单增李斯特菌lamp检测引物、检测方法、试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种单增李斯特菌LAMP检测引物、检测方法、试剂盒及其制备方法，属于生物【技术领域】，单李-FIP为上游内引物，单李-BIP为下游内引物，单李-F3为上游外引物，单李-B3为下游外引物；该试剂盒包括以下物质：（1）化学键偶联有单增李斯特菌单克隆抗体的纳米免疫磁珠；（2）环介导等温扩增（LAMP）反应液，（3）BstDNA聚合酶：8U/μL；（4）阴性对照；（5）阳性对照；（6）显色液。本发明所述的试剂盒用于检测食品中的单增李斯特菌，灵敏度高、特异性强、成本低、操作简便，适合于实验室快速检测和便携式现场检测，具有广阔的推广前景。
【专利说明】单增李斯特菌LAMP检测引物、检测方法、试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种单增李斯特菌的LAMP检测试剂盒及其检测方法，属生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)简称单增李斯特菌。单增李斯特菌可以感染许多食品，包括家畜肉、发酵香肠和海产品等。WHO将其与大肠杆菌0157:H7、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌并列为20世纪90年代四大食源性致病菌。它是李斯特菌属中致病力最强的细菌。
[0003]目前单增李斯特菌的鉴定多采用传统的生化反应实验和溶血试验等，其他方法如PCR方法、酶联免疫吸附法等方法为快速检测单增李斯特菌提供了关键性的技术手段。
[0004]传统生物学分离培养与生化鉴定是病原菌检测的金标准。在日常检测中，首先要将检测样品在液体培养基中进行预增菌，之后在固体培养基上进行分离培养，最后进行生化鉴定。该方法所需时间长，一般情况下需要5-7天，很难满足快速鉴定的需要。PCR技术依赖于传统方法的前增菌步骤，增菌液中往往含有PCR抑制剂，因此灵敏度受限。酶联免疫吸附法作为筛选方法快速、灵敏，但是使用的试剂盒是国外产品，价格昂贵，而且需要专门的仪器，推广起来受限。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是基于检测遗传物质DNA的一种新的扩增技术。该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速、高特异地扩增靶序列，不需要昂贵复杂的仪器，只需要一台简单的加热器，如普通的水浴锅即可，因此利于在食品检测中推广应用。
[0005]纳米磁珠在分离食品中的病原微生物有着重要应用价值:高效富集；在外加磁场作用下能够快速对其进行移动和分离；抗体易于标记。食品中的单增李斯特菌含量较低，且在食品的加工过程会对LM细胞造成不同程度的损伤，但即使细胞受损，也具有潜在的感染能力。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种检测食品中低含量单增李斯特菌的LAMP检测试剂盒及其检测方法。
[0007]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0008]本发明提供了一组检测单增李斯特菌的LAMP引物，该组引物是依据单增李斯特菌标准菌株ATCC19114溶血素基因(NCBI基因收录号JN703915)而设计的。
[0009]单李-F3:5，-TAAACTTCGGCGCAATCA-3，，
[0010]单李-B3:5，-CAAATAAACTTGACGGCCAT-3，，
[0011]单李-FIP: 5’ -GGAAGGTCTTGTAGGTTCATTAACAGGAAAATGCAAGAAGAAGTCA-3’，[0012]单李-BIP:5’ -TCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCTTGAGATATATGCAGGAGGA-3’，
[0013]本发明提供了一种单增李斯特菌的LAMP检测试剂盒，其包括以下物质:
[0014](I)化学键偶联有单增李斯特菌单克隆抗体的纳米免疫磁珠；
[0015]其中，单增李斯特菌的单克隆抗体可以是现有技术中已经公开的单增李斯特菌单克隆抗体，纳米磁珠可以是自己研制或者商品化的磁性纳米颗粒；通过使用化学键偶联制备单增李斯特菌单克隆抗体的纳米免疫磁珠，可有效富集待检食品中的单增李斯特菌，提高检测的灵敏度。
