检测雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列的引物、方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了检测雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列的引物及检测方法和试剂盒，所述引物的序列为：CAF：CCTTCAAGATAACCACCGAA；CAR：GGTCAGGAGTTCGAGACAAG。采用本发明的引物序列对待检样本中的ERβ基因进行扩增，并结合Sanger测序技术，能对人类雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列多态性进行检测，特异性好，准确度高，扩增和测序的稳定性好。
【专利说明】检测雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列的引物、方法和试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属生命科学和生物【技术领域】，特别是检测雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列的引物和方法，采用Sanger测序法技术，能对人类雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列多态性进行检测，特异性好，准确度高。
【背景技术】
[0002]年轻女性月经过少，是一种妇科常见症状。其危害是影响孕卵在子宫内膜种植，导致反复流产、不孕等，是闭经的前期症状。雌激素是调节月经的主要激素，作用体现在:一方面促进子宫内膜血管的周期性重建；另一方面促进子宫内膜的增生修复。雌激素是月经调节的主要激素，其通过与雌激素受体作用。但临床上发现一类月经过少患者其雌激素水平正常，无内外科和先天性疾病，这种疾病被称为原因不明月经过少。同时，对大量原因不明月经过少患者进行宫腔镜检查发现，许多月经过少患者的子宫内膜光滑且薄，表现为生长发育不良，与传统的子宫内膜损伤、疤痕学说并不吻合。由于此类患者雌激素水平正常，所以已有研究人员推测是否是雌激素受体环节出现障碍？前期实验已证实原因不明月经过少患者其雌激素受体(estrogen receptor, ER)表达减弱,这可能是雌激素受体β基因(estrogen receptor β，ERP )发生改变而导致ER减少。
[0003]人ER是配体依赖转录活性因子超家族(类固醇激素、甲状腺激素、维生素D3、维甲酸等受体)成员之一，定位于胞浆或胞核内，具有转录因子的作用，与雌激素结合后即形成二聚体，通过与靶基因中的雌激素反应元件特异性结合，刺激靶基因转录，从而促进细胞增殖和分化。它包括ERa (estrogen receptor a )和ER β,其中ERP基因位于14号染色体。在ERP基因第5内含子中，存在C (cytosine)和A (adenine)重复序列多态性。ER3参与了雌激素对月经周期中子宫内膜的生理调节作用。鉴于在原因不明月经过少者体内雌激素水平正常，以及前期研究结果显示与月经量正常妇女相比，此类人群ERβ基因表达下降，研究人员据此推测可能ERi3减少，使雌激素对子宫内膜调节作用下降，从而引起月经量的下降。所以目前许多研究试图从ERP基因多态性角度去探讨原因不明月经过少的发病机制，例如研究ERi3基因第5内含子中CA重复次数与原因不明月经少之间的相关性。
`[0004]在临床实验室中，目前检测雌激素受体β基因CA重复序列的常用方法有Sanger测序法及焦磷酸测序法，其中Sanger测序法以自动化、方法简便、分辨率高、测序片段长等优点，成为分子生物学和分子诊断的重要技术平台，并广泛应用于遗传病和肿瘤等方面的检测和诊断。但是由于ERi3基因第5内含子中存在CA重复序列。利用现有的引物和方法对这类长重复序列扩增和测序时常常会不稳定，容易发生测序中断等情况。这种测序中断现象的发生会直接影响到检测结果。另一方面据现有文献报导目前的检测下限是只能检测出0.001 μ g的ER β基因DNA中的CA重复序列，在低一点DNA模板量时就检测不到CA重复了，这样的检测下限还是不能满足科学研究的要求。
[0005]因此为了让不明月经过少的发病机制研究的数据更准确，就需要对ERP基因多态性有非常准确的检测方法以获得有价值的科研参考数据。科研工作者只有依据准确的检测数据，才可以去判断不明月经过少患者其雌激素受体表达减弱，是否与雌激素受体β基因发生改变而导致ER减少有关。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供了一种检测雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列的引物，所述引物的序列为:
