞的生长抑制、吞噬作用和/或杀伤；
[0229]7.在⑶55/59阴性或⑶55/59阳性细胞上介导高水平⑶C的能力；
[0230]8.诱导同型粘着的能力；
[0231]9.结合⑶20后诱导转位到脂筏中的能力
[0232]10.诱导凋亡的能力；
[0233]11.在表达CD20的细胞上诱导ADCC的能力；
[0234]12.消除表达⑶20细胞的能力；和/或
[0235]13.消除表达低水平的CD20的细胞(CD20ta)的能力。
[0236]本发明优选的人单克隆抗体满足这些标准中的一条或多条。利用多种已知的技术，可以测试人单克隆抗CD20抗体介导CDC的能力。例如，可以从健康个体的血液中获得补体血清，所述血液可以进行离心和收集。为了测定各种mAbs的CDC活性，可以使用不同的方法。例如可以测量51Cr释放或者可以利用碘化丙锭(PI)排除测试来评估提升的膜渗透性。简言之，可以洗涤靶细胞并且在RPM1-1% BSA中重悬为lX106/ml。可以向细胞中加入各种浓度的mAb并且允许在室温结合10-15分钟。随后加入血清至终浓度20% (v/v)并且将细胞在37°C温育45分钟。可以在FACS管中将所有来自每个样品的细胞加至PI溶液。混合物随后可以立即利用FACScalibur流式细胞仪通过流式细胞分析进行评估并且利用 CellQuest pro 软件(BD Biosciences, Mountain view, CA)进行分析。
[0237]为了检测启动凋亡的能力，可以，例如，将人单克隆抗CD20抗体与CD20阳性肿瘤细胞，例如，Daudi 一起于37°C温育约20小时。可以收集细胞并在膜联蛋白-V-FITC结合缓冲液(BD biosciences)中洗涤，并且以膜联蛋白V_FITC(BD biosciences)于4°C黑暗中标记15分钟。可以在FACS管中将所有来自每个样品的细胞加至PI溶液(10yg/ml于PBS中)并且立即通过流式细胞分析进行评估(如上)。
[0238]在本发明的一个特定实施方案中，将人单克隆抗体组合使用，例如，作为一种包含一种或多种抗CD20单克隆抗体的药物组合物。可以将具有不同但互补的活性的人抗CD20单克隆抗体组合于单个治疗以达到预期的治疗或诊断效果。在一个优选的实施方案中，该组合物包括一种介导⑶C的抗⑶20人单克隆抗体，组合以另一种诱导凋亡的人抗⑶20单克隆抗体。在另一实施方案中，该组合物包括一种介导高效杀伤靶细胞的抗CD20人单克隆抗体，组合以另一种抑制表达⑶20细胞生长的人抗⑶20单克隆抗体。
[0239]I1.制备产生人单克隆抗CD抗体的转基因非人动物
[0240]在另一方面，本发明提供了诸如转基因或转染色体小鼠的转基因和转染色体非人动物，它能够表达可以特异性结合CD20的人抗体。在一种特定的实施方案中，发明提供一种具有包含人重链转基因的基因组的转基因或转染色体小鼠，从而当用表达CD20的细胞进行免疫时该小鼠产生人抗CD20抗体。人重链转基因可以整合入小鼠的染色体DNA中，如转基因的，例如本文详细描述和示例的HuMab小鼠的情况一样。或者，人重链转基因可以保持于染色体外，如W002/43478中所述的转染色体(例如，KM)小鼠的情况一样。这类转基因和转染色体动物能够通过进行V-D-J重组和同种型转换产生抗CD20的人单克隆抗体的多种同种型(例如IgG、IgA和/或IgE)。以异源抗体集合应答外源抗原刺激的转基因或转染色体非人动物的设计，需要包含在转基因动物中的异源免疫球蛋白转基因在整个B细胞发育途径中正确地发挥作用。这包括，例如，异源重链转基因的同种型转换。因此，构建本发明的转基因，以便能诱导同种型转换和下列抗体基因特性的一种或多种:(1)高水平的和细胞类型特异性的表达，(2)功能性基因重排，(3)活化等位排斥并对等位排斥作出反应，(4)表达足够的一级成分，(5)信号转导，(6)体细胞高变，和(7)在免疫应答中所述转基因抗体基因座的支配作用。
[0241]并不需要满足上述所有标准。例如，在转基因动物的内源免疫球蛋白基因座被功能性破坏的实施方案中，所述转基因不必活化等位排斥。另外，在所述转基因包括功能性重排的重链和/或轻链免疫球蛋白基因的实施方案中，第二个标准即功能性基因重排是不需要的，至少对于业已重排的转基因来说是如此。关于分子免疫学的背景知识，参见Fundamental Immunology,2n`d edition(1989), Paul,William E., ed.Raven Press,N.Y.。
[0242]在某些实施方案中，本发明用于制备人单克隆抗体的转基因非人动物在转基因动物种系中含有重排的、未重排的或重排的和未重排的异源免疫球蛋白重链和轻链转基因的组合。每一个重链转基因包含至少一个CH基因。另外，所述重链转基因可以包含有功能的同种型转换序列，该序列能支持编码多个CH基因的异源转基因在所述转基因动物的B细胞中的同种型转换。所述转换序列可以天然存在于被用作转基因(^基因来源的物种的种系免疫球蛋白基因座上，或者所述转换序列可以来源于存在于接受所述转基因构建体的物种(转基因动物)中的序列。例如，用于产生转基因小鼠的人转基因构建体如果结合类似于天然存在于小鼠重链基因座上的转换序列的话，就能产生高频率的同种型转换事件，因为小鼠转换序列可能进行了优化，能和小鼠转换重组酶系统一起发挥作用，而所述人转换序列则不能。可以分离转换序列并通过传统克隆方法克隆，或者通过根据公开的与免疫球蛋白转换区序列相关的序列信号设计的重叠的合成寡核苷酸从头合成(Mills等，Nucl.AcidsRev.15:7305-7316,1991 ；Sideras 等，Intl.1mmunol.1:631-642,1989)。对上述每一种转基因动物来说，在显著比例(至少10%)的所述转基因动物B细胞中发现了功能性重排的异源重链和轻链免疫球蛋白转基因。
[0243]用于产生本发明转基因动物的转基因包含一个重链转基因，该转基因包含编码至少一个可变基因片段，一个多样性基因片段，一个连接基因片段和至少一个恒定区基因片段的DNA。免疫球蛋白轻链转基因包含编码至少一个可变基因片段，一个连接基因片段和至少一个恒定区基因片段的DNA。编码所述轻链和重链基因片段的基因片段相对于转基因动物而言是异源的，因为它们来源于或者相应于来自不包含所述转基因非人动物的物种中编码免疫球蛋白重链和轻链基因片段的DNA。在本发明的一个方面，构建所述转基因，以便单个的基因片段是未重排的，即没有进行重排，以便编码有功能的免疫球蛋白轻链或重链。所述未重排的转基因支持V、D和J基因片段的重组(功能性重排)，并优选支持在接触CD20抗原时，在所述转基因动物体内将D区基因片段的全部或一部分掺入到所得到的重排免疫球蛋白重链上。
[0244]在另一个实施方案中，所述转基因包含一个未重排的“微型基因座”。所述转基因通常包含C、D和J片段的主要部分，以及V基因片段的亚型。在所述转基因构建体中，诸如启动子、增强子、类型转换区、RNA加工的剪接供体和剪接受体序列和重组信号之类的各种调控序列，包含来自所述异源DNA的相应序列。所述调控序列可以整合到来自用于本发明的非人转基因动物的相同或相关物种的转基因上。例如，可以将人免疫球蛋白基因片段与啮齿类动物免疫球蛋白增强子序列组合在一个转基因上以便用于转基因小鼠。另外，可以将合成的调控序列整合到所述转基因上，其中，所述合成的调控序列与已知天然存在于哺乳动物基因组中的功能性DNA序列不同源。合成的调控序列是按照公认的规则设计的，例如，规定剪接-受体位点或启动子/增强子基序的容许序列的规则。例如，与天然存在的种系Ig基因座相比，微型基因座包含具有至少一个非必需DNA部分(例如，间隔序列；内含子或其部分)内部(即不在该部分的末端)缺失的基因组免疫球蛋白基因座的一部分。
[0245]优选的转基因和转染色体非人动物，例如，小鼠，具有免疫球蛋白产物的大部分成分，理想的是在调整体积后基本上类似于人的免疫球蛋白组成成分。通常至少占大约10%，优选25-50%或更多的多样性。一般，根据导入小鼠基因组中的V、J和D区的数量会产生至少大约1000种不同的免疫球蛋白(优选IgG)，优选104-106或更多，并且由在连接区上的V(-D-)J基因片段重组随机核苷酸添加所产生的其它多样性所驱动。一般地，免疫球蛋白对预先确定抗原的亲和力(KD)为小于10_7M，如小于10_8M、10_9M或ΙΟ,Μ或甚至更低。
[0246]如上所述的转基因的和转染色体的非人动物，例如，小鼠可以用，例如，表达CD20的细胞进行免疫。或者，该转基因动物可以用编码人CD20的DNA进行免疫。这些动物随后将产生通过转换重组(顺式转换)进行类型转换的Β细胞并且表达与CD20反应的免疫球蛋白。该免疫球蛋白可以是人抗体(也称为“人序列抗体”)，其中重链和轻链多肽由人转基因序列所编码，它可以包括源于体细胞突变和V区重组连接的序列，以及种系编码序列；这些人抗体可以称作基本上与由人\和叉或Vh、Dh和JH基因片段所编码的多肽序列相同，即使其它种系序列可以作为体细胞突变和不同的V-J和V-D-J重组连接的结果存在。每个抗体链的可变区一般与人种系V、J至少80%相似，并且对于重链来说，与D基因片段相似；经常是与存在于转基因上的人种系序列至少85%相似；常常与存在与转基因上的人种系序列90%或95%或更高地相似。不过，由于非种系序列是由体细胞突变和VJ以及VDJ连接引入的，人序列抗体经常会具有一些可变区序列，它不是由小鼠种系的人转基因中发现的人V、D或J基因片段所编码的。一般地，这种非种系序列(或个别的核苷酸位置)将在CDR中或附近聚集，或在聚类已知体细胞突变的区域聚集。[0247]本发明的另一方面包括源自如本文所述的转基因或转染色体非人动物的B细胞。所述Β细胞可以用于产生表达人单克隆抗体的杂交瘤，所述单克隆抗体以高亲和力(例如，低于10_7Μ的解离平衡常数(KD))结合人CD20。因而，在一个实施方案中，本发明提供一种杂交瘤，它产生具有低于10_7M的亲和力(KD)的人抗体，如低于10_8M、10_9M或ΙΟ,Μ或甚至更低，所述亲和力是当通过利用放射活性标记的单克隆抗体进行表达CD20的细胞的scatchard分析或通过利用FACS分析测定半最大结合浓度而进行测定时得到的。
[0248]在本文中单克隆抗体包含一种人序列轻链，所述轻链由(1)具有与由人'基因片段和人叉片段所编码的多肽序列基本上相同的多肽序列的轻链可变区，和(2)由人Q基因片段编码的轻链恒定区；和一种人序列轻链，所述轻链由(1)具有与由人VH基因片段、D区和人JH片段所编码的多肽序列基本上相同的多肽序列的重链可变区，和(2)由人CH基因片段编码的重链恒定区。
[0249]通过一种在具有包含整合的人免疫球蛋白转基因的基因组的转基因非人动物中扩增人可变区基因片段集合的方法可以促进抗CD20的高亲和力人单克隆抗体的发展，所述方法包括将一种包含V区基因片段的V基因转基因导入基因组中，所述V区基因片段不存在于所述整合的人免疫球蛋白转基因中。通常，所述V区转基因是包含一部分人VH*'(VK)基因片段排列的酵母人工染色体，该基因片段排列可以天然存在于人基因组中，或者可以通过重组方法分别剪接在一起，它可以包含失调的(out of order)或省略的V基因片段。通常在YAC上包含至少5个或更多个功能性V基因片段。在这种变化形式中，可能通过V集合扩增方法制备一种转基因小鼠，其中，该小鼠表达的免疫球蛋白链包含由存在于V区转基因上的V区基因片段编码的可变区序列和由人Ig转基因上编码的C区。通过V集合扩增方法，可以产生具有至少5个不同V基因的转基因小鼠。因为小鼠可以包含至少大约24个V基因或更多。某些V基因片段可能是无功能的(例如，假基因等)；所述片段可以保留，或者如 果需要的话，可以通过技术人员现有的重组方法选择性地删除这些片段。
[0250]一旦将所述小鼠种系工程改造成包含具有基本上不存在于含有J和C基因片段的人Ig转基因上的扩增的V片段组成成分的有功能的YAC，就可以将该性状繁殖并转育到其它遗传背景中，包括具有扩增的V片段组成成分的有功能的YAC被转育到具有不同的人Ig转基因的小鼠种系中的背景。可以将具有扩增的V片段组成成分的多个有功能的YACs转育到一个种系中，以便与人Ig转基因(或多个人Ig转基因)一起起作用。尽管在本文中被称为YAC转基因，这种转基因在整合到所述基因组中之后可能基本上缺乏酵母序列，如缺乏在酵母中自主复制所需要的序列；在酵母中复制之后一旦不再需要(即在导入小鼠ES细胞或小鼠原合子中之前)，可以通过遗传工程(例如，限制性消化和脉冲场凝较电泳或其它合适方法)选择性地除去所述序列。繁殖人序列免疫球蛋白表达性状的方法，包括培育具有人Ig转基因，并且还选择性地具有包含扩增的V片段组成成分的有功能的YAC的转基因小鼠。'基因片段都可以存在于YAC上。操作者可以将所述转基因小鼠转育到任何背景，包含具有其它人转基因的背景，包含人Ig转基因和/或编码其它人淋巴细胞蛋白的转基因。本发明还提供了一种由具有扩增的V区成分YAC转基因的转基因小鼠产生的高亲和力人序列免疫球蛋白。尽管上面公开了本发明转基因动物的优选实施方案，其它实施方案也是可行
