一种多基因组合表达制备藻类红色素的方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种多基因组合表达制备藻类红色素的方法，具体地说是一种利用多基因组合表达技术生产可应用在制备免疫荧光分析或功能食品中的藻类红色素的制备方法及其应用。具体步骤包括：由螺旋藻中克隆出藻类红色素合成关键酶基因（hox1和pebS），通过多基因组合表达技术，将两个关键酶基因导入受体细胞中，从而在受体细胞中建立藻类红色素的生物合成途径。经该两步酶促催化反应，可以利用大肠杆菌体内的血红素转化合成藻类红色素。最后经萃取、制备HPLC等纯化步骤，得纯度在95%以上的高纯度藻类红色素。本发明所得藻类红色素最大吸收波长为550nm，最大荧光发射波长为570nm。此法制备的藻类红色素藻类红色素可以作为荧光探针或色素类抗氧化剂应用于制备功能食品的有效成份中。
【专利说明】一种多基因组合表达制备藻类红色素的方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程和食品医药领域，具体地说是一种利用多基因组合表达工程技术，具体涉及可应用在制备免疫荧光探针或功能食品中的制备藻类红色素的方法及其应用。
【背景技术】
[0002]藻类红色素是存在于红藻及蓝藻中的一种光合作用辅助色素。与胆红素类似，是由4个吡咯环通过甲烯基呈直链连接，分子量约为586.68g/mol。它们在体内与可溶性蛋白质结合称为藻红蛋白(phycoerythrin),溶于稀盐溶液中。它们在光合作用中起吸收及传递光能的作用。
[0003]作为胆红素的衍生物，藻类红色素目前已被证明具有抗氧化(Hirata，T.,Tanaka, Μ.，Ooikej Μ.，Tsunomuraj Τ.，and Sakaguchij Μ.Antioxidant activitiesof phycocyanobilin prepared from Spirulina platensis J Appl Phycol12， 2000，435-439.)、清除羟自由基以及氧自由基、保护生物膜免受氧化伤害(Hirata，T.，Tanaka,Μ.，Ooikej Μ.，Tsunomuraj Τ.，and Sakaguchij Μ.Radical scavenging activitiesof phycocyanobiIin prepared from a cyanobacterium, Spirulina platensis,Fisheries Sci 1999，65, 971-974.)以及消炎(Bhat，V.Β.，and Madyasthaj Κ.M.Scavenging of peroxynitrite by phycocyanin and phycocyanobiI in from Spirulinaplatensis: protection against oxidative damage to DNAj Biochem Biophys ResCowmun 2001，285, 262-266.)等多种功效。最新研究证据发现，藻类红色素在细胞内可以被血红素还原酶还原而转化为胆红素，进而反馈抑制由氧化损伤引起的NADPH氧化酶的过量表达，对于糖尿病、Gilbert综合症等由氧化损`伤引起的疾病起到很好的疗效(McCarty, M.F.，Barroso-Arandaj J.，and Contreras, F.NADPH oxidase mediatesglucolipotoxicity-1nduced beta cel I dysfunction—clinical impIications，Med Hypotheses 2010，74, 596-600; McCarty, M.F.，Barroso-Arandaj J.，andContreras, F.0ral phycocyanobiI in may diminish the pathogenicity of activatedbrain microglia in neurodegenerative disorders, Med Hypotheses 2010， 74,601-605.)