检测h1n1猪流感病毒的rt-pcr引物及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了检测H1N1猪流感病毒的RT-PCR引物及试剂盒。所述引物为两对：针对H1基因的引物和针对N1基因的引物，所述针对H1基因引物的上游引物ɑHu核苷酸序列为5’-GGAATGGTAGATGGATGGT-3’，下游引物Hd核苷酸序列为5’-ACCCATTAGAACACATCCAGAA-3’，针对N1基因引物的上游引物Nu核苷酸序列为5’-TCCAAGGGGGATGTGTTTG-3’，下游引物Nd核苷酸序列为5’-GACCAAGCGACTGACTCAA-3’，所述试剂盒包括所述的引物。采用本发明检测H1N1猪流感病毒，具有敏感性高、特异性强、快速简便等优点。
【专利说明】检测H1N1猪流感病毒的RT-PCR引物及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于动物病毒分子生物检测【技术领域】，具体涉及检测HlNl猪流感病毒的RT-PCR引物及试剂盒。
【背景技术】
[0002]HlNl 亚型猪流感病毒(Swine influenza virus, SIV)是猪流感(Swineinfluenza, SI)的重要病原之一，为正粘病毒科、A型流感病毒属，由8个分节段的基因组构成，共编码10-11种蛋白。HINl亚型猪流感1918年美国最先报道，Shope于1930年第一次分离鉴定该亚型病毒，这也是首次确诊猪流感病毒，此后不断传播，现已在五大洲都发现其踪迹。该病毒可感染猪，引起猪发生急性、热性呼吸器官传染病，主要以突发的呼吸系统并转归迅速的综合症状为特征，是猪呼吸道综合征症候群疾病之一。由于猪流感病毒对呼吸道上皮细胞具有亲嗜特性，可对其造成损伤，在临床上猪群的发病率可高达100 %，病死率
如伴随其他呼吸系统疾病的继发、混合感染，会导致猪群的损伤程度和病死率会大幅度增高。目前，从猪体中分离到流感病毒有HlNl、H1N2、H3N2、H1N7、H4N6、H3N6、H5N1和H9N2等多个亚型的病毒，能引起猪流感症状并在当今猪群中传播主要有3个亚型，H1N1、H3N2和H1N2，而HlNl在猪流感病毒中占优势地位，近些年世界各地分离到的猪流感病毒亚型大部分都是HlNl。Sreta等研究发现HlNl致病力较其它猪流感病毒更强，感染断奶乳猪仔猪的肺损伤度比H3N2的严重，极大危害猪群的健康。值得注意的是，已有报道美国于2005年12月至2009年2月出现的10例HlNl亚型和I例是H1N2猪流感病毒感染人病例，其中证实9例与猪有直接接触史，2009年3月始发于墨西哥的21世纪甲型HlNl流感大流行，令此亚型流感病毒愈加受到高度的重视。
[0003]HlNl猪流感根据·病毒基因片段来源不同，可分为古典型HlNl猪流感、类禽型HlNl猪流感和类人型HlNl猪流感。三类HlNl猪流感病毒在世界各地处于不同阶段的流行情况各不相同。因此建立有效的诊断方法对防治HlNl亚型猪流感具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供检测HlNl猪流感病毒的RT-PCR引物及试剂盒，具有较高的灵敏度和特异性，且检测成本低，有良好的应用前景。
[0005]本发明的技术方案为:
[0006]检测HlNl猪流感病毒的RT-PCR引物，所述引物为两对:针对Hl基因的引物和针对NI基因的引物，所述针对Hl基因引物的上游引物aHu核苷酸序列为5’ -GGAATGGTAGATGGATGGT-3’，下游引物Hd核苷酸序列为5’ -ACCCATTAGAACACATCCAGAA-3’，针对NI基因引物的上游引物Nu核苷酸序列为5’ -TCCAAGGGGGATGTGITTG-3’，下游引物 Nd 核苷酸序列为 5’ -GACCAAGCGACTGACTCAA-3 ’。
[0007]—种检测HlNl猪流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包括以上所述的引物。