[0251]的，可以将这些实施方案划分成三种类型:[0252]1.含有未重排的重链和重排的轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物；
[0253]I1.含有未重排的重链和未重排的轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物；
[0254]II1.含有重排的重链和未重排的轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物。
[0255]在这些类型的转基因动物中，其优选的顺序如下其中，业已通过同源重组(或其它方法)敲除了内源轻链基因(或至少是K基因)其中，并未敲除内源轻链基因，并且必须经过等位排斥成为显性。
[0256]II1.能结合CD20的双特异性/多特异性分子
[0257]在本发明的另一个实施方案中，可以将抗CD20的人单克隆抗体衍生化，或者与诸如另一种肽或蛋白质(例如，Fab，片段)的另一种功能性分子偶联，以便制备能结合多个结合位点或靶表位的双特异性或多特异性分子。例如，本发明的抗体或其抗原结合部分能功能性地连接于(例如，通过化学连接、基因融合、非共价结合或其它方式)诸如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物的
[0258]一种或多种其它结合分子上。
[0259]因此，本发明包括含有至少一种对⑶20的第一结合特异性和对第二种靶表位的第二结合特异性的双特异性和多特异性分子。在本发明的一种特定实施方案中，所述第二靶表位是Fc受体，例如人Fc y RI (⑶64)或人Fc α受体(⑶89)，或Τ细胞受体，例如⑶3。因此，本发明包括能够同时结合表达Fc yR、Fc a R或Fc ε R的效应细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或多型核细胞(PMNs))和表达CD20的靶细胞的双特异性和多特异性分子。这些双特异性和多特异性分子将CD20引导至效应细胞，并且象本发明的人单克隆抗体一样，诱导Fc受体介导的效应细胞的活性，如吞噬表达CD20的细胞、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放、或产生超氧化物阴离子。
[0260]本发明的双特异性和多特异性分子除了抗Fc结合特异性或抗靶细胞抗原和抗CD20结合特异性之外，还可以包括第三种结合特异性。在一个实施方案中，所述第三种结合特异性是抗增强因子(EF)部分，例如，结合参与细胞毒性活性的表面蛋白，并因此增强对所述靶细胞的免疫应答的分子。“抗增强因子部分”可以是一种抗体、功能性抗体片段或结合诸如抗原或受体的特定分子的配体，并因此导致Fc受体或靶细胞抗原的结合决定因子效果的增强。“抗增强因子部分”可以结合Fc受体或靶细胞抗原。另外，所述抗增强因子部分可以结合在与所述第一和第二结合特异性结合的实体不同的实体上。例如，抗增强因子部分可以结合一种细胞毒性T细胞(例如，通过⑶2、⑶3、⑶8、⑶28、⑶4、⑶40、ICAM-1或其它免疫细胞，它们导致针对所述靶细胞的免疫应答增强)。
[0261]在一个实施方案中，本发明的双特异性和多特异性分子包括至少一种抗体，或其抗体片段作为结合特异性，包括，例如，Fab、Fab,、F(ab’)2、Fv、或单链Fv。所述抗体也可以是轻链或重链二聚体或其任何最小片段，如Fv或公开于Ladner等US4，946，778中的单链构建体。该抗体还可以是一种公开于US2003/0118592和US2003/0133939的结合结构域免疫球蛋白融合蛋白。
[0262]在一个实施方案中，本发明的双特异性和多特异性分子包含对存在于效应细胞表达上的Fc y R或人Fc a R的结合特异性，以及对靶细胞抗原，例如，⑶20的第二结合特异性。
[0263]在一个实施方案中，对Fc受体的结合特异性是由人单克隆抗体提供的，它的结合不受人免疫球蛋白G(IgG)阻断。如本文所用的，术语“IgG受体”表示位于1号染色体上的8个?链基因中的任一个。这些基因一共编码12种跨膜或可溶性受体同种型，这些同种型被划分成三种类型的
[0264]Fc y 受体:Fc y RI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16)。在一种优选实施方案中，Fcy受体是人高亲和力Fc yRI。
[0265]Fanger等在W088/00052和US4954617中介绍了这些优选单克隆抗体的产生和特征分析。这些抗体与Fc yR1、Fc YRII或Fc YRIII的表位结合的位点，与所述Fc R的受体结合位点不同，因此，其结合基本上不会受到IgG生理水平的的抑制。在本发明中有用的特异性抗Fc y RI抗体是mAb22、mAb32、mAb44、mAb62和mAbl97。在其它实施方案中，所述抗Fcy受体抗体是单克隆抗体22 (H22)的人源化形式。H22抗体的产生和特征分析公开在Graziano R.F.等(1995) J.1mmunol 155 (10):4996-5002 和 W094/10332 中。H22 抗体生产细胞系以HA022CL1的名称，于1992年11月4日保存在美国典型培养物保藏中心，保藏号为 CRL11177。
[0266]仍然在另一种优选实施的方案中，对Fc受体的结合特异性是由结合诸如Fc-a受体(Fc a RI (CD89))的人IgA受体的抗体提供的，所述抗体的结合优选不会受到人免疫球蛋白A(IgA)的阻断。术语“IgA受体”意在包含位于19号染色体上的一个a基因(FcaRI)的基因产物。已知该基因编码55-110kDa的若干种不同剪接的跨膜同种型。Fc a RI (⑶89)是在单核细胞/巨噬细胞、嗜伊红性和嗜中性粒细胞上组成型表达的，但不能在非效应性细胞群体上表达。Fc a RI对IgAl和IgA2具有中等亲和力，该亲和力在接触诸如 G-CSF 或 GM-CSF 的细胞因子之后会提高(Morton, H.C.等，1996，Critical Reviewsin Immunology 16:423-440)。业已介绍了能在IgA配体结合结构域之外结合Fc a RI的四种Fc a RI特异性单克隆抗体，这些抗体被确定为A3、A59、A62和A77 (Monteiro, R.C.等，1992, J.1mmunol.148:1764)。
[0267]FcaRI和FcyRI是用`于本发明的优选的触发受体，因为它们是⑴主要在诸如单核细胞、PMNs、巨噬细胞和树突细胞的免疫效应细胞上表达的；(2)以高水平表达(例如，每个细胞5，000-100，000) ；(3)细胞毒性活性的介体(例如，ADCC，吞噬作用)；(4)介导靶向它们的包括自身抗原在内的抗原的增强了的抗原呈递。
[0268]在另一个实施方案中，双特异性分子由两种根据本发明的单克隆抗体组成，这两种单克隆抗体具有互补的活性，如一种抗体主要通过诱导CDC起作用而另一种抗体主要通过诱导凋亡起作用，例如，2F2结合以11B8。
[0269]在其它实施方案中，本发明的双特异性和多特异性分子还包括识别，例如，结合诸如CD20的靶细胞抗原的结合特异性。在一种优选的实施方案中，所述结合特异性是由本发明的人单克隆抗体提供的。
[0270]如本文所用的“效应细胞特异性抗体”表示结合效应细胞的Fc受体的抗体或功能性抗体片段。用于本发明的优选抗体与效应细胞Fc受体在一个内源免疫球蛋白不能结合的位点结合。
[0271]如本文所用的，术语“效应细胞”表示参与免疫应答的效应期的免疫细胞，所述效应期与免疫应答的识别期和激活期相反。例示性的免疫细胞包括骨髓或淋巴来源的细胞，例如，淋巴细胞(例如，B细胞和T细胞，包括溶细胞T细胞(CTLs))、杀伤细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜伊红性粒细胞、嗜中性粒细胞、多型核细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。某些效应细胞表达特异性Fc受体，并且执行特定的免疫功能。在优选的实施方案中，效应细胞能够诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，例如，嗜中性粒细胞能够诱导ADCC。例如，表达FcR的单核细胞、巨噬细胞参与靶细胞的特异性杀伤和将抗原呈递给免疫系统的其它成分或者结合到呈递抗原的细胞上。在其它实施方案中，效应细胞可以吞噬靶抗原、靶细胞或微生物。可以通过诸如细胞因子的体液因子调控特定FcR在效应细胞上的表达。例如，业已发现干扰素Y(IFN-Y)上调FcyRI的表达。这种增强的表达提高了具有FcyRI的细胞对靶的细胞毒性。效应细胞可以吞噬或裂解靶抗原或靶细胞。
[0272]“靶细胞”意为个体(例如，人或动物)体内的能够由本发明的组合物(例如，人单克隆抗体，双特异性或多特异性分子)靶向的任何不需要的细胞。在一种优选的实施方案中，所述靶细胞是表达或过表达⑶20的细胞。表达⑶20的细胞一般包括B细胞和B细胞肿瘤。
[0273]尽管人单克隆抗体是优选的，可以用于本发明的双特异性或多特异性分子中的其它抗体为鼠类、嵌合型和人源化的单克隆抗体。这些鼠类、嵌合型和人源化的单克隆抗体可以通过本领域已知的方法进行制备。
[0274]可以利用化学技术(参见，例如D.M.Kranz 等，1981, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA78:5807)、“多瘤”技术(参见授予Reading的US4474893)或重组DNA技术制备本发明的双特异性和多特异性分子。
[0275]具体地讲，可以利用本领域公知的、并且在本文所提供的实施例中所介绍的方法，通过结合组成性结合特异性，例如，抗FcR和抗CD20的结合特异性，制备本发明的双特异性和多特异性分子。例如，可以分别制备所述双特异性和多特异性分子的每一种结合特异性，然后再彼此结合在一起。当所述结合特异性是蛋白或肽时，可以将多种偶联剂或交联剂用于共价结合。交联剂的例子包括蛋白A、碳化二亚胺、N-琥珀酰亚氨基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5’ - 二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻-亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基 二硫代)丙酸酯(STOP)和磺基琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烧-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(参见例如，Karpovsky等，1984, J.Exp.Med.160:1686 ；Liu, MA 等，1985，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA82:8648)。其它方法包括由Paulus (Behring Ins.Mitt.,1985, N0.78: 118-132) ；Brennan 等(Science,1985,229:81-83)和 Glennie 等(J.1mmunol.，1987，139:2367-2375)所介绍的方法。优选的结合制剂是SATA和磺基-SMCC，这两种制剂都可以从Pierce化学公司(Rockford，IL)购买。
[0276]当所述结合特异性是抗体时，可以通过两个重链的C-末端铰链区的巯基键将它们结合。在一种特别优选的实施方案中，在结合之前对所述铰链区进行修饰，以使其包含奇数数量的巯基残基，优选一个残基。
[0277]或者，两种结合特异性可以编码在同一个载体中，并且在同一个宿主细胞中表达和组装。当所述双特异性和多特异性分子是mAbXmAb、mAbXFab、FabXF(ab’)2或配体XFab融合蛋白时，该方法特别适用。本发明的双特异性和多特异性分子，例如，双特异性分子可以是单链分子，如单链双特异性抗体，包括一个单链抗体和一个结合决定子的单链双特异性分子，或包括两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性和多特异性分子还可以是单链分子或者可以包括至少两个单链分子。例如，制备双特异性和多特异性分子的方法在例如 US5260203 ；US5455035 ；US4881175 ；US5132405 ；US5091513 ；US5476786 ；US5013653 ；US5258498 ;和 US5482858 中进行了介绍。