[0007]CAF: CCTTCAAGATAACCACCGAA
[0008]CAR:GGTCAGGAGTTCGAGACAAG。
[0009]本发明还包括测序引物，所述测序引物为:
[0010]CAF: CCTTCAAGATAACCACCGAA[0011 ] CAR:GGTCAGGAGTTCGAGACAAG。
[0012]本发明还提供了检测雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列的方法包括以下步骤:
[0013](I)取全血样本，加入红细胞裂解液，裂解红细胞；
[0014](2)加入核酸提取液，提取核酸；
[0015](3)加入PCR扩增反应液进行DNA扩增；PCR扩增的引物序列为:`[0016]CAF: CCTTCAAGATAACCACCGAA
[0017]CAR:GGTCAGGAGTTCGAGACAAG ；
[0018](4)取PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，检测是否扩增成功，选取有目的条带的PCR扩增产物进行酶纯化反应；
[0019](5)采用Sanger测序法对酶纯化产物进行测序，检测出被检样本中雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列的重复次数。
[0020]在一个实施例中，在对PCR扩增产物进行酶纯化反应时，分别用无水乙醇和75%乙醇洗脱。
[0021]所述扩增反应条件为:95°C 5分钟；98°C 10秒、56°C 20秒、68°C 30秒，40个循环；68 0C 2分钟。
[0022]所述步骤4的酶纯化反应为:取扩增好的PCR产物加入酶纯化液中，反应条件为:37 0C 50 分钟，95°C 5 分钟。
[0023]所述步骤5测序反应条件为:95°C 4分钟，95°C 15秒；50°C 20秒；60°C 2分钟，25个循环。
[0024]所述Sanger测序的引物序列为:
[0025]CAF: CCTTCAAGATAACCACCGAA
[0026]CAR:GGTCAGGAGTTCGAGACAAG。
[0027]本发明还提供用于检测雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列的试剂盒，包括核酸提取试剂、PCR扩增试剂、酶纯化试剂、测序反应试剂，用于扩增样本DNA的引物的序列为:
[0028]CAF: CCTTCAAGATAACCACCGAA
[0029]CAR:GGTCAGGAGTTCGAGACAAG。[0030]其中还包括测序引物为:
[0031 ] CAF: CCTTCAAGATAACCACCGAA
[0032]CAR: GGTCAGGAGTTCGAGACAAG?
[0033] 本发明将测序技术应用于雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列的检测，并开发出一种新型的雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列的引物对。
[0034]本发明的有益效果:本发明所使用的扩增引物和测序引物，以及采用的Sanger测序技术可以能在仅含0.0001 μ g的ERP基因DNA样本中测出CA重复序列，因此本发明的特异性非常好，能满足科学研究的要求。而且利用本发明的引物可以稳定地扩增出具有较长重复序列的基因，因此对雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列多态性检测的准确性高。本发明超低的检测灵敏度和稳定的扩增和测序体系可以为不明月经过少的发病机制研究提供更准确的数据，科研工作者只有依据准确的检测数据，去判断和分析不明月经过少患者其雌激素受体表达减弱是否与雌激素受体β基因发生改变而导致ER减少有关。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1所示为样品测序图。
[0036]图2所示为样品目的片段电泳图。
【具体实施方式】
[0037]实施例1检测雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列的试剂盒
[0038](i)核酸提取试剂:天根公司提供的核酸提取试剂。
[0039](ii)PCR 扩增试剂:PCR Buffer, dNTP，Taq 酶，上游引物(CAF)，下游引物(CAR),纯水，其中:
[0040]CAF: CCTTCAAGATAACCACCGAA