[0008]以上所述检测HlNl猪流感病毒的试剂盒，所述试剂盒还包括:RNA提取试剂、RT反应试剂、PCR反应试剂、阴性对照和阳性对照。
[0009]所述RNA提取试剂包括=Trizol裂解液、氯仿、异丙醇和75%的DEPC乙醇；
[0010]所述RT 反应试剂包括:5Xbuffer 缓冲液、dNTPs、HIR、Uni 12 ；
[0011]所述PCR 反应试剂包括:Taq DNA 酶、10 Xbuffer 缓冲液、dNTPs、MgCl2 和 cDNA ；
[0012]所述阴性对照包括:DEPC水；
[0013]所述阳性对照包括:古典型HlNl猪流感病毒、类禽型HlNl猪流感病毒和类人型HlNl猪流感病毒。
[0014]所述古典型HlNl猪流感病毒可为古典型HlNl猪流感毒株，如:广西壮族自治区动物疫病预防控制中心实验室分离保存的古典型HlNl猪流感毒株；所述类禽型HlNl猪流感病毒可为类禽型HlNl猪流感毒株，如:广西壮族自治区动物疫病预防控制中心实验室分离保存的类禽型HlNl猪流感毒株；所述类人型HlNl猪流感病毒可为类人型HlNl猪流感毒株，如:广西壮族自治区动物疫病预防控制中心实验室分离保存的类人型HlNl猪流感毒株。
[0015]本发明的具体原理是利用HlNl猪流感病毒的同源性，应用0LIG6.0软件，合成针对Hl基因和NI基因的两对靶核苷酸序列的特异性引物，用RT-PCR方法扩增出特异性的目的带。试验方法及过程如下:
[0016]1.引物设计:
[0017]PCR反应中有两条引物，即Y端引物和:V引物。设计引物时以一条DNA单链为基准(常以信息链为基准)，5'端引物与位于待扩增片段5'端上的一小段DNA序列相同；3'端引物与位于待扩增片段3'端的一小段DNA序列互补。引物长度一般为16-25bp左右，引物之间、引物内无互补序列。通过对古典型HlNl猪流感病毒、类禽型HlNl猪流感病毒和类人型HlNl猪流感病毒的代表毒株基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的片段，设计多对引物，通过匹配、筛选最优引物组合如下:
[0018]Hl 基因上游引物 a Hu 序列:5’ -GGAATGGTAGATGGATGGT-3’ ；
[0019]下游引物Hd 序列:5 ’ -ACCCATTAGAACACATCCAGAA-3 ’。
[0020]NI 基因上游引物 Nu 序列:5’ -TCCAAGGGGGATGTGTTTG-3’ ；
[0021 ]下游引物 Nd 序列:5 ’ -GACCAAGCGACTGACTCAA-3 ’。
[0022]2.反应体系的建立和优化:
[0023]将灭活的待检样品用Trizol核酸抽提试剂的提取方法提取病毒基因组RNA，分别分装后储存于_20°C备用。
[0024]2.1引物用量的优化在反应体系其他条件相同的情况下，将引物对的用量分别从
0.1yL至1.8μ L加入体系,通过实验结果分析比较,确定最优引物用量为0.4yL。
[0025]2.2氯化镁浓度的优化在反应体系其他条件相同的情况下通过实验结果分析比较，确定氯化镁的浓度为25mM最佳。
[0026]2.3反转录酶(M-MLV)的优化通过实验结果对比分析，选择200U/ μ L反转录酶作为反应体系最佳用量。
[0027]2.4Taq DNA聚合酶(Taq酶)的优化通过实验结果对比分析，选择5U/ μ L酶作为
反应体系最佳用量。
[0028]2.5dNTPs浓度的优化通过使用不同浓度的dNTPs进行检测，反转录时选择10mM，PCR扩增时选择2.5mM作为反应体系最佳用量。
[0029]2.6反转录引物根据《高致病性禽流感防治技术规范》规定，禽流感病毒RT-PCR试验用引物为 Uni 12:5 ^ -AGCAAAAGCAGG-3'，引物浓度为 20pmo I。
[0030]利用上述引物和各成分的最终浓度，最后确定采用的RT-PCR反应体系为25 μ L，所需各组及相应浓度见表1。
[0031 ] 表1检测HlNl猪流感病毒反应体系