[0278]可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如，生长抑制)或Western印迹测定证实所述双特异性和多特异性分子对其特异性靶的结合。上述每一种测定通常通过采用对目标复合物特异性的标记过的试剂(例如，抗体)，来检测特定目标的蛋白-抗体复合物的存在。例如，可以用能识别、并特异性结合抗体_FcR复合物的诸如酶联抗体或抗体片段检测FcR抗体复合物。或者，可以用多种其它免疫测定方法中的任一种检测复合物。例如，可以对所述抗体进行放射性标记，并用于放射免疫测定(RIA)(参见，例如，Weintraub,B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh TrainingCourse on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986。可以利用诸如Y计数器或闪烁计数器或通过放射性自显影检测所述放射性同位素。
[0279]IV.杭体结合物
[0280]在另一方面，本发明描述了与诸如细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性同位素的治疗成分结合的人抗CD20单克隆抗体。在本文中这种结合物称为“免疫结合物”。包括一种或多种细胞毒素的免疫结合物称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的(例如，杀伤性)的任何试剂。其例子包括紫杉醇、细胞松弛素Β、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、足叶乙式、tenoposide、长春新碱、长春花碱、秋水仙素、阿霉素、道诺红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、l_脱氢睾酮、糖皮质素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、和嘌呤霉素及其类似物或同系物。 [0281]用于形成免疫结合物的合适的治疗剂包括，但不限于抗代谢物(例如，氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)、烷化剂(例如，氮芥、thio印a苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消胺、二溴甘露糖醇、链脲菌素、丝裂霉素C和顺二氯二胺钼(II) (DDP)顺钼)、蒽环类(例如，道诺红霉素(以前称之为道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，放线菌素(以前称之为更生霉素)、博来霉素、普卡霉素和氨茴霉素(AMC))，以及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春花碱)。在一个优选的实施方案中，治疗剂是一种细胞毒性剂或放射毒性剂。在另一个实施方案中，治疗剂是一种免疫抑制剂。还在另一个实施方案中，治疗剂是GM-CSF。在一个优选的实施方案中，治疗剂是阿霉素、顺钼、博来霉素、硫酸盐、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺或蓖麻毒素A。
[0282]可以将本发明的抗体与放射性同位素，例如1-131、钇-90或铟-111结合，以便制备细胞毒性放射性药物，用于治疗与CD20相关的疾病，如癌症。本发明的抗体结合物可用于修饰特定的生物学反应，并且所述药物成分并不被视为局限于传统的化学治疗剂。例如，所述药物成分可以是具有所需生物学活性的蛋白或多肽。例如，所述蛋白可以包括酶促活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素、或白喉毒素；诸如肿瘤坏死因子或干扰素、的蛋白；或生物学反应修饰剂，如淋巴因子、白介素_1( “IL-1”)、白介素-2( “IL-2”)、白介素-6( “IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生长因子。
[0283]将所述治疗成分结合在抗体上的技术是众所周知的，参见，例如，Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting of Drugs In Cancer Therapy，，，inMonoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld 等(编辑)，pp.243-56 (AlanR.Liss, Inc.1985) ；Hellstrom 等，“Antibodies For Drug Delivery”，in ControlledDrug Delivery (第二版),Robinson 等(编辑)，pp.623-53 (Marcel DEkker, Inc.1987)；Thorpe, “Antibody Carriers of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review，，，in Monoclonal Antibodies84:Biological And Clinical Applications, Pinchera等(编辑)，pp.475-506 (1985) ;“Analysis, Results, And Future Prospectiveof The Therapeutic Use of Radiobeled Ant ibody In Cancer Therapy，，，inMonoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin 等(编辑)，pp.303-16(Academic Pressl985), and Thorpe 等，“The Preparation And CytotoxicProperties of Antibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.,62:119-58 (1982)。
[0284]在另一方面，将根据本发明的人单克隆抗体附于联结螯合剂上，如tiuxetan，它允许将抗体结合到放射性同位素上。
[0285]V.药用纟目合物
[0286]在另一方面，本发明提供了一种组合物，例如，一种含有本发明的一种或组合的人单克隆抗体的药物组合物。该药物组合物可以与可药用的载体或溶剂以及任何其它已知的佐剂和赋形剂以传统技术如那些在Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版，Gennaro，编辑，Mack Publishing C0.，Easton, PA, 1995 中公开的技术在一起配制。在一个实施方案中，该组合物包括多种(例如，两种或更多种)分离的本发明的人抗体的组合，所述抗体以不同的机制起作用，例如，一种抗体主要通过诱导CDC起作用，组合以另一种主要通过诱导凋亡起作用的抗体。
[0287]本发明的药物组合物还可以以组合疗法的形式进行给药，即组合以其它药物。例如，组合疗法可以包括本发明的一种组合物和至少一种抗炎剂或至少一种免疫抑制剂。在一个实施方案中这类治疗剂包括一种或多种抗炎剂，如甾体药物或NSAID(非甾体抗炎药物)。优选的药剂包括，例如阿司匹林和其它水杨酸盐，Cox-2抑制剂,如rofecoxib (Vioxx)和 celecoxib (Celebrex)，NSAIDs 如布洛芬(Motrin, Advil)，非诺洛芬(Nalfon)，萘普生(Naprosyn),舒林酸(Clinoril), 二氯芬酸(Voltaren),吡罗昔康(Feldene),酮洛芬(Orudis), 二氟尼柳(Dolobid),萘丁美酮(Relafen),依托度酸(Lodine),噁丙秦(Daypro),和吲哚美辛(Indocin)。
[0288]在另一个实施方案中，这类治疗剂包括一种或多种DMARDs，如氨甲蝶呤(Rheumatrex),轻氯喹(Plaquenil),水杨酸偶氮磺胺吡啶(Asulfidine),喃唳合成抑制齐II，例如，来氟米特(Arava), IL-1受体阻抑剂，例如,anakinra (Kineret)，和TNF_a阻抑剂，例如，etanercept (Enbrel)，infliximab (Remicade)和 adalimumab。
[0289]在另 ^实施方案中，这类治疗剂包括一种或多种免疫抑制剂，如环抱霉素(Sandimmune, Neoral)和义美仁(Imural)。
[0290]还在另一个实施方案中，这类治疗剂包括一种或多种化疗剂，如阿霉素(Adriamycin)、顺钼(Platinol)、博来霉素(Blenoxane)、卡莫司汀(Gliadel)、环磷酰胺(Cytoxan, Procytox, Neosar)和苯丁酸氮芥(Leukeran)。
[0291]在另一个实施方案中，本发明的人抗体可以结合苯丁酸氮芥和泼尼松龙；环磷酰胺和泼尼松龙；环磷酰胺，长春新碱和泼尼松；环磷酰胺，长春新碱，阿霉素和泼尼松；氟达拉滨和蒽环霉素；或结合其它普通的对于NHL的多药物方案，如,例如在Non-Hodgkin’ sLymphomas:Making sense of Diagnosis， Treatment， and Options， Lorraine Johnston,1999，0’ Reilly and Associates，Inc中公开的方案一起进行给药。
[0292]还在另一个实施方案中，人抗体可以结合放疗和/或自体外周血干细胞或骨髓移植进行给药。
[0293]仍然在另一个实施方案中，人抗体可以结合一种或多种选自人抗CD25抗体、抗⑶19抗体、抗⑶21抗体、抗⑶22抗体、抗⑶37抗体、抗⑶38抗体、抗IL6R抗体、抗IL8抗体、抗IL15抗体、抗IL15R抗体、抗⑶4抗体、抗⑶11a抗体(例如natalizumab)、抗α -4/β -1整联蛋白(VLA4)抗体(例如，natalizumab)和CTLA4_Ig的抗体进行给药。
[0294]在一个特定的实施方案中，人单克隆抗体结合抗CD25抗体进行给药来治疗例如在移植物抗宿主病患者中的大疱性类天疱疮。
[0295]在另一个特定的实施方案中，人单克隆抗体结合一种或多种选自抗CD19抗体、抗⑶21抗体、抗⑶22抗体、抗⑶37抗体、抗⑶38抗体的抗体进行给药来治疗恶性疾病。
[0296]仍然在另一个特定的实施方案中，人抗体结合一种或多种选自抗IL6R抗体、抗IL8抗体、抗IL15抗体、抗IL15R抗体、抗⑶4抗体、抗⑶11a抗体(例如natalizumab)、抗α -4/ β -1整联蛋白(VLA4)抗体(例如，natalizumab)和CTLA4_Ig的抗体进行给药来治疗炎症疾病。
[0297]还在另一个实施方案中，人抗体可以结合抗C3b (i)抗体进行给药以便增强补体激活。
[0298]如本文所用的，“可以药用的载体”包括在生理学上可混溶兼容的任一种和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细 菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸附延迟剂等。优选地，所述载体适合通过静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮途径使用(例如，通过注射或输注)。根据给药途径，可以用一种材料对活性化合物，即抗体、双特异性或多特异性分子进行包衣，以便保护该化合物免受有可能使该化合物失活的酸和其它自然条件的作用。
[0299]“可以药用的盐”表示能保留亲本化合物的理想生物学活性，并且不会产生任何不需要的毒理学作用的盐(例如，参见Berge，S.Μ.等，1977，J.Pharm.Sc1.66:1-19) ?所述盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括源于诸如氢氯酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸之类的无毒无机酸的盐，以及源于诸如脂肪族一和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳香族磺酸之类的无毒有机酸的盐。碱加成盐包括源于诸如钠、钾、镁、钙之类的碱土金属盐，以及源于诸如N，N’_ 二苯基乙二胺、N-甲基谷胺酰胺、盐酸普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺和普鲁卡因之类的无毒有机胺的盐。
