具有群体感应抑制作用的芽孢杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有群体感应抑制作用的芽孢杆菌，所述的芽孢杆菌为具有与保藏号为CCTCC?NO：M2014049的地衣芽孢杆菌95％同源性的地衣芽孢杆菌。本发明的芽孢杆菌为不带有溶血性的群体感应抑制芽孢杆菌，为进一步探讨群体具有群体感应抑制作用的芽孢杆菌对细菌性病害的防治奠定基础。
【专利说明】具有群体感应抑制作用的芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物和水产养殖【技术领域】，具体而言，涉及具有群体感应抑制作用 的芽孢杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 据不完全统计，全国水产养殖病害种类高达200余种，其中生物源性疾病中，细菌 性疾病占57. 63%。2012年单纯由于病害而导致的水产业的直接经济损失达到140亿元， 严重制约了水产养殖业的健康发展和经济效益的提升。近年来，由于传统的抗生素等药物 长期使用后会造成细菌的耐药性、药物残留以及对环境产生危害；因此，抗菌药作用新靶点 的发现和新型抗菌药物的研发显得尤为重要。20世纪70年代Nealson首次在费氏弧菌 (Vibrio fischeri)和哈氏弧菌（Vibrio harveyi)两种发光细菌中发现细菌细胞间存在群 体感应系统。群体感应（Quorum sensing,简称QS)是指细菌能自发产生并释放一些特定的 信号分子，通过对自身浓度的变化感知，进而调控相关基因的表达。研究表明，细菌群体感 应系统控制着包括生物被膜形成、有害毒素产生、致病因子释放、胞外多糖产生等一系列的 细菌毒力行为，因此，调控QS系统对细菌毒力的表达，有望成为控制细菌感染的有效武器。 研究表明引起水产动物细菌性病害的病原菌如嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、哈氏弧菌、副 溶血弧菌等其毒力因子的表达均受到群体感应信号分子的调控；因此，从群体感应入手，控 制细菌性病害应用前景广阔。
[0003] 芽孢杆菌属是革兰氏阳性菌，严格需氧或兼性厌氧。该属细菌的重要特性是能够 产生对不利条件具有特殊抵抗力的芽孢。但是多数具有溶血特性，部分蜡状芽孢杆菌因为 其溶血性引起食物中毒；虽然枯草芽孢杆菌224活菌体制成的生物制品-白天鹅气雾剂，具 有改善创面微生态环境和良好的抗感染、促进创面愈合作用，但因具有溶血性，严重地限制 了其在临床上的应用。因此如何获得不携带溶血性致病因子的安全芽孢杆菌是本领域技术 人员亟待解决的技术问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是克服现有技术所存在的上述不足，提供一种具有群体感应抑制作 用的芽孢杆菌及其应用。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：
[0005] 本发明一方面涉及一种具有群体感应抑制作用的芽孢杆菌，其特征在于所述的芽 孢杆菌为具有与保藏号为CCTCC NO :M2014049的地衣芽孢杆菌95%同源性的地衣芽孢杆 菌；优选的，所述的芽孢杆菌为保藏号为CCTCC NO :M2014049的地衣芽孢杆菌或其直接传 代物。
[0006] 在本发明的一个优选实施方式中，所述的具有群体感应抑制作用的芽孢杆菌来源 于养殖塘底泥或异育银鲫肠道。
[0007] 本发明另一方面还涉及一种芽孢杆菌制剂，其特征在于含有有效量的上述芽孢杆 菌。
[0008] 在本发明的一个优选实施方式中，所述的芽孢杆菌制剂为液体制剂或固体制剂。
[0009] 本发明另一方面还涉及上述芽孢杆菌制剂在水产养殖中的应用。
[0010] 本发明另一方面还涉及上述芽孢杆菌制剂在制备水产养殖抗菌制剂中的应用。
[0011] 本发明的芽孢杆菌为不带有溶血性的群体感应抑制芽孢杆菌，为进一步探讨群体 具有群体感应抑制作用的芽孢杆菌对细菌性病害的防治奠定基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1、28°C芽孢杆菌菌株溶血性；
[0013] 图2、37°C芽孢杆菌菌株溶血性；
[0014] 图3、"H"划线法T-1褪色效果(黑色箭头所示）；
[0015] 图4、二层琼脂法T-1褪色效果；
[0016] 图5菌株T-1的生长曲线；
[0017] 图6T-1活菌数量-0D600标准曲线；
[0018] 图7T-1活菌数量、芽孢数量与时间的关系。
[0019] 微生物信息
[0020] 本发明的一个优选实施方式以及【具体实施方式】中所使用的芽孢杆菌T-1为地衣 芽孢杆菌（Bacillus licheniformis)，已经保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号 CCTCC N0.M2014049,保藏地址为：中国武汉市武汉大学，保藏日期为2014年2月27日。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合附图和具体实施例对本发明的方法作进一步详细地说明。
[0022] 1.材料与方法
[0023] 1. 1 材料
[0024] 1. 1. 1实验菌株来源与培养
[0025] 紫色杆菌购买自美国ATCC ;将冻干粉保藏的紫色杆菌接种于LB液体培养基中活 化，26°C培养24h ;用接种环占取菌液在营养琼脂平板中划线分离，挑取单个紫色菌落在营 养琼脂斜面上划线，26 °C培养48h石蜡保存备用。
[0026] 1. 1. 2培养基与试剂
[0027] 营养琼脂培养基(购买自上海鼎国），LB培养基(购买于上海生工）；哥伦比亚血琼 脂培养基(购买自北京陆桥)，营养肉汤培养基(购买自上海鼎国），琼脂粉(购买自上海鼎 国），细菌基因组抽提试剂盒(购买于上海生工）；PCR试剂：Master Mix2x，通用引物1492R、 27F，（上海美吉生物技术公司），D2000marker (购买于北京天根)。