。美国食品医药局(FDA)已批准将藻胆蛋白(藻胆色素与脱辅基蛋白结合在一起)用于皮肤癌、乳腺癌的光敏治疗(范晓，海藻化学研究的展望，海洋科学，1996，(2):24)。同时藻类红色素可以作为荧光探针及天然色素，在生物荧光探针检测以及功能食品制备方面具有广阔的用途(Wu，S.H.，McDowell, Μ.Τ.，and Lagariasj J.C.Phycocyanobilinis the natural precursor of the phytochrome chromophore in the green algaMesotaenium caldariorum, J Biol Chem 1997， 272, 25700-25705.)。
[0004]现有的藻类红色素的提取技术主要是从红藻中天然提取。它包括一系列长周期、高成本、复杂的工艺过程。主要包括:藻细胞的培养、离心收集，藻体的破碎和藻类红色素的抽提、精制等。其中藻类红色素的分离纯化方法主要有:热甲醇裂解法和甲醇两步抽提法。热甲醇裂解法是利用热甲醇(70-75°C)缓慢打开藻类红色素和脱辅基蛋白之间的硫醚键，从而抽提得到2/3左右的自由藻类红色素。但由于天然红藻中还含有叶绿素和类胡萝卜素等多种色素，这种方法往往只能得到纯度不高的藻类红色素。而甲醇两步抽提法是先用冷乙醇抽提，去除大部分的叶绿素和类胡萝卜素，此时藻类红色素不溶于冷乙醇，然后再用热甲醇抽提，这样可以获得纯度较高(80%左右)的藻类红色素(O’Carra, P., Murphy,R.F., and Killilea, S.D.The native forms of the phycobilin chromophores ofalgal biliproteins.A clarification, Biochem J 1980, 187, 303-309.)。更高纯度的藻类红色素需要进一步的薄层层析或制备性高效液相色谱纯化方可得到。
[0005]目前，市场上高纯度藻类红色素价格较高(作为光敏剂高纯度藻类红色素的价格约为150-180美元/毫克)，目前主要依赖于从美国进口，尚不适合作为医疗保健品广泛应用。因此开发工艺简单、成本低廉的藻类红色素规模制备技术，将为藻类红色素作为免疫荧光探针或食用色素的广泛应用奠定基础。
【发明内容】
[0006]本发明目的在于提供一种简便、快速、低成本的制备藻类红色素方法，及其在免疫荧光探针或功能食品等方面的应用。
[0007]实现本发明目的技术方案是:
一种多基因组合表达制备藻类红色素的方法，分别由集胞藻sp.PCC6803和Prochlorococcus phage P-SSM2中克隆出藻类红色素合成关键酶基因血红素氧化酶基因hoxl和藻类红色素合成酶基因pebS,采用多基因组合表达方法，将该两基因克隆到适当的表达载体上，并将此构建的重组表达载体转入大肠杆菌中，以大肠杆菌自身血红素为底物，通过Hoxl和PebS两步酶促催化反应，从而建立一条重组藻类红色素的生物合成途径，并获得相应的大肠杆菌重组工程菌株，应用此工程菌株生产重组藻类红色素，其制备步骤:`
(O根据Genebank中公布的集胞藻sp.PCC 6汾λ?血红素氧化酶基因和Prochlorococcus phage P-SSM2藻红素合成酶基因的基因序列，设计适当引物，分别以集胞藻sp.PCC 沒汾λ?和 Prochlorococcus phage P-SSM2 基因
组DNA为模板，采用基因工程方法，克隆藻类红色素合成关键酶基因hoxl和；
(2)采用多基因组合表达方法将上术步骤(1)克隆得到的藻类红色素合成关键酶基因h0Xl和适当多基因组合表达载体上，并将此构建重组表达载体转入大肠杆菌中，从而在该大肠杆菌工程中建立一条重组藻类红色素的生物合成途径，并获得相应的大肠杆菌重组工程菌株；
(3)将上述步骤(2)所得到的大肠杆菌工程菌株在37°C培养至0D_= 0.5^0.7菌体浓度后，降温至25°C，利用异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂进行诱导，继续避光培养24小时，离心收集菌体；