[0300]本发明的组合物可以通过本领域已知的多种方法给药。正如技术人员可以理解的，给药途径和/或方式可以根据需要的结果改变。所述活性化合物可以和能够防止该化合物迅速释放的载体一起制备，如控释制剂，包括移植物、经皮贴膏，和微型胶囊化输送系统。可以使用能生物降解的、生物兼容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备所述制剂的很多方法已经具有专利或者为本领域技术人员所普遍公知。例如，参见 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,编辑，Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。
[0301]为了通过某些给药途径使用本发明的化合物gcg，可能有必要用一种材料对该化合物进行包衣，或者与该化合物共给药，以防止其失活。例如，所述化合物可以在诸如脂质体或稀释剂的合适载体中给予个体。可药用的稀释剂包括盐水和含水的缓冲液。脂质体包括水包油包水CGF乳液，以及传统的脂质体(Strejan等，1984, J.Neuroimmunol.7:27)。
[0302]可以药用的载体包括无菌水溶液或分散剂，以及用于临时制备无菌注射溶液或分散剂的无菌粉末。所述介质和制剂作为药用活性物质的用途在本领域中都是公知的。任何传统介质或试剂都可将其用于本发明的药用组合物中，除非与所述活性化合物不配伍。还可将补充性活性化合物掺入所述组合物中。
[0303]治疗组合物一般必须是无菌的，并且在产生和储存条件下是稳定的。可以将所述组合物制备成溶液、微乳液、脂质体、或其它适合高药物浓度的有序结构。所述载体可以是含有诸如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。例如，可以通过使用诸如卵磷脂的包衣剂，对于分散剂来说通过保持需要的粒度，以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。在很多情况下，在所述组合物中优选包括等渗剂，例如，糖、聚醇，如甘露糖醇、山梨醇或氯化钠。通过在所述组合物中添加诸如单硬脂酸盐和明胶的能延长吸收的制剂，实现所述可注射组合物的延长吸收。
[0304]无菌注射溶液可以通过以下方法制备:将所需量的活性化合物掺入合适的溶剂中，该溶剂根据需要含有上面所列举的一种成分或几种成分的组合，然后进行消毒微量过滤。通常，分散剂是通过将所述活性化合物添加到含有基本分散介质和来自上文所列举的其它必需成分的无菌载体中而制备的。对于用来制备无菌注射溶液的无菌粉末来说，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冷冻干燥)，它获得所述活性成分的粉末，和来自它的事先无菌过滤的溶液的任何其它必需成分。
[0305]对剂量方案进行调整，以便提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以给予单一的药团，可以隔一定时间给予若干分开的剂量，或者根据表现出来的治疗状况紧急程度的需要，相应地减少或增加剂量。将肠胃外组合物制成剂量单位形式是特别有利的，它可以方便服用，并保持剂量的一致性。本文所用的剂量单位形式表示适合作为接受治疗的个体的单一剂量的在物理形式上独立的单位；每个单位含有计算出来的、产生所需治疗效果的预定数量的活性化合物，和需要的药用载体。本发明剂量单位形式的确定直接取决和依赖于(a)所述活性化合物的独特特征和要获得的具体治疗效果，和(b)为了个体的治疗灵敏度制备这样一种活性化合物的领域中所固有的限制。
[0306]可以药用的抗氧化剂的例子包括:(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、镓酸丙酯、α -生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
[0307]对于治疗组合物来说，本发明的制剂包括适合口服、鼻腔、局部(包括口腔和舌下)、直肠、阴道和/或肠胃外给药用的制剂。所述制剂能以单位剂量形式方便地提供，并且可以通过药物学领域的任 何已知方法制备。用于产生单一剂量形式的可以与载体材料组合的活性成分的量，根据被治疗的个体和特定的给药方式而改变。可以与载体材料组合以产生单一剂量形式的的活性成分的量，通常是能产生治疗效果的组合物的量。一般，以百分比衡量，活性成分的用量在大约0.01 %到大约99 %之间，优选大约0.1 %到大约70 %，最优选大约1%到大约30%。
[0308]适合阴道使用的本发明的制剂还包括含有本领域已知合适的载体的子宫托、止血棉塞、乳剂、凝胶、糊剂、泡末或喷雾制剂。用于本发明组合物的局部或经皮给药的剂量形式包括粉末、喷雾剂、软膏、糊剂、乳剂、洗液、凝胶、溶液、膏贴和吸入剂。可以在无菌条件下将活性化合物与可以药用的载体和可能需要的任何防腐剂、缓冲剂和推进剂混合。
[0309]本文所使用的短语“肠胃外给药”和“经肠胃外给药”表示除了肠道和局部给药以外的用药方式，通常是通过注射给药，并且包括，但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、珠网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
[0310]可用于本发明的药用组合物中的合适的含水载体和无水载体的例子包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油，如橄榄油，可注射的有机酯，如油酸乙酯。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣材料，对于分散剂来说通过保持需要的粒度，以及通过使用表面活性剂可以保持适当的流动性。
[0311]这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。通过上述消毒方法，并通过添加各种抗细菌剂和抗真菌剂确保防止出现微生物，例如，添加对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、和酚山梨酸等。可能还需要向所述组合物中添加等渗剂，如糖类、氯化钠等。另外，通过添加能延长吸收时间的诸如单硬脂酸铝和明胶的制剂，实现可注射药用制剂的延长吸收。
[0312]在一个实施方案中，本发明的人单克隆抗体通过皮下注射以晶体形式进行给药，参见，Yang 等(2003) PNAS, 100(12):6934-6939。
[0313]当本发明的化合物在作为药物给人和动物施用时，可以单独使用，或者作为药用组合物使用，例如，0.01-99.5% (更优选0.1-90% )的活性成分与可以药用的载体组合。
[0314]无论选择什么样的给药途径，可以以合适的水化形式应用的本发明的化合物和/或本发明的药用组合物，能通过本领域技术人员所公知的传统方法制备成可以药用的剂量形式。
[0315]本发明药用组合物中的活性成分的实际剂量水平可以改变，以便获得一种治疗组分的用量，它有效地实现预期的对特定患者、组合物、和给药模式的治疗反应，而又对患者没有毒性。选择的剂量水平取决于多种药物动力学因素，包括所使用的本发明的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，给药途径，给药时间，所采用的特定化合物的排出速度，治疗时间，与所采用的特定组合物组合使用的其它药物，化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状态、一般健康情况以及以前的医疗史，以及医学领域众所周知的类似因素。
[0316]具有本领域普通技能的医生或兽医能方便地确定并开出有效量的所需药用组合物。例如，医生或兽医开始使用的所述药用组合物中采用的本发明的化合物的量，低于获得理想治疗效果所需要的量，并逐渐增加剂量，直到获得理想的效果。一般地，本发明组合物的合适的每日剂量是有效产生治疗效果所需要的所述化合物的最低剂量。所述有效剂量通常取决于上述因素。优选通过静脉内、肌内、腹膜内或皮下途径使用，优选在靠近靶位点处给药。如果需要，治疗组合物的每日有效剂量可以按2个、3个、4个、5个、6个或更多个小剂量，在1天内以适当的时间间隔分别使用，选择性地以单位剂量形式使用。本发明的化合物尽管可以单独给药，但优选以药用制剂(组合物)形式给药该化合物。
[0317]在一个实施方案中，根据本 发明的人单克隆抗体可以通过每周输注10_500mg /m2，如200-400mg / m2的剂量进行给药。这种给药可以重复，例如1_8次，如3_5次。所述给药可以通过在2-24小时的时间上，如2-12小时的持续输注而进行。
[0318]在另一个实施方案中，通过长时间，如超过24小时的缓慢持续输注来给药人单克隆抗体，从而减少毒性副作用。
[0319]仍然在另一个实施方案中，以每周250mg-2000mg,如例如300mg、700mg、lOOOmg、1500mg或2000mg的剂量多达8次,如4-6次对人单克隆抗体进行给药。所述给药可以通过在2-24小时的时间上，如2-12小时的持续输注而进行。如果必要的话可以在6个月或12个月后重复这种方案一次或多次。在通过利用靶向抗⑶20抗体的抗独特型抗体，可以在生物样品的给药之后通过测量循环中的单克隆抗CD20抗体来测定或调节剂量。
[0320]还在另一个实施方案中，人单克隆抗体通过维持治疗，如，例如，每周一次持续6个月或更久进行给药。
[0321]仍然在一个实施方案中，根据本发明的人单克隆抗体可以通过一种方案进行给药，所述方案包括一次抗CD20的人单克隆抗体的输注和随后的结合到放射性同位素上的抗⑶20人单克隆抗体的输注。该方案可以例如在7-9天之后进行重复。
[0322]治疗组合物可以用本领域公知的医疗器械给药。例如，在一种优选的实施方案中，本发明的治疗组合物可以用无针头的皮下注射装置给药，如使用公开于以下美国专利中的装置:US5399163 ；US5383851 ；US5312335 ；US5064413 ；US4941880 ；US4790824 或US4596556。可用于本发明中的众所周知的移植物和组件的例子包括:US4487603，它公开了一种用于以受控制的流量分配药物的可植入的微型输注泵；US4486194，它公开了一种用于通过皮肤给药的治疗装 置；US4447233，它公开了一种用于以精确的输注流量输送药物的药物输注泵；US4447224,它公开了一种用于连续药物输送的流量可变的可植入的输注装置；US4439196，它公开了一种具有多个腔室的渗透性药物输送系统；和US4475196，它公开了一种渗透性药物输送系统。很多其它这样的植入物、输送系统、和组件是本领域技术人员所公知的。
[0323]在某些实施方案中，可以对本发明的人单克隆抗体进行配剂，以便确保在体内正确地分配。例如，血脑屏障(BBB)排斥很多高度亲水性化合物。为了确保本发明的治疗化合物能通过BBB(如果需要的话)，可以对所述化合物进行配剂，例如，包在脂质体中。有关产生脂质体的方法参见，例如:US4522811 ；US5374548 JPUS5399331。脂质体可以包括一种或多种成分，这些成分被选择性地输送到特定的细胞或器官，因而增强定向药物输送(参见，例如，V.V.Ranade，1989，J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性的靶向成分包括叶酸或生物素(参见，例如，授予Low等的US5416016);甘露糖苷(Umezawa等，1988,Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038);抗体(P.G.Bloeman 等，1995, FEBS Lett.357:140 ；M.0wais 等，1995, Antimicrob.Agents Chemother39:180);表面活性剂蛋白 A 受体(Briscoe等，1995, Am.J.Physiol.1233:134)，其中的不同种类可以包括本发明的制剂，以及本发明分子的成分；pl20(Schreier等，1994，J.Biol.Chem.269:9090);还可参见K.Keinanen ；M.L.Laukkanen,1994, FEBS Lett.346:123 ；J.J.Killion ；1.J.Fidler,1994,Immunomethods4:273。在本发明的一个实施方案中，本发明的治疗化合物是在脂质体中制备的；在一种更优选的实施方案中，所述脂质体包括一种祀向成分。在一种最优选的实施方案中，所述脂质体中的治疗化合物是通过药团注射的方式输送到靠近目标部位的。所述组合物的流动性必须达到可以注射的程度。在生产和储存条件下，它必须是稳定的，并且必须能防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。