[0016](2)环介导等温扩增(LAMP)反应液:
[0017]其中包括IOXThermopol 反应缓冲液、1.0 ~2.0mmol/L dNTP、2 ~10mmol/L 硫酸镁(MgS04)、0.5~2.0 μ mol/L上游内引物(单李_FIP)、0.5~2.0 μ mol/L下游内引物(单李-ΒΙΡ)、0.1~0.5 μ mol/L上游外引物(单李_F3)、0.1~0.5 μ mol/L下游外引物(单李-B3)和I~5mol/L甜菜碱；
[0018]其中所述的IOXThermopol 反应缓冲液中含有 200mmol/L Tris-HCl (pH8.8)、100mmol/LKCl、100mmol/L (NH4) 2S04、20mmol/L MgSO4 和 l%Triton X — 100 ;
[0019](3) Bst DNA 聚合酶:8U/ μ L ;
[0020](4)显色剂:荧光染料SYBR Green I ；
[0021](5)阴性对照:灭菌蒸馏水；
[0022](6)阳性对照:由单增李斯特菌标准菌株ATCC19114提取的核酸作为阳性对照，采用革兰氏阳性细菌基因组DNA提取试剂盒并按其操作说明提取ImL菌悬液基因组DNA。
[0023]本发明还提供了一种单增李斯特菌的检测方法，该方法包括以下步骤:
[0024](I)纳米免疫磁珠富集菌体:取Img纳米免疫磁珠于离心管中，置于磁分离架吸附2min后，弃上清，免疫磁珠用100 μ L灭菌蒸馏水重悬；取ImL待检食品或菌悬液加入纳米免疫磁珠重悬液中，缓慢颠倒混匀，室温孵育20min，然后置于磁力架上吸附3min，弃上清，纳米免疫磁珠用灭菌蒸馏水洗涤两次，每次10s，最后用100 μ L蒸馏水重悬磁珠，获得富集后的囷体样品；
[0025](2)提取步骤⑴获得的菌体样品的DNA，即模板DNA，可以利用现有技术中已知的方法或试剂盒提取，例如革兰氏阳性细菌基因组DNA提取试剂盒或等效试剂盒。
[0026](3)进行LAMP反应，该LAMP反应体系见下表:
[0027]LAMP 反应体系(25 μ L):
[0028]
【权利要求】
1.一种检测单增李斯特菌的LAMP引物，其特征在于，单李-FIP为上游内引物，单李-BIP为下游内引物，单李-F3为上游外引物，单李-B3为下游外引物； 具体引物为:
单李-FIP:5’ -GGAAGGTCTTGTAGGTTCATTAACAGGAAAATGCAAGAAGAAGTCA-3’ ；
单李-BIP:5’ -TCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCTTGAGATATATGCAGGAGGA-3’ ；
单李-F3:5’ -TAAACTTCGGCGCAATCA-3’ ；
单李-B3:5’ -CAAATAAACTTGACGGCCAT-3’。
2.—种单增李斯特菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下物质: (1)化学键偶联有单增李斯特菌单克隆抗体的纳米免疫磁珠； (2)环介导等温扩增(LAMP)反应液， 其中包括IOXThermopol反应缓冲液、1.0~2.0mmoI/L dNTP、2~10mmol/L硫酸镁(MgS04)、0.5~2.0ymol/L上游内引物(单李-FIP)、0.5~2.0 μ mol/L下游内引物(单李-ΒΙΡ)、0.1~0.5 μ mol/L上游外引物(单李_F3)、0.1~0.5 μ mol/L下游外引物(单李-B3)和I~5mol/L甜菜碱； 其中所述的IOXThermopol反应缓冲液中含有200mmol/L Tris-HCl (pH8.8)、100mmol/LKCl、100mmol/L (NH4) 2S04、20mmol/L MgSO4 和 l%Triton X — 100 ;
(3)Bst DNA 聚合酶:8υ/μ L ; (4)阴性对照:灭菌蒸馏水； (5)阳性对照:由单增李斯特菌标准菌株ATCC19114提取的核酸作为阳性对照，采用革兰氏阳性细菌基因组DNA提取试剂盒并按其操作说明提取ImL菌悬液基因组DNA ； (6)显色液:荧光染料SYBRGreen I。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液中各种成分的使用终浓度为 IXThermoPol 缓冲液、1.4mmol/L dNTP、8.0mmol/L MgS04、0.2 μ mol/L 上游外引物单李_F3、0.2 μ mol/L下游外引物单李-B3、1.6 μ mol/L上游内引物单李-FIP、1.6 μ mol/L下游内引物单李-BIP。