[0041]CAR: GGTCAGGAGTTCGAGACAAG
[0042](iii)酶纯化试剂:ΕΧ0Ι (核酸外切酶)，CIP(碱性磷酸酶)。
[0043](iv)测序反应试剂:Bigdye Terminator V3.1(购买自ABI公司),上游引物(CAF),下游引物(CAR),无水乙醇,75% 乙醇，EDTA, HiDi (highly deionized-formamide)。
[0044]实施例2检测雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列的方法。
[0045](I)核酸提取:取500ul全血，放入到1.5ml的离心管中，加入Iml红细胞裂解液。上下翻转，使完全混匀，旋转振动15秒后放入离心机中离心，离心速率为5000rpm，10分钟。倒掉上层液，可见离心管底部有血色沉淀。加入500 μ I红细胞裂解液，重复此裂解步骤一次。离心5000rpm，5分钟，最后用移液管吸净所有上层液并弃去，以使离心管底部的血色沉淀不再残留有裂解液，在沉淀里加入60 μ I核酸提取液(取之前反复吹打)，用枪头混匀，金属浴100°C 10分钟，12000rpm，5分钟，取上清_20°C保存待用。
[0046](2) PCR 扩增:PCR 扩增体系:5 氺 PCR Buffer4 μ 1，dNTP I μ 1，Taq 酶 I μ 1，上游引物1μ 1，下游引物1μ 1，纯水10μ I ;加2μ I (I)中提取的核酸到18 μ IPCR扩增体系中，总体积为20 μ I。反应条件为95°C 5分钟，98°C 10秒；56°C 20秒；68°C 30秒，40个循环，68度。C 2分钟。上游引物(CA F)、下游引物(CA R)序列如下所示:
[0047]CAF: CCTTCAAGATAACCACCGAA[0048]CAR: GGTCAGGAGTTCGAGACAAG
[0049](3)电泳:取PCR扩增产物3μ I进行琼脂糖电泳，检测是否扩增成功；若扩增成功，则选择清晰较亮的目的条带，进行酶纯化反应。
[0050](4)酶纯化:试剂:EXOI(核酸外切酶)，CIP(碱性磷酸酶)，酶纯化体系为:ΕΧ0Ι0.5μ 1,CIP0.1μ 1，水1.4μ I。取9μ I的(2)中的PCR扩增产物，加入到2μ I反应体系中，反应条件:37°C 50分钟，95°C 5分钟。
[0051](5)测序反应
[0052]试剂:BigdyeTerminator V3.1 (购买自 ABI 公司)
[0053]每个样本取0.2ml PCR反应管2个，对两管PCR反应管分别标记(双向测序)，一管加入I μ I Bigdye Terminator, I μ I水,步骤(4)中的酶纯化产物2 μ I,及上游引物(CA F)I μ I。另一管加入I μ I Bigdye Terminator, I μ I水,步骤(4)中酶纯化产物2 μ I,及下游引物(CA R) I μ I。每管共5 μ I体系。测序反应条件为95°C 4分钟；95°C 15秒、50°C 20秒、60°C 2分钟，25个循环。
[0054](6)酒精纯化
[0055]试剂:无水乙醇，75%乙醇，EDTA。
[0056]测序反应结束，打开管盖，每管先加入2 μ I EDTA,静置5分钟，终止测序反应，随后加入15 μ I无水乙醇洗脱，13500 rpm离心30分钟，离心结束后倒去液体，并甩干，加入50 μ I 75%乙醇洗脱，13500 rpm离心15分钟，离心结束后倒去液体，甩干，为了避免剩余酒精对后续实验的影响，需烘干`。
[0057](7)上机
[0058]测序仪:ABI3100 Genetic Analyzer (购买自 ABI 公司)
[0059]在烘干的离心管中加入10 μ I HiDi (highly deionized-formamide),振荡混匀，离心收集，将液体全部转移至96孔板进行上机测序。
[0060]实施例3利用本发明对样本进行测序分析
[0061]样品1:经过焦磷酸测序法确定雌激素受体β基因第5内含子CA重复次数为20次的样本。
[0062]利用本发明实施例2所述的引物和方法对样本I进行检测，结果如图1所示。从图1显示利用本发明的引物和方法所测得的CA重复次数为20次。这个结果与焦磷酸测序的结果一致。另外反向测序结果中TG重复次数也为20次，DNA双链的碱基是互补的，这就进一步证明了本发明所述的引物和方法测定结果是准确的，能稳定地扩增出这类长的CA重复序列，并且本发明的测序引物也可稳定地对这类长重复序列进行测序，不会发生测序中断的情况。因此本发明所采用的扩增和测序体系是稳定和有效的。
[0063]实施例4特异性和灵敏度实验