[0324]在另一个实施方案中，可以对本发明的单克隆抗体进行配制以阻止或减少它们通过胎盘的传输。这可以通过本领域已知的方法进行，例如，通过抗体的PEG化或通过利用F(ab)2’ 片段。还可以参见另外的参考文献"Cunningham-Rundies C, Zhuo Z, GriffithB, Keenan J.(1992)Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulincon j ugates.Resistance to enzymatic degradation.Jlmmunol Methods.152:177-190 ；和 〃 Landor M.(1995)Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, AnnAllergyAsthma Immunol74:279_283。当抗体用于治疗或预防复发的自发性流产时这特别有效。
[0325]对于肿瘤治疗的“治疗有量剂量”能够通过可以是完全的或部分的客观肿瘤反应进行测量。完全反应(CR)定义为没有疾病的临床、放射线学或其它迹象。部分反应(PR)缘自超过50%的总体肿瘤大小的减小。进程的中间时间是描述客观肿瘤反应的耐久性的测量值。
[0326]对于肿瘤治疗的“治疗有量剂量”还可以通过其稳定疾病进程的能力进行测量。可以在一种动物模型中评估一种化合物抑制癌症的能力以预测其在人肿瘤中的效力。或者，可以通过熟练技术人员已知的体外测试法检测该化合物抑制细胞生长或凋亡的能力来评估该化合物的特性。一种治疗性化合物的治疗有效量可以减少肿瘤大小，或者在个体中改善症状。本领域的普通技术人员能够基于诸如个体大小、个体症状的严重性和所选的特定组合物或给药途径的因素来确定这种量。
[0327]对于类风湿性关节炎的“治疗有效剂量”优选导致患者中的ACR20PreliminaryDefinition of Improvement,更加优选 ACRSOPreliminary Definition of Improvement并且甚至更加优选 ARC70Preliminary Definition of Improvement。
[0328]ACR20Preliminary Definition of Improvement 定义为:在 Tender JointCount (TCJ)和Swollen Joint Count (SffJ)中> 20%的改善，和在下列5种评估中:患者疼痛评估(VAS)、患者整体评估(VAS)、医生整体评估(VAS)、患者自我评估的失能(HAQ)、Acute Phase Reactant (CRP 或 ESR)的 3 种中 > 20% 的改善。
[0329]ACRS0和ACR70分别以相同的方式定义为≥50%和≥70%的改善。进一步的细节参见 Felson 等.in American College of Rheumatology Preliminary Definition ofImprovement in Rheumatoid Arthritis ；Arthritis Rheumatism(1995) 38:727_735。
[0330]所述组合物必须是无菌的，并且其流动性必须达到使该组合物能够通过注射器输送的程度。除了水之外，所述载体可以是等渗缓冲的盐溶液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，合适的流动性可以通过使用诸如卵磷脂的包衣剂，对于分散剂来说通过保持需要的粒度，以及通过使用表面活性剂来保持。在许多情况下，优选在所述组合物中添加等渗剂，例如，糖类，诸如甘露糖醇或山梨醇的聚醇，和氯化钠。可注射组合物的长期吸收，可以通过在该组合物中添加诸如单硬脂酸铝或明胶的能延长吸收的制剂而实现。
[0331]当所述活性化合物如上所述受到适当保护时，该化合物就可以口服使用，例如，用一种惰性稀释剂或可同化的食用载体进行保护。[0332]V1.本发明的用途和方法
[0333]本发明的人抗体(包括本文所述的免疫结合物、双特异性/多特异性组合物和其它衍生物)具很多体外和体内的诊断和治疗用途，包括涉及表达CD20细胞的病症的诊断和治疗。例如，可以将抗体施用于培养中的，例如体外或来自体内的细胞，或用于人个体，例如，体内，以便治疗、预防或诊断多种疾病。如本文所用的，术语“个体”意在包括对于抗CD20的人抗体产生应答的人和非人动物。优选的个体包括患有能够通过抑制或控制B细胞(正常的或恶性的)进行修正或改善的病症的人患者。
[0334]例如，在一个实施方案中，可以使用本发明的人抗体来治疗致瘤病症患者，例如特征为存在表达CD20的细胞，例如，B细胞淋巴瘤的病症，例如，NHL。可以治疗和/或预防的致瘤疾病的例子包括B细胞淋巴瘤，例如NHL，包括前体B细胞成淋巴细胞白血病/淋巴瘤和成熟B细胞瘤，如B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL) /小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、B细胞原淋巴细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)，滤泡淋巴瘤(FL)，包括低级、中级和高级FL，皮肤毛囊中心淋巴瘤，边缘区B细胞淋巴瘤(MALT型，结节和脾型)，毛细胞白血病，扩散大B细胞淋巴瘤，Burkitt淋巴瘤，浆细胞瘤，浆细胞骨髓瘤，移植后淋巴增生性疾病，Waldenstrom巨球蛋白血症和恢复性大细胞淋巴瘤(ALCL)。
[0335]B细胞非霍奇金淋巴瘤的其它的例子是淋巴瘤样肉芽肿病、原发性扩散淋巴瘤、静脉内大B细胞淋巴瘤、纵隔大B细胞淋巴瘤、重链疾病(包括Υ、μ和α疾病)、由免疫抑制剂疗法所诱导的淋巴瘤，如环孢霉素诱导的淋巴瘤和氨甲蝶呤诱导的淋巴瘤。
[0336]在另一个实施方案中，可以利用本发明的人抗体治疗霍奇金淋巴瘤。
[0337]可以治疗和/或预防的涉及表达CD22细胞的免疫疾病的例子包括自身免疫疾病，如牛皮癣、牛皮癣性关节炎、皮肤炎、系统性硬皮病、炎症性肠疾病(IBD)、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、呼吸窘迫综合征、脑膜炎、脑炎、色素层炎、肾小球肾炎、湿疹、哮喘、动脉粥样硬化、白细胞粘连缺乏、多 发性硬化症、Raynaud综合征、SjSgren综合征、青少年起病型糖尿病、Reiter病、Behcet病、免疫复合性肾炎、IgA肾病、IgM多发性神经病、免疫介导的血小板减少症，如急性特发性血小板减少性紫癜和慢性特发性血小板减少性紫癜，溶血性贫血、重症肌无力、狼疮性肾炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎(RA)、特应性皮炎、天疱疮、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、Wegener肉芽肿病、Omenn氏综合征，慢性肾功能衰竭、急性传染性单核细胞增多症、HIV和疱疹病毒相关疾病。进一步的例子为急性呼吸窘迫综合征和choreoretinitis。另外，其它的疾病和病症包括那些由病毒,如Epstein_Barr病毒(EBV)感染B细胞所引发或介导的疾病和病症。
[0338]其中自身抗体和/或过度的B细胞活性是显著的并且可以治疗和/或预防的炎症性、免疫和/或自身免疫病症的其它例子，包括下列:
[0339]血管炎和其它血管病症，如血管炎和其它脉管病症，如细微多脉管炎、Churg-Strauss综合征和其它ANCA关联的脉管炎、结节性多动脉炎、原发性冷球蛋白血症性脉管炎、皮肤白细胞分裂性脉管炎、川崎病、大动脉炎、巨大细胞关节炎、Henoch-Schnlein紫癜、原发的或分离的脑脉管炎、结节性红斑、血栓闭塞性脉管炎、血栓性血小板减少性紫癜(包括溶血性尿毒性综合征)，和次级血管炎，包括皮肤白细胞分裂性脉管炎(例如，乙肝、丙肝、Waldenstr6m’s巨球蛋白血症、B细胞瘤、类风湿性关节炎、Sj6gren，s综合征或系统性红斑狼疮继发的)；其它的例子为结节性红斑、变应性脉管炎、脂膜炎、Weber-Christian病、紫癜多球蛋白血症和Buerger’s病；
[0340]皮肤病症，如接触性皮炎、线性IgG皮肤病、白斑、坏疽性脓皮病、后天性大疱性表皮松解、寻常性天疱疮(包括疤痕性类天疱疮和大疱性类天疱疮)、疱疹样皮炎、多形红斑和慢性自身免疫性风疹(包括血管神经性水肿和风疹性脉管炎)；
[0341]免疫介导的血细胞减少症，如自身免疫性嗜中性白血球减少症和纯红细胞再生障碍；
[0342]结缔组织病症，如CNS狼疮、盘状红斑狼疮、肢端硬皮综合征、混合性结缔组织病、多肌炎/皮肌炎、包涵体肌炎、继发性淀粉样变性I和II型、冷球蛋白血症、纤维肌痛、磷脂抗体综合征、继发性血友病、复发性多软骨炎、类肉瘤病、强直人综合征、风湿热；其它的例子为嗜酸性筋膜炎；关节炎，如强直性脊柱炎、幼年期慢性关节炎、成人still’ S病、SAPH0综合征；其它的例子为骶髂关节炎、反应性关节炎、Still’s病和痛风；血液病症，如再生障碍性贫血、原发性溶血性贫血(包括冷凝集素综合征)、CLL或系统性红斑狼疮继发的溶血性贫血；poems综合征、恶性贫血、Wa丨denstr6m’s紫癜多球蛋白血症；其它的例子为粒细胞缺乏、自身免疫性中性粒细胞减少症、Franklin’s病、Seligmann’ s病、μ链病、胸腺瘤和淋巴瘤继发的癌旁综合征和因子VIII抑制剂形成；内分泌病，如多内分泌腺病、Addison’s病；自身免疫性低血糖症、自身免疫性甲状腺功能低下、自身免疫性胰岛素综合征、de Quervain's甲状腺炎和胰岛素受体抗体介导的胰岛素耐受性；肝-胃肠道病症，如乳糜泻、惠普尔病、原发性胆汁性肝硬变、慢性活动性肝炎和原发性胆管炎；其它的例子为自身免疫性胃炎；肾病，如急性肾小球肾炎，后链球菌肾炎、Goodpasture's综合征、膜性肾小球肾炎和冷球蛋白血症；其它的例子为微小病变疾病；神经障碍，如自身免疫性神经障碍、多发性 单神经炎、Lambert-Eaton’ s肌无力综合征、Sydenham’ s舞蹈症、脊髓痨和Guillain-Barre's综合征；其它的例子为脊髓病/热带强直性下肢轻瘫、重症肌无力、急性炎性脱髓鞘性多神经病和慢性炎性脱髓鞘性多神经病；心肺病症，如成纤维性组织肺泡炎、细支气管炎obliterans、变应性曲霉病、囊性纤维化、单纯性肺嗜酸细胞浸润症、心肌炎和心包炎；其它的例子为过敏性肺炎和肺癌继发的癌旁综合征；变应性病症，如支气管哮喘和高IgE综合征；其它的例子为一时性黑蒙；眼科病症，如特发性脉络膜视网膜炎；感染性疾病，如细小病毒B感染(包括hands-and-socks综合征)；和
[0343]妇产科病症，如习惯性流产、复发性习惯性流产和子宫内生长障碍；其它的例子为妇科瘤继发的癌旁综合征；男性生殖病症，如睾丸瘤继发的癌旁综合征；和源自移植的病症，如同种异基因移植物和异种移植物排斥，和移植物对抗宿主疾病。
[0344]在一个实施方案中，所述疾病为炎症性的、免疫和/或自身免疫性的病症，选自溃疡性结肠炎，局限性回肠炎，幼年期初期糖尿病，多发性硬化症，免疫介导的血小板减少症，如急性特发性血小板减少性紫癜和慢性特发性血小板减少性紫癜,溶血性贫血(包括自体免疫性溶血性贫血)，重症肌无力，系统性硬化病和寻常性天疱疮。
[0345]在另一个实施方案中，本发明的人抗体可以用于检测CD20的水平，或在其膜表面包含CD20的细胞的水平，随后可以将所述水平与某些疾病症状联系起来。或者，可以将所述抗体用于消除表达CD20的细胞或与表达CD20的细胞相互作用，由此显示这些细胞为该疾病的重要介体。这可以通过将样品与对照样品与抗CD20抗体在允许形成抗体和CD20间复合物的条件进行接触而实现。在样品和对照样品中检测和比较抗体和CD20间形成的任何复合物。
[0346]开始可以对本发明的人抗体测试其与体外治疗性和诊断性用途相关联的结合活性。例如，可以利用在下面实施例中所述的流式细胞分析测试所述抗体。而且，可以测试抗体诱发至少一种效应物介导的效应细胞活性的活性，包括抑制和/或杀死表达⑶20的细胞。例如，可以测定抗体诱发CDC和/或凋亡的能力。测定CDC、同质型粘附、分子聚集或凋亡的方案在下面实施例中进行介绍。