[0032]
【权利要求】
1.检测HlNl猪流感病毒的RT-PCR引物，其特征在于，所述引物为两对:针对Hl基因的引物和针对NI基因的引物，所述针对Hl基因引物的上游引物aHu核苷酸序列为5’ -GGAATGGTAGATGGATGGT-3’，下游引物Hd核苷酸序列为5’ -ACCCATTAGAACACATCCAGAA-3’，针对NI基因引物的上游引物Nu核苷酸序列为5’ -TCCAAGGGGGATGTGITTG-3’，下游引物 Nd 核苷酸序列为 5’ -GACCAAGCGACTGACTCAA-3 ’。
2.一种检测HlNl猪流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物。
3.根据权利要求2所述检测HlNl猪流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括:RNA提取试剂、RT反应试剂、PCR反应试剂、阴性对照和阳性对照。
4.根据权利要求3所述检测HlNl猪流感病毒的试剂盒，其特征在于: (1)所述RNA提取试剂包括=Trizol裂解液、氯仿、异丙醇和75%的DEPC乙醇； (2)所述RT反应试剂包括:5Xbuffer缓冲液、dNTPs、HIR、Uni12 ； (3)所述PCR 反应试剂包括:Taq DNA 酶、IOXbuffer 缓冲液、dNTPs,MgCl2 和 cDNA ； (4)所述阴性对照包括:DEPC水； (5)所述阳性对照包括:古典型HlNl猪流感病毒、类禽型HlNl猪流感病毒和类人型HlNl猪流感病毒。
5.根据权利要求4所述检测HlNl猪流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述古典型HlNl猪流感病毒为古典型HlNl猪流感毒株，所述类禽型HlNl猪流感病毒为类禽型HlNl猪流感毒株，所述类人型HlNl猪流感病毒为类人型HlNl猪流感毒株。
6.一种如权利要求4或5所述检测HlNl猪流感病毒试剂盒的使用方法，包括以下步骤: (1)病毒RNA的提取: 取待检样品、阳性对照、阴性对照各500 μ L于1.5ml灭菌无RNA酶污染的EP管中，加入等量Trizol裂解液进行裂解，充分振荡，室温放置10分钟；加入300 μ L氯仿，摇匀放置10分钟；低温高速离心机12000转/分钟离心15分钟；缓慢取出上层液体600 μ L放置于新的EP管；加入等量异丙醇轻轻混匀，_20°C放置30分钟；低温高速离心机12000转/分钟离心15分钟，弃去上清液；用75%的DEPC乙醇吸取Iml于管内洗涤沉淀，充分吸弃洗涤；将EP管倒置于吸水纸上，尽量吸干液体，放置于37°C温箱中15分钟，管内无可见水珠时取出；加入25 μ L DEPC水，_20°C保存备用； (2)RT操作程序:
取 5Xbuffer 缓冲液 5 μ L、dNTPs 2 μ L、M_MLV 0.5 μ L,HIR 0.5 μ L,Uni 12 2 μ L, RNA`15 μ L，将上述液体置于同一 EP管内，混匀后放于PCR仪按如下程序操作:42 V 60 min,`95 °C 5 min ； (3)PCR操作程序: 上游引物 aHu、Nu 各 0.4 μ L、下游引物 HcU Nd 各 0.4 μ L，Taq DNA 酶 0.2 μ L、IOXbuffer 缓冲液 2.5 μ L、dNTPs 2 μ L、MgCl22 μ L、DEPC 水 11.7 μ L, cDNA 5 μ L，将上述液体置于同一 EP管内，混匀后放于PCR仪按如下程序操作，扩增条件:94 V 30s, 56 V`30 s，72 °C 30 s，35 个循环。
【文档编号】C12Q1/70GK103571971SQ201310462250
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】冯淑萍, 颜健华, 熊毅, 梁丹洁, 李春英, 孙翔翔 申请人:广西壮族自治区动物疫病预防控制中心