(4)将上述步骤(3)收集到的菌体用甲醇悬浮萃取2小时，离心分离后，上清液即得藻类红色素粗提液，将藻类红色素粗提液与等体积的氯仿混合，萃取出多余的蛋白质，然后再经制备型HPLC进一步精制，得到高纯度的藻类红色素，将藻类红色素溶液冷冻干燥或旋转蒸发除去多余水分，即得高纯度藻类红色素粉末产品。[0008]在本发明中，藻类红色素合成相关基因的获得是通过分子克隆方法分别从集胞藻Synechocystis sp.PCC 6803 和 Prochlorococcus phage P-SSM2 中克隆得到；而后将藻类红色素合成相关基因亚克隆到各种载体上，如大肠杆菌(疋coin的pET28a、pETDuet-1，P⑶FDuet-1等基因共表达载体系列，再将构建的重组表达载体导入大肠杆菌表达体系中异源表达，从而在工程菌株体内建立一条重组藻类红色素的生物合成途径，并应用该工程菌株高效生产重组藻类红色素；运用溶剂萃取和各种层析技术纯化获得高纯度藻类红色素。该重组藻类红色素可以直接用作药物、试剂、食品添加剂、保健或功能食品有效成分等。
[0009]在本发明中，利用多基因组合表达工程技术，将血红素氧化酶和藻类红色素合成酶基因导入大肠杆菌中，从而在大肠杆菌体内建立一条重组藻类红色素的生物合成途径。通过该两基因的组合表达，以大肠杆菌中血红素为底物，通过两步酶促催化反应，利用重组工程菌株生产重组藻类红色素。
[0010]在本发明中，血红素氧化酶基因(Α<ατ7)是指与sp.PCC 6803中 财基因同源的基因；藻类红色素合成酶基因(/76^50是指与Prochlorococcus phageP-SSM2中YP_214290.1基因同源的基因。
[0011]在本发明中，应用多基因组合表达工程方法，在基因两端分别加上I和Sac I酶切位点，并插入到pET28a、pETDuet-1，pCDFDuet-1质粒的第一个多克隆位点处，得到重组载体 pET28a-Aior7、pETDuet-Aoxi, pCDFDuet- hoxl。在基因pe/W两端分别加上Ue I 和 ZSo I 酶切位点，并插入到 pET28a_Aox7、pETDuet_Aox7、pCDFDuet- hoxl 的另一个多克隆位点处，得到重组载体 pET28a-Aior7-/76^5.、pETDuet-Aox1-/?^^, pCDFDuet-hoxl-pebS。
[0012]在本发明中,根据Genebank中所公布的和基因序列设计引物。hoxl的正向引物 P1: 5 ’ -TAGGATCCTATGAGTGTCAACTTAGCTTCCCAG-3，，反向引物 P2: 5’ -TTGAGCTCCTAGCCTTCGGAGGTGGCGAG-3 ’。pebS 的正向引物 P3:5 ’ -TTCATATGATGACGAAGAACCCGCG-3 ’，反向引物 P4: 5 ’ -TGCTCGAGTTACTTGTAGGAGAACAG-3，。
[0013]在本发明中，酶促催化反应为血红素经Hoxl作用得到胆绿素，再经Pebs作用得到藻类红色素。
【权利要求】
1.一种多基因组合表达制备藻类红色素的方法,分别由集胞藻Synechocystis sp.PCC 6803和Prochlorococcus phage P-SSM2中克隆出藻类红色素合成关键酶基因(血红素氧化酶基因和藻类红色素藻类红色素合成酶基因采用多基因组合表达方法，将该两基因导入大肠杆菌中，以大肠杆菌自身血红素为底物，通过Hoxl和PebS两步酶促催化反应，在受体细胞中建立重组藻类红色素的生物合成途径，从而获得相应的大肠杆菌重组工程菌株，并应用此工程菌株生产重组藻类红色素，其制备步骤: (O根据Genebank中公布的集胞藻Synechocystis sp.PCC 6803血红素氧化酶基因 和Prochlorococcus phage P-SSM2藻红素合成酶基因的基因序列，设计适当引物，分别以集胞藻 Synechocystis sp.PCC 