[0347]本发明的人抗体在多种CD20相关疾病的治疗和诊断中还有其它的用途。例如，所述人抗体可以用于在体内或体外诱发一种或多种下列生物学活性:抑制表达CD20的细胞的生长和/或分化；杀死表达CD20的细胞；在人效应细胞存在时介导表达CD20的细胞的吞噬作用或ADCC ;在补体存在时介导表达CD20的细胞的CDC ;介导表达CD20的细胞的凋亡；诱导同质型粘附；和/或在结合CD20后诱导向脂筏的转位。
[0348]在一个特定的实施方案中，所述人抗体用于在体内或体外治疗、预防或诊断多种CD20相关疾病。CD20相关疾病的例子包括其它疾病中的B细胞淋巴瘤，例如，NHL，和免疫疾病，例如自身免疫疾病，如上所列的那些。
[0349]在一个特定的实施方案中，本发明的人抗体用于治疗或预防NHL，因为所述抗体消除载有CD20的肿瘤细胞。
[0350]非霍奇金淋巴瘤是一种B细胞淋巴瘤类型。淋巴瘤，例如，B细胞淋巴瘤，是一组当淋巴细胞(一种血细胞)变为恶性时发生的相关肿瘤。淋巴细胞的正常功能是防御身体的外侵物:细菌、病毒、真菌，甚至是肿瘤。有许多淋巴细胞的亚型和突变期，所以，有许多种类的淋巴瘤。像正常细胞一样`，恶性淋巴细胞能够移至身体的许多部分。一般，淋巴瘤细胞在淋巴系统中形成肿瘤:骨髓、淋巴结、脾和血液。但是，这些细胞可以转移到其它器官中。某些类型的淋巴瘤趋于在正常细胞生长的地方生长。例如，滤泡NHL肿瘤普遍在淋巴节中发育。
[0351]在与NHL相关联的瘤(即，致瘤的)B细胞中通常以提高的水平表达⑶20。因此，本发明的CD20结合抗体可以用于消除导致NHL的载有CD20的肿瘤细胞，因而可以用于预防或治疗这种疾病。
[0352]本发明的人抗体(例如，人单克隆抗体、多特异性和双特异性分子)还可以用于阻抑或抑制⑶20的其它效应。例如，已知⑶20表达于B淋巴细胞上并且参与这些细胞的增殖和/或分化。由于B淋巴细胞作为一种免疫调节物而起作用，所以CD20是靶向B淋巴功能的抗体介导的治疗的重要靶目标，例如，灭活或杀死参与自身免疫病症的B淋巴细胞。这类自身免疫病症包括，例如，上面所列的疾病。
[0353]体内和体外给药本发明的组合物(例如，人单克隆抗体、多特异性和双特异性分子以及免疫结合物)的合适途径是本领域所公知的并且可以为普通技术人员所选择。例如，可以通过注射(例如，静脉内或皮下)来给药所述抗体组合物。所用分子的合适剂量依赖于个体的年龄和体重以及抗体组合物的浓度和/或剂型。而且，可以确定肿瘤位置并用于计算合适的剂量。
[0354]如前所述，本发明的人抗CD20抗体可以与一种或多种其它治疗剂，例如细胞毒性剂、放射毒性剂或免疫抑制剂一起共给药。该抗体可以连接到抗原上(作为免疫复合物)或可以独立于药剂进行给药。在后一种情况中(独立给药)，可以在该药剂之前、之后或同时给药该抗体或可以与其它已知的疗法一起共给药，例如，一种如放射的抗癌疗法。这类治疗剂包括在其它治疗剂中的抗瘤剂如阿霉素、顺钼、博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥和环磷酰胺。本发明的人抗CD20与化疗剂的共给药提供两种通过不同机制起作用的抗癌剂，所述机制产生对人肿瘤细胞的细胞毒效应。这种共给药可以解决由于抗药性的发展或肿瘤抗原性的变化产生的问题，所述肿瘤抗原性的变化会使得它们与所述抗体不反应。
[0355]靶特异性效应细胞，例如，连接到本发明的组合物上的效应细胞也可以用作治疗剂。靶向的效应细胞可以是人淋巴细胞，如巨噬细胞、嗜中性细胞或单核细胞。其它的细胞包括嗜曙红细胞、天然杀伤细胞和其它载有IgG或IgA受体的细胞。如果需要，可以从要治疗的个体中获得效应细胞。靶特异性效应细胞可以作为生理上可接受的溶液中的细胞悬液进行给药。给药细胞的数目可以在108_109的数量级但是将根据治疗目的变化。通常，所述量将足以获得靶细胞，例如，表达CD20的肿瘤细胞的定位，并且通过吞噬作用影响细胞杀伤。给药的途径也可以变化。
[0356]用靶特异性效应细胞的治疗可以结合其它去除靶细胞的技术一起进行。例如，利用本发明的组合物(例如，人抗体、多特异性和双特异性分子)的和以装备这些组合物的细胞的抗肿瘤治疗可以与化疗结合使用。另外，可以使用组合治疗来将两种不同的细胞毒性效应群体定向于肿瘤细胞排斥。例如，连接到抗Fc-YRI或抗CD3的抗CD20抗体可以与IgG或IgA受体特异性结合剂结合使用。
[0357]本发明的双特异性和多特异性分子还可以用于调节效应细胞上的Fc Y R或Fc a R水平，如细胞表面上的受体加帽和消除。抗Fc受体的混合物也可以用作此目的。
[0358]在补体存在的情 况下，还可以使用具有补体结合位点的本发明组合物(例如，人抗体，多特异性和双特异性分子)，例如，来自IgG-l、2或3或IgM的结合补体的部分。在一个实施方案中，用本发明的结合制剂和合适的效应细胞对包括靶细胞的细胞群体进行的来自体内的治疗，可以通过添加补体或含有补体的血清进行补充。通过结合补体蛋白，可以改善对由本发明的结合制剂包被的靶细胞的吞噬作用。在另一个实施方案中，由本发明组合物(例如，人抗体，多特异性和双特异性分子)包被的靶细胞还可以被补体裂解。还在另一个实施方案中，本发明的组合物不激活补体。
[0359]本发明的组合物(例如，人抗体，多特异性和双特异性分子)还可以与补体一起施用。因此，包括人抗体、多特异性或双特异性分子和血清或补体的组合物属于本发明的范畴。这种组合物的优点是，所述补体紧邻所述人抗体、多特异性或双特异性分子。另外，可以分别施用本发明的人抗体、多特异性或双特异性分子以及补体或血清。本发明的靶向细胞的组合物的结合引发CD20抗原-抗体复合物转位至细胞膜的脂筏中。这种转位产生高密度的可以激活和/或增强CDC的抗原-抗体复合物。
[0360]包括本发明组合物(例如，人抗体，多特异性或双特异性分子)的试剂盒以及使用的说明书也属于本发明的范畴。该试剂盒可以进一步包括一种或多种其它制剂，如免疫抑制剂、细胞毒性剂或放射毒性剂，或一种或多种其它本发明的人抗体(例如，具有互补活性的人抗体)。
[0361]因此，用本发明的抗体组合物治疗的患者可以另外给药(在本发明的人抗体给药之前、同时或之后)另一种治疗剂，如细胞毒性剂或放射毒性剂，它增强或增大人抗体的治疗效果。
[0362]在其它的实施方案中，还可以用调节，例如，增强或抑制免疫细胞活性和/或FcY或Fca受体的表达或活性的制剂治疗所述个体，通过例如，用细胞因子治疗所述个体。在用所述多特异性分子治疗期间给药的优选细胞因子，包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素、(IFN- y )和肿瘤坏死因子(TNF)。
[0363]本发明的组合物(例如，人抗体，多特异性和双特异性分子)还可以用于靶向于表达Fc YR或CD20的细胞，例如，用于标记所述细胞。对这种用途来说，所述结合制剂可以与一种可以检测的分子连接。因此，本发明提供了用于定位来自体内的或体外的表达Fc受体，如Fc Y R或CD20的细胞的方法。例如，所述可检测的标记可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅助因子。
[0364]在一个特定的实施方案中，本发明提供在样品中检测CD20抗原的存在，或测量CD20抗原量的方法，包括将样品和对照样品与特异性结合CD20的人单克隆抗体在允许形成抗体或其部分与CD20间的复合物的条件下进行接触。随后检测复合物的形成，其中在样品与对照样品比较之间的差异复合物形成是样品中存在⑶20的表征。
[0365]在其它的实施方案中，本发明提供通过向个体给药上述的人抗体，在个体中治疗涉及表达CD20细胞的病症，例如，非霍奇金淋巴瘤或类风湿性关节炎的方法。这种抗体或其衍生物用于抑制与某些病症相关联的CD20诱导的活性，例如，增殖和/或分化。通过将抗体与CD20接触(例如，通过向个体给药抗体)，CD20诱导这种活性的能力得以抑制并且，因而，相关联的病症得到治疗。
[0366]因此，在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗或预防涉及表达CD20细胞的致瘤性病症，例如，NHL的方法。该方法包括以足以治疗或预防该病症的量向个体给药一种本发明的抗体组合物。该抗体组合物可以单独地或与另一种治疗剂一起进行给药，所述另一种治疗剂如一种细胞毒性剂或放 射毒性剂，它与所述抗体组合物结合或协同起作用来治疗或预防涉及表达CD20细胞的疾病 。在一个特别优选的实施方案中，本发明提供一种治疗非霍奇金淋巴瘤的方面。
[0367]在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗或预防涉及人表达CD20细胞的自身免疫病症，例如，那些上面所列的疾病。该方法包括以足以治疗或预防该病症的量向个体给药一种本发明的抗体组合物。该抗体组合物可以单独地或与另一种治疗剂一起进行给药，所述另一种治疗剂如一种细胞毒性剂或放射毒性剂，它与所述抗体组合物结合或协同起作用来治疗或预防涉及表达CD20细胞的疾病。
[0368]仍然在另一个实施方案中，本发明提供一种体内或体外检测表达CD20的细胞的存在或量化该细胞的方面。该方法包括(i)向个体给药一种结合到可检测标记上的本发明的组合物(例如，一种多特异性或双特异性分子)；(ii)将该个体暴露于检测所述可检测标记的工具以便鉴定包含表达CD20的细胞的区域。
[0369]还在另一个实施方案中，本发明的免疫结合物可以用于通过将所述化合物连接所述抗体上，将所述化合物(例如，治疗剂、标记、细胞毒素、放射毒素、免疫抑制剂等)靶向表面有⑶20表达的细胞上。因而，本发明还提供定位来自体内或体内的表达⑶的细胞，如Reed-Sternberg细胞(例如，用一种可检测的标记，如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅助因子)的方法。或者，所述免疫结合物可以通过将细胞毒素或放射毒素靶向CD20用于杀死表面有⑶20表达的细胞。
[0370]通过以下实施例对本发明作进一步说明，不应当将这些实施例理解成是进一步的限定。
实施例
[0371]用于实施例中的B细胞系
[0372]
【权利要求】
1.一种分离的人单克隆抗体，所述抗体结合人CD20。
2.权利要求1的抗体，所述抗体选自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、分泌型IgA、IgD 和 IgE 抗体。
3.权利要求2的抗体，其中所述抗体为IgGl抗体。
4.权利要求2的抗体，其中所述抗体为IgG3抗体。
5.权利要求2的抗体，其中所述抗体为IgG4抗体。
6.权利要求2的抗体，其中所述抗体为IgAl或IgA2抗体。
7.上述权利要求任一项的抗体，其中所述抗体以大约^^秒―1或更小的解离速率常数从人⑶20上解离下来。
8.上述权利要求任一项的抗体，其中所述抗体以大约5ηΜ或更小的亲和常数(KD)结合人 CD20。
9.上述权利要求任一项的抗体，其中所述抗体具有一种或多种选自下列的特性:(i)能够在补体存在时诱导表达CD20的细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)；(?)能够在补体存在时诱导表达CD20的细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)和高水平的 CD55 和 / 或 CD59 ；(iii)能够诱导表达⑶20的细胞的凋亡；(iv)能够在效应细胞 存在时诱导表达CD20的细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)；(v)能够诱导表达CD20的细胞的同型粘着；(vi)能够在结合CD20后转位至脂筏中；(vii)能够延长患表达CD20的肿瘤细胞的个体的存活；(viii)能够消除表达⑶20的细胞；和(ix)能够消除表达低水平的⑶20的细胞(⑶20^细胞)。
10.权利要求9的抗体，其中所述抗体具有一种或多种选自下列的特性:(i)能够在33vol/vol%血浆存在时在3小时内于37°C以10μg/ml的抗体浓度诱导至少20%，优选至少30%的⑶C介导的B-CLL细胞的裂解；(ii)能够在33vol/vol%全血细胞存在时在3小时内于37°C以10μ g/ml的抗体浓度诱导至少20%，优选至少30%的B-CLL细胞的裂解；(iii)能够以20μ g的剂量延长用Daudi细胞注射的SCID小鼠的50%存活率超过30% ;和(iv)能够于6.25mg/kg每天的剂量连续给药4天，在食蟹猴中消除表达低水平的⑶20的外周B细胞(⑶20"? B细胞)至不能检测到的水平持续超过50天。
11.权利要求10的抗体，所述抗体能够在33V01/V01%血浆存在时在3小时内于37°C以10 μ g/ml的抗⑶20抗体浓度诱导至少20%，优选至少30%的⑶C介导的B-CLL细胞的裂解.