[0064]取五份实施例3所述的核酸提取样本各I μ g，分别按10倍稀释(即含有ER3基因DNA样本量为0.1μ g)、102倍稀释(即含有ERP基因DNA样本量为0.01 μ g)、IO3倍稀释(即含有ER β基因DNA样本量为0.001 μ g)、IO4倍稀释(即含有ER β基因DNA样本量为
0.0001 μ g)。并利用本发明实施例2所述的引物和方法对这4份稀释的样本和1份未稀释的样本进行检测，结果如图2所示(经PCR扩增后的琼脂糖电泳图)。即使对样本进行IO4稀释，其电泳结果条带依然非常单一清晰，因此本发明所述引物的特异性和灵敏度都较现有技术中的引物好，完全可以检测低浓度的ERP基因DNA样本中的CA重复序列。本发明的检测引物和方法能很好的满足科学研究的要求，使不明月经过少的发病机制研究的检测数据更准确。
[0065]实施例5
[0066]利用经过焦磷酸测序法确定雌激素受体β基因第5内含子CA重复次数的186例样本来验证本发明引物扩增和Sanger测序的准确性和稳定性。利用实施例2的方法对上述186例样品进行分析，结果如表1所示。
[0067]表1
[0068]
【权利要求】
1.检测雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列的引物，其特征在于:所述引物的序列为:
CAF:CCTTCAAGATAACCACCGAA
CAR:GGTCAGGAGTTCGAGACAAG?
2.如权利要求1所述的引物，其特征还在于，还包括测序引物，所述测序引物为:
CAF:CCTTCAAGATAACCACCGAA
CAR:GGTCAGGAGTTCGAGACAAG。
3.检测雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)取全血样本，加入红细胞裂解液，裂解红细胞； (2)加入核酸提取液，提取核酸； (3)加入PCR扩增反应液进行DNA扩增；PCR扩增的引物序列为:
CAF:CCTTCAAGATAA CCACCGAA
CAR:GGTCAGGAGTTCGAGACAAG ； (4)取PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，检测是否扩增成功，选取有目的条带的PCR扩增产物进行酶纯化反应； (5)采用Sanger测序法对酶纯化产物进行测序，检测出被检样本中雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列的重复次数。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在对PCR扩增产物进行酶纯化反应时，分别用无水乙醇和75%乙醇洗脱。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3的扩增反应条件为:95°C5分钟；98 0C 10 秒、56 °C 20 秒、68 °C 30 秒，40 个循环；68 °C 2 分钟。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤4的酶纯化反应为:取扩增好的PCR产物加入酶纯化液中，反应条件为:37°C 50分钟，95°C 5分钟。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤5测序反应条件为:95°C4分钟，95°C 15 秒；50°C 20 秒；60°C 2 分钟，25 个循环。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，Sanger测序的引物序列为:
CAF:CCTTCAAGATAACCACCGAA
CAR:GGTCAGGAGTTCGAGACAAG。
9.用于检测雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列的试剂盒，包括核酸提取试剂、PCR扩增试剂、酶纯化试剂、测序反应试剂，其特征在于，用于扩增样本DNA的引物的序列为:
CAF:CCTTCAAGATAACCACCGAA
CAR:GGTCAGGAGTTCGAGACAAG。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还包括测序引物为:
CAF:CCTTCAAGATAACCACCGAA
CAR:GGTCAGGAGTTCGAGACAAG。
【文档编号】C12N15/11GK103525918SQ201310449527
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】葛蝉, 陈奕磊, 王淑一 申请人:长沙艾迪康医学检验所有限公司