6803 和 Prochlorococcus phage P-SSM2 基因组DNA为模板，采用基因工程方法，克隆藻类红色素合成关键酶基因hoxl和； (2)采用多基因组合表达方法将上述步骤(1)克隆得到的藻类红色素合成关键酶基因hoxl和pebS重组到适当表达载体上，并将此构建重组表达载体转入大肠杆菌中，得到大肠杆茵工程茵株； (3)将上述步骤(2)所得到的大肠杆菌工程菌株在37°C培养至0D_= 0.5^0.7菌体浓度后，降温至25°C，利用IPTG作为诱导剂进行诱导，继续避光培养24小时，离心收集菌体； (4)将上述步骤(3)收集到的菌体用甲醇悬浮萃取2小时，离心分离后，上清液即得藻类红色素粗提液，将藻类红色素粗提液与等体积的氯仿混合，萃取出多余的蛋白质，然后再经制备型HPLC进一步精制，得到高纯度的藻类红色素，将藻类红色素溶液冷冻干燥或旋转蒸发除去多余水分，即得高纯度藻类红色素粉末产品。
2.根据权利要求1所述的制备藻类红色素的方法，其特征在于所述的血红素氧化酶基因是指与Synechocystis sp.PCC 6803中sllll84基因同源的基因；藻类红色素合成酶基因是指与Prochlorococcus phage P-SSM2中YP_214290.1基因同源的基因。
3.根据权利要求1所述的制备藻类红色素的方法，其特征在于所述的表达载体是大肠杆菌万.coli的pET28a、pETDuet-1, pQ)FDuet_l等多基因共表达载体系列。
4.根据权利要求1所述的制备藻类红色素的方法，其特征在于所述的设计适当引物是根据Genebank中所公布的和基因序列设计引物的正向引物Pl:5’ -TAGGATCCTATGAGTGTCAACTTAGCTTCCCAG-3 '反向引物 P2: 5 ’ -TTGAGCTCCTAGCCTTCGGAGGTGGCGAG-3 ’ -,pebS 的正向引物 P3:5 ’ -TTCATATGATGACGAAGAACCCGCG-3，，反向引物 P4: 5 ’ -TGCTCGACTTACTTGTAGGAGAACAG-3’。
5.根据权利要求1所述的制备藻类红色素的方法，其特征在于所述的多基因组合表达方法是指多基因组合表达工程方法，在Aod基因两端分别加上及I和fee I酶切位点，并插入到pET28a、pETDuet-1、pCDFDuet-1质粒的第一个多克隆位点处,得到重组载体；在基因pebS两端分别加上Ue I和Xho I酶切位点，并插入到pET28a-A<ar7、pETDuet_Aox7、P⑶FDuet- hoxl质粒的另一个多克隆位点处，得到重组载体。
6.根据权利要求1所述的制备藻类红色素的方法，其特征在于所述的酶促催化反应为血红素经Hoxl作用得到胆绿 素，再经Pebs作用得到藻类红色素，
7.根据权利要求1所述的制备藻类红色素的方法，其特征在于所述的制备型HPLC进一步精制是指将萃取分离后的藻类红色素粗制品，用甲醇溶解后，采用waters制备型液相色谱分离，分离柱为C-18反相色谱柱，流动相采用95%乙腈/超纯水进行梯度洗脱，收集洗脱峰时物质，从而得到高纯度的藻类红色素。
8.根据权利要求1所述的制备藻类红色素的方法，其特征在于所述的重组藻类红色素最大吸收波长为550nm,最大突光发射波长为570nm。
9.根据权利要求7所述的制备藻类红色素的方法，其特征在于所述制备型HPLC流动相A为H2O,其中含0.1%三氟乙酸；流动相B为95%乙腈/超纯水，其中含0.1%的三氟乙酸；收集洗脱峰时物质是指收集洗脱时间为18.35min,乙腈浓度为56%_58%时洗脱液，从而得到高纯度的藻类红色素。
10.权利要求1-9任一方法制备的藻类红色素，可应用在制备免疫荧光探针或色素类功能食品的有效成份中。
【文档编号】C12R1/19GK103865965SQ201410110997
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月25日 优先权日:2014年3月25日
【发明者】葛保胜, 王祥法, 黄方, 李 杰 申请人:中国石油大学(华东)