12.由人重链和人κ轻链核酸所编码的上述权利要求1-11任一项的抗体，所述人重链和人κ轻链核酸在其可变区分别包含如SEQ ID N0:1和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，及其保守性序列修饰物。
13.由人重链和人κ轻链核酸所编码的上述权利要求1-11任一项的抗体，所述人重链和人κ轻链核酸在其可变区分别包含如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，及其保守性序列修饰物。
14.由人重链和人κ轻链核酸所编码的上述权利要求1-11任一项的抗体，所述人重链和人κ轻链核酸在其可变区分别包含如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，及其保守性序列修饰物。
15.具有人重链和人κ轻链可变区的上述权利要求1-11任一项的抗体，所述人重链和人κ轻链可变区分别包含如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，及其保守性序列修饰物。
16.具有人重链和人κ轻链可变区的上述权利要求1-11任一项的抗体，所述人重链和人κ轻链可变区分别与如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列至少90%同源，优选至少95%同源,更加优选至少98%或至少99%同源。
17.具有人重链和人κ轻链可变区的上述权利要求1-11任一项的抗体，所述人重链和人κ轻链可变区分别包含如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，及其保守性序列修饰物。
18.具有人重链和人κ轻链可变区的上述权利要求1-11任一项的抗体，所述人重链和人κ轻链可变区分别与如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少90%同源，优选至少95%同源,更加优选至少98%或至少99%同源。
19.具有人重链和人κ轻链可变区的上述权利要求1-11任一项的抗体，所述人重链和人κ轻链可变区分别包含如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，及其保守性序列修饰物。
20.具有人重链和人κ轻链可变区的上述权利要求1-11任一项的抗体，所述人重链和人κ轻链可变区分别与如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列至少90%同源，优选至少95%同源,更加优选`至少98%或至少99%同源。
21.上述权利要求1-11任一项的抗体,所述抗体包含至少一种选自:(i)SEQ ID NOs:2、4、6、8、10 或 12 ;和(?) 一种与上面(i)中所示氨基酸序列的任一项至少90%同源，优选至少95%同源，更加优选至少98%或至少99%同源的序列的人可变区。
22.—种分离的人单克隆抗体，所述抗体结合人CD20上的抗原表位，所述抗原表位由权利要求12-21任一项的抗体所定义。
23.一种分离的人单克隆抗体，所述抗体结合CD20上的抗原表位，所述抗原表位(i)不包含或不需要位置172上的氨基酸残基脯氨酸；(?)不包含或不需要位置170上的氨基酸残基丙氨酸或位置172上的脯氨酸；(iii)不包含或不需要位置163上的氨基酸残基天冬酰胺或位置166上的天冬酰胺；(iv)不包含或不需要位置172上的氨基酸残基脯氨酸，但包含或需要位置163上的氨基酸残基天冬酰胺或位置166上的天冬酰胺；或(v)不包含或不需要位置170上的氨基酸残基丙氨酸或位置172上的脯氨酸，但包含或需要位置163上的氨基酸残基天冬酰胺或位置166上的天冬酰胺。
24.一种结合CD20的分离的人单克隆抗体，其中该抗体具有一种或多种下列特性:(i)以至少与结合人⑶20相同的亲和力结合突变体P172S⑶20 (位置172上的脯氨酸突变为丝氨酸)；(?)以至少与结合人CD20相同的亲和力结合突变体AxP (位置170上的丙氨酸突变为丝氨酸，并且位置172上的脯氨酸突变为丝氨酸)；(iii)与人⑶20相比于10μ g/ml的抗体浓度显示减弱50 %或更多的结合突变体N166D (位置166上的天冬酰胺突变为天冬氨酸)；或(iv)与人⑶20相比于10μ g/ml的抗体浓度显示减弱50%或更多的结合突变体N163D (位置163上的天冬酰胺突变为天冬氨酸)。
25.一种分离的人单克隆抗体，所述抗体结合人CD20的小的第一胞外环上的抗原表位。
26.一种分离的人单克隆抗体，所述抗体结合CD20上的不连续抗原表位。
27.一种分离的人单克隆抗体，所述抗体结合CD20上的不连续抗原表位，其中该抗原表位包含第一小胞外环的部分和第二胞外环的部分。
28.一种分离的人单克隆抗体，所述抗体结合CD20上的不连续抗原表位，其中该抗原表位具有小的第一胞外环的残基AGIYAP和第二胞外环的残基MESLNFIRAHTPYI。
29.—种分离的人单克隆抗体，所述抗体具有权利要求11-28任一项的抗体的结合特性。
30.一种分离的人单克隆抗体，所述抗体结合包含至少一种选自: (i)SEQID NOs: 13、14、15、16、17 或 18 ；(ii)(i)中所列序列的保守性序列修饰物；和(iii)保留结合人CD20能力的在(i)或(ii)中定义的任一种序列的片段的CDR序列的人⑶20。
31.权利要求30的抗体，所述抗体包含SEQID NO:15。
32.权利要求30的抗体，所述抗体包含选自:(i)SEQID NOs: 13、14、15、16、17 或 18 ；(ii)(i)中所列序列的保守性序列修饰物；和(iii)保留结合人CD20能力的在⑴或(ii)中定义的任一种序列的片段的至少四种CDR序列。
33.权利要求30的抗体，所述抗体包含SEQID NO:13、14、15、16、17和18。
34.—种分离的人单克隆抗体，所述抗体结合包含至少一种选自:(i)SEQID NOs:19、20、21、22、23 或 24 ；(ii)(i)中所列序列的保守性序列修饰物；和(iii)保留结合人CD20能力的在(i)或(ii)中定义的任一种序列的片段的CDR序列的人⑶20。
35.权利要求34的抗体，所述抗体包含选自:(i)SEQID NOs:19、20、21、22、23 或 24 ；(ii)(i)中所列序列的保守性序列修饰物；和(iii)保留结合人CD20能力的在(i)或(ii)中定义的任一种序列的片段的至少四种CDR序列。
36.权利要求34的抗体，所述抗体包含SEQID NOs:19、20、21、22、23和24。
37.一种分离的人单克隆抗体，所述抗体结合包含至少一种选自:(i)SEQID NOs:25、26、27、28、29 或 30 ;(ii)(i)中所列序列的保守性序列修饰物；和(iii)保留结合人CD20能力的在(i)或(ii)中定义的任一种序列的片段的CDR序列的人⑶20。
38.权利要求37的抗体，所述抗体包含SEQID NO:27。
39.权利要求37的抗体，所述抗体包含选自:(i)SEQID NOs:25、26、27、28、29 或 30 ;(ii)(i)中所列序列的保守性序列修饰物；和(iii)保留结合人CD20能力的在(i)或(ii)中定义的任一种序列的片段的至少四种CDR序列。
40.权利要求39的抗体，所述抗体包含SEQID NOs:25、26、27、28、29和30。
41.上述权利要求1-11任一项的抗体，所述抗体包含选自:(i)SEQID NOs: 13、19或25，或具有SEQ ID NOs: 13、19或25序列的1个氨基酸取代、缺失或添加的序列；(ii)SEQID NOs:14、20 或 26，或具有 SEQ ID NOs: 14、20 或 26 序列的 1_4 个氨基酸取代、缺失或添加的序列；(iii)SEQID NOs:15或27，或具有SEQ ID NOs: 15或27序列的1-4个氨基酸取代、缺失或添加的序列；(iv)SEQ ID N0:16，或具有SEQ ID NOs:16序列的1_2个氨基酸取代、缺失或添加的序列；(v)SEQ ID N0:17，或具有SEQ ID NOs:17序列的1_2个氨基酸取代、缺失或添加的序列；(vi)SEQID NOs:18或30，或具有SEQ ID NOs:18或30序列的1_2个氨基酸取代、缺失或添加的序列的至少一种⑶R。
42.权利要求41的抗体，所述抗体包含选自:(i)SEQID NOs: 13、19或25，或具有SEQ ID NOs: 13、19或25序列的1个氨基酸取代、缺失或添加的序列；(ii)SEQID NOs:14、20 或 26，或具有 SEQ ID NOs: 14、20 或 26 序列的 1_4 个氨基酸取代、缺失或添加的序列；(iii)SEQID NOs:15或27，或具有SEQ ID NOs: 15或27序列的1-4个氨基酸取代、缺失或添加的序列；(iv)SEQ ID N0:16，或具有SEQ ID NOs:16序列的1_2个氨基酸取代、缺失或添加的序列；(v)SEQ ID N0:17，或具有SEQ ID NOs:17序列的1_2个氨基酸取代、缺失或添加的序列；(vi)SEQID NOs:18或30，或具有SEQ ID NOs:18或30序列的1_2个氨基酸取代、缺失或添加的序列的至少四种⑶R。
43.权利要求41的抗体， 所述抗体包含一种选自SEQ ID NOs:15或27，或具有SEQ ID NOs:15或27序列的1_4个氨基酸取代、缺失或添加的序列。
44.上述权利要求任一项的抗体，该抗体为选自:完整的IgGl抗体、完整的IgG2抗体、完整的IgG3抗体、完整的IgG4抗体、完整的IgM抗体、完整的IgAl抗体、完整的IgA2抗体、完整的分泌型IgA抗体、完整的IgD抗体和完整的IgE抗体的完整抗体，其中所述抗体在真核细胞中进行糖基化。
45.上述权利要求任一项的抗体，所述抗体是一个抗体片段或单链抗体。
46.上述权利要求任一项的抗体，所述抗体是一种结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，包含(i)以融合到免疫球蛋白铰链区多肽上的如权利要求24中所定义的重链可变区或轻链可变区形式存在的结合结构域多肽，(ii)融合到铰链区上的免疫球蛋白重链CH2恒定区，和(iii)融合到CH2恒定区上的免疫球蛋白重链CH3恒定区。
47.上述权利要求任一项的抗体，所述抗体由包括获自转基因非人动物并且与永生化细胞融合的B细胞的杂交瘤产生，在所述非人动物中V-(D)-J基因片段重排导致功能性人重链转基因和功能性人轻链转基因的形成。
48.一种杂交瘤，所述杂交瘤包含与永生化细胞融合的获自转基因非人动物的B细胞，其中所述杂交瘤产生上述权利要求任一项的可检测量的单克隆抗体，在所述非人动物中V-(D)_J基因片段重排导致功能性人重链转基因和功能性人轻链转基因的形成。
49.一种杂交瘤，所述杂交瘤产生由人IgG重链和人κ轻链核酸编码的人单克隆抗体，所述人IgG重链和人κ轻链核酸在其可变区分别包含如SEQ ID NO:1、5或9和SEQ IDNO:3,7或11所示的核苷酸序列，及其保守性序列修饰物。
50.一种杂交瘤，所述杂交瘤产生具有IgG重链和κ轻链可变区的人单克隆抗体，所述IgG重链和κ轻链可变区分别包含如SEQ ID NO:2、6或10和SEQ ID NO:4、8或12所示的氨基酸序列，及其保守性序 列修饰物。