4. 单增李斯特菌的LAMP检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括下列步骤: (O偶联有单增李斯特菌单克隆抗体的纳米免疫磁珠: 取2mg商品化的纳米磁珠(粒径为20~IOOnm)在6mL pH7.0的磷酸缓冲溶液(PBS)中通过磁分离的方法清洗磁珠两次，加入两种活化交联剂:3mgl-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(缩写为EDC.HCl)和2mg磺酸基琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)到6mL含2mg商品化纳米磁珠的磷酸缓冲溶液中，室温旋转反应30min ;通过磁分离的方法清洗磁珠两次，用ImL pH7.0的磷酸缓冲溶液重悬磁珠，加入50 μ g单增李斯特菌单克隆抗体，室温旋转反应5h ;偶联结束后通过磁分离的方法清洗磁珠两次，加入ImL牛血清白蛋白(BSA)质量百分比为2%的磷酸缓冲溶液中，室温旋转反应Ih ;封闭后的纳米免疫磁珠通过磁分离的方法清洗磁珠一次，加入到IOmL牛血清白蛋白(BSA)质量百分比为0.2%的磷酸缓冲溶液中4°C冷藏备用； (2)LAMP反应液: 含有2.5 μ LlO X Thermopol反应缓冲液、1.4 μ L25mmol/L dNTP (四种脱氧核糖核酸的混合物)、4.0 μ LlO μ mol/L上游内引物(单李-FIP)、4.0 μ LlO μ mol/L下游内引物(单李-ΒΙΡ)、0.5 μ LlO μ mol/L上游外引物(单李_F3)、0.5 μ LlO μ mol/L下游外引物(单李-Β3)、2 μ L100mmol/LMgS04、5 μ L5M 甜菜碱和 2.1 μ L Η20 (灭菌水)； 其中所述的上游内引物(单李-FIP):
5’-GGAAGGTCTTGTAGGTTCATTAACAGGAAAATGCAAGAAGAAGTCA-3， 下游内引物(单李-ΒΙΡ):
5’-TCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCTTGAGATATATGCAGGAGGA-3， 上游外引物(单李-F3):
5，-TAAACTTCGGCGCAATCA-3， 下游外引物(单李-Β3):
5’-CAAATAAACTTGACGGCCAT-3’ (3)Bst DNA 聚合酶:100μ L(8U/y L):购自 NEB 公司； (4)阴性对照:灭菌水，Im L； (5)阳性对照:由单增李斯特菌标准菌株ATCC19114提取的基因组DNA(100 μ L)作为阳性对照，0D260/0D280能够达到1.8，浓度达到20ng/μ L ； (6)显色液:SYBRGreen I 染料(200 μ L),购自 Invitrogen 公司； (7)磁分离架I个，天津生物芯片有限公司。
5.一种单增李斯特菌的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: O纳米免疫磁珠捕获菌细胞:取Img纳米免疫磁珠于离心管中，置于磁分离架吸附2min后，弃上清，免疫磁珠用100 μ L灭菌蒸馏水重悬；取ImL待检食品或菌悬液加入纳米免疫磁珠重悬液中，缓慢颠倒混匀，室温孵育20min，然后置于磁力架上吸附3min，弃上清，纳米免疫磁珠用灭菌蒸馏水洗涤两次，每次10s，最后用100 μ L蒸馏水重悬磁珠，获得富集后的囷体样品； 2)富集菌体样品DNA的提取； 3)LAMP反应体系(25 μ L)如下:
?I所加体积 I终浓度单李-FIP/ 单李 BIP 4μ L1.6 μ mol/L单李-F3/ 单李 -B30.5μ L0.2 μ mol/L
甜菜碱5μ?lmol/L
dNTP1.4μ L1.4mmol/L
MgSO42 μ L8mmol/L
IOXThermopol 反应缓冲液~2.5μ LTx
模板 DNA2 μ L/
Bst DNA 聚合酶TTl8U
【文档编号】C12N15/11GK103468823SQ201310464599
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】李正义, 贾俊涛, 梁成珠, 徐彪, 姜英辉, 赵丽青, 张晓梅, 马云 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心