[0028] 1. 1. 3主要仪器设备
[0029] 超净工作台（SW-CJ-IF型，苏州净化设备有限公司）；高压灭菌锅（YXQ-LS-18SI， 上海博讯实业有限公司）；生化培养箱（SPX-100B-Z型，上海博讯实业有限公司）；离心机 (TDL80-2B型，上海安亭科学仪器有限公司）；电泳仪（DYY-6C型，北京市六一仪器厂)，电泳 槽（DYCP-32B，北京市六一仪器厂）;PCR仪；振荡培养箱（THZ-92B，上海博讯实业有限公司）； 722型分光光度计(上海精密仪器仪表有限公司）烘箱，水浴锅（HH，S11-8型，上海博迅实业 有限公司）
[0030] 1· 2 方法
[0031] 1. 2. 1芽孢杆菌分离纯化
[0032] 参照 Cho 等（Cho HP, Liu LL，Liu Κ，et al. Phenotypic characterizationand phylogenetic analysis of a virulent Bacillus cereus strain from the Tiger frog,Hoplobatrachus rugulosusffiegmann[J]. African Journal of Microbiology Research, 2010, 4 (24) : 2780-2786.)的方法，取养殖塘底污泥用无菌生理盐水稀释至10_5， 在水浴锅中80°C水浴10min，分别取各稀释度菌液0. lmL涂布于营养琼脂培养基平板，28°C 培养24?48h。挑出单菌落，分离纯化，经革兰氏染色和芽孢染色，挑选出具有芽孢的革兰 氏阳性菌，然后转接到营养琼脂斜面上28°C培养24?48h。液体石蜡保存备用。
[0033] 参照Olsson等（Olsson C，Westerdahl A，Conway P L. Intestinal colonization potential of turbot (Scophthalmus maximus L.) and dab (1imanda)associated bacteria with inhibition effects against Vibrio anguillarum[J]. Appl. Environ. Micro, 1992, 58 (2) :551-556.)的方法。首先用75%的酒精进行体表消毒；解剖异育银鲫， 取出肠道，75%酒精棉球擦拭肠管外壁，无菌生理盐水冲洗。称重后按1 : 10(w/v)的比例 加入灭菌生理盐水混合，用灭菌匀浆器充分研磨均匀，研磨的样品设为ΚΓ1，再用灭菌生理 盐水对ΚΓ 1样品进行梯度稀释至ΚΓ6,各稀释度样品均置于漩涡混合仪上振荡均匀并置于 水浴锅中，80°C水浴10min，分别取各稀释度菌液0. lmL涂布于营养琼脂培养基平板，28°C 培养24?48h。挑出单菌落，分离纯化，经革兰氏染色和芽孢染色，挑选出具有芽孢的革兰 氏阳性菌，然后转接到营养琼脂斜面上28°C培养24?48h。液体石蜡保存备用。
[0034] 1. 2. 2具有群体感应抑制活性芽孢杆菌的筛选
[0035] (1)溶血实验
[0036] 将在营养琼脂斜面过夜培养好的待测菌株划线接种于哥伦比亚血琼脂平板上，分 别在28°C和37°C培养24h，根据菌落周围有无透明圈的形成，来判断溶血素的产生.
[0037] (2) "H"型划线法
[0038] 参考 RiquelmeC 等方法（Riquelme C, Araya R, Vergara N, etc. Potential probiotic strains in the culture of the Chilean scallop Argopecten purpuratus (Lamarck, 1819) [J] · Aquaculture, 1997,154 :17-26.)用无菌棉签挑取一定量 芽孢杆菌菌液在营养琼脂平板中心连续涂抹，在芽孢杆菌涂抹出两侧平行用无菌棉签占取 少量指示菌株紫色杆菌菌液在平板上涂抹，两菌株划线成"H"型。若靠近芽孢杆菌附近的 紫色杆菌的紫色褪去，则表明待测菌株具有抑制AHLs信号分子的作用。
[0039] (3)二层琼脂法
[0040] 参照储卫华等方法（Chu W，LuF，Zhu W and Kang C. Isolation and characterization of new potential probiotic bacteria based on quorum-sensing system. J Appl Microbiol [J]. 2011，110 (1) : 202-208)，将待测芽孢杆菌在营养肉汤培养 基中28°C增菌培养24h，用无菌棉签占取一定量的待测芽孢杆菌菌液在营养琼脂平板中心 处涂抹，待晾干后放置于28°C培养箱中培养24h，取加入0. lmL指示菌株紫色杆菌的半固体 培养基倾倒在已培养好的平板上晃均匀，放置于26°C的培养箱中培养24h，若在平板中心 处涂抹芽孢杆菌处及边缘没有紫色产生，则表明待测菌株具有抑制AHLs信号分子的作用。
[0041] 1. 3具有群体感应抑制效果的芽孢杆菌菌株T-1生物学特性的研究
[0042] 1. 3. 1具有群体感应抑制效果的芽孢杆菌菌株Τ-l生长曲线的测定
[0043] 参考 Thompson J D 等（Thompson J D，Higgins D G，GibsonTJ. CLUSTALff:improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position_specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res, 1994, 22:4673-4680),将芽孢杆菌菌悬液按1%的接菌量接入 营养肉汤培养基中，于37°C中摇床培养，每2h取样测600nm处的0D值，用未接种的培养基 作为空白对照，以时间为横坐标，0D值为纵坐标做出芽孢杆菌的