51.由转染瘤产生的权利要求1-45任一项的抗体，所述转染瘤包含编码人重链和人轻链的核酸。
52.一种包含编码人重链和人轻链的核酸的转染瘤，其中该转染瘤产生可检测量的权利要求1-45任一项的抗体。
53.一种转染瘤，它产生由人IgG重链和人κ轻链核酸编码的人单克隆抗体，所述人IgG重链和人κ轻链核酸在其可变区分别包含如SEQ ID N0:l、5或9和SEQ ID NO:3、7或11所示的核苷酸序列，及其保守性序列修饰物。
54.一种转染瘤，它产生具有IgG重链和κ轻链可变区的人单克隆抗体，所述IgG重链和κ轻链可变区分别包含如SEQ ID NO:2,6或10和SEQ ID NO:4、8或12所示的氨基酸序列，及其保守性序列修饰物。
55.一种真核或原核宿主细胞，它产生具有重链和轻链可变区的人单克隆抗体，所述重链和轻链可变区分别包含如SEQ ID NO:2、6或10和SEQ ID NO:4、8或12所示的氨基酸序列，及其保守性序列修饰物。
56.一种转基因非人动物或植物，它产生具有重链和轻链可变区的人单克隆抗体，所述重链和轻链可变区分别包含如SEQ ID NO:2、6或10和SEQ ID NO:4、8或12所示的氨基酸序列，及其保守性序列修饰物。
57.—种生产结合人⑶20的人单克隆抗体的方法，包括:用人CD20或表达人CD20的细胞免疫一种转基因非人动物，所述转基因非人动物具有包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组，从而通过所述动物的B细胞来生产抗体；分离所述动物的B细胞；将所述B细胞与骨髓瘤细胞融合以形成永生的杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞分泌对人CD20特异性的人单克隆抗体；和从杂交瘤培养物上清液或源自这种杂交瘤的转染瘤中分离对CD20特异性的人单克隆抗体。
58.一种根据权利要求57的方法，其中用已经以人CD20转染过的细胞进行免疫。
59.—种分离的结合人CD20的人单克隆抗体，所述抗体是通过如下方法获得的:用人CD20或表达人CD20的细胞免疫一种转基因非人动物，所述转基因非人动物具有包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组，从而通过所述动物的B细胞来生产抗体；分离所述动物的B细胞；将所述B细胞与骨髓瘤细胞融合以形成永生的杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞分泌对人CD20特异性的人单克隆抗体；和 从杂交瘤培养物上清液或源自这种杂交瘤的转染瘤中分离对CD20特异性的人单克隆抗体。
60.一种分离的人抗体，所述抗体包含源自AVH3-13/DP-44种系序列(SEQ ID NO:54)的重链可变区氨基酸序列和源自人L6/JK4-CK(SEQ ID NO:55)种系序列的轻链可变区氨基酸序列，其中人抗体结合人CD20。
61.一种分离的人抗体,所述抗体包含源自人VH3-09/JH6b种系序列(SEQ ID NO:56)的重链可变区氨基酸序列和源自人'-L6/JK5种系序列(SEQ ID NO:57)的轻链可变区氨基酸序列，其中人抗体结合人CD20。
62.一种组合物，所述组合物包含权利要求1-45任一项的人抗体和可药用的载体。
63.一种组合物，所述组合物包含两种或多种根据权利要求1-45任一项的人抗体的组合，所述抗体具有互补的功能活性。
64.一种根据权利要求61的组合物，所述组合物包含根据权利要求15的第一抗体和根据权利要求19的第二抗体。
65.根据权利要求63-64任一项的组合物，所述组合物还包含治疗剂。
66.根据权利要求1-45任一项的抗体，所述抗体还包含螯合剂连接物以附着放射性同位素。
67.—种免疫结合物，它包含连接细胞毒性剂、放射性同位素或药物的根据权利要求1-45任一项的抗体。
68.一种双特异性分子，它包含根据权利要求1-45任一项的抗体和对于人效应细胞的结合特异性。
69.一种双特异性分子，它包含根据权利要求1-45任一项的抗体和对于人Fc受体的结合特异性或对于T细胞受体，如CD3的结合特异性。
70.一种抑制表达CD20的细胞的生长的方法，包括将所述细胞与有效量的根据权利要求1-45任一项的抗体相接触，从而抑制所述细胞的生长。
71.—种杀伤表达CD20的细胞的方法，包括将所述细胞与根据权利要求1-45任一项的抗体相接触，从而杀伤表达⑶20的细胞。
72.权利要求70或71任一项的方法，其中所述细胞为B淋巴细胞或肿瘤细胞。
73.一种治疗或预防涉及表达CD20细胞的疾病或病症的方法，包括以对于治疗或预防疾病有效的量向个体给药根据权利要求1-45或60-69任一项的人抗体、组合物、免疫结合物或双特异性分子，根据权利要求94-97任一项的表达载体。
74.权利要求73的方法，其中所述疾病为B细胞淋巴瘤。
75.权利要求73的方法，其中所述疾病为B细胞非霍奇金淋巴瘤。
76.权利要求73的方法，其中所述疾病选自前体B细胞成淋巴细胞白血病/淋巴瘤和成熟B细胞瘤，如B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、B细胞原淋巴细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡淋巴瘤(FL)、皮肤毛囊中心淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MALT型、结节和脾型)、毛细胞白血病、扩散大B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、浆细胞瘤、浆细胞骨髓瘤、移植后淋巴增生性疾病、Waldenstrom巨球蛋白血症和退行发育性大细胞淋巴瘤(ALCL)。
77.权利要求76的方法，其中所述疾病为滤泡淋巴瘤(FL)。
78.权利要求76的方法，其中所述疾病为B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)。
79.权利要求73的方法，其中所述疾病选自淋巴瘤样肉芽肿病、原发性外渗淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、纵隔大B细胞淋巴瘤、重链疾病(包括Υ、μ和α疾病)、用免疫抑制剂进行治疗所诱发的淋巴瘤，如环孢霉素诱发的淋巴瘤和氨甲蝶呤诱发的淋巴瘤。
80.一种治疗或预防涉及表达CD20的免疫细胞`的免疫疾病的方法，包括以对于治疗或预防所述免疫疾病有效的量向个体给药根据权利要求1-45或60-67任一项的人抗体、组合物、免疫结合物或双特异性分子或根据权利要求94-97任一项的表达载体。
81.权利要求80的方法，其中治疗包括杀伤产生抗自身抗原的抗体的Β细胞。
82.权利要求73的方法，其中所述疾病或病症选自牛皮癣、牛皮癣性关节炎、皮炎、系统性硬皮病和硬化、炎症性肠疾病(IBD)、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、呼吸窘迫综合征、脑膜炎、脑炎、色素层炎、肾小球肾炎、湿疹、哮喘、动脉粥样硬化、白细胞粘连缺乏、多发性硬化症、Raynaud综合征、Sjfigl’en综合征、青少年起病型糖尿病、Reiter病、Behcet病、免疫复合性肾炎、IgA肾病、IgM多发性神经病、免疫介导的血小板减少症，如急性特发性血小板减少性紫癜和慢性特发性血小板减少性紫癜，溶血性贫血、重症肌无力、狼疮性肾炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎(RA)、特应性皮炎、天疱疮、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、Wegener肉芽肿病、Omenn氏综合征、慢性肾功能衰竭、急性传染性单核细胞增多症、HIV和疱疫病毒相关疾病。
83.权利要求82的方法，其中所述自身免疫疾病为类风湿性关节炎(RA)。
84.权利要求73的方法，其中所述疾病为选自溃疡性结肠炎、局限性回肠炎、青少年起病型糖尿病、多发性硬化症、免疫介导的血小板减少症，如如急性特发性血小板减少性紫癜和慢性特发性血小板减少性紫癜，溶血性贫血、重症肌无力、系统性硬化病和寻常性天疱疮的炎症性、免疫和/或自身免疫病症。
85.权利要求73的方法，其中所述疾病为选自炎症性肠疾病(IBD)、溃疡性结肠炎、局限性回肠炎、和多发性硬化症的炎症性、免疫和/或自身免疫病症。
86.权利要求70-85任一项的方法，进一步包括单独向个体给药另一种治疗剂。
87.权利要求86的方法，其中所述治疗剂为细胞毒性剂或放射毒性剂。
88.权利要求86的方法，其中所述治疗剂为免疫抑制剂。
89.权利要求86的方法，其中所述治疗剂为免疫调节剂，如细胞因子或趋化因子。
90.权利要求86的方法，其中所述治疗剂选自阿霉素、顺钼、博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥和环磷酰胺。
91.权利要求86的方法，其中所述治疗剂选自抗CD25抗体、抗CD19抗体、抗CD21抗体、抗CD22抗体、抗CD37抗体、抗CD38抗体、抗IL6R抗体、抗IL8抗体、抗IL15抗体、抗IL15R抗体、抗CD4抗体、抗CDlla抗体、抗α-4/β-Ι整联蛋白(VLA4)抗体、CTLA4_Ig和抗C3b(i)抗体。
92.一种检测样品中⑶20抗原或表达⑶20的细胞存在的体外方法，包括:在允许形成抗体和CD20之间复合物的条件下将样品与权利要求1-45任一项的抗体相接触；和检测复合物的形成。
93.一种检测个体中CD20抗原或表达CD20的细胞存在的试剂盒，其包含权利要求1-45任一项的抗体。
94.一种检测⑶20抗原或表达⑶20的细胞的体内方法，包括:在允许形成抗体和CD20之间复合物的条件下给药权利要求1-45任一项的抗体；和检测形成的复合物。
95.一种表达载体，所述表达载体包含编码结合CD20的人抗体的轻链、重链、或轻链和重链可变区的核苷酸序列。
96.权利要求95的载体，所述表达载体还包含编码结合CD20的人抗体的轻链、重链、或轻链和重链恒定区的核苷酸序列。
97.—种表达载体，所述表达载体包含编码含有选自SEQ ID Nos:1、5和9所不核苷酸序列的核苷酸的重链可变区，和含有选自SEQ ID Nos:3、7和11所示核苷酸序列的核苷酸序列的轻链可变区的核苷酸序列，及其保守性修饰物。
98.一种表达载体，所述表达载体包含编码含有选自SEQ ID Nos:2、6和10所示氨基酸序列的氨基酸序列的重链可变区，和含有选自SEQ ID Nos:4、8和12所示氨基酸序列的氨基酸序列的轻链可变区的核苷酸序列，及其保守性修饰物。
99.一种药物组合物，所述组合物包含权利要求95-98任一项的表达载体和可药用的载体。
100.—种结合权利要求1-45任一项的抗体的抗独特型抗体。
101.一种结合2F2U1B8或7D8的抗独特型抗体。
102.权利要求100或101的抗独特型抗体在检测样品中抗CD20人单克隆抗体的水平中的应用。
【文档编号】C12N5/24GK103709250SQ201310412401
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2003年10月17日 优先权日:2002年10月17日
【发明者】J.特伊龄, S.鲁尔斯, M.格兰尼, J.G.J.范德温克尔, P.帕仁, J.比得森, O.D.M.S.巴德斯伽德, H.黄 申请人:根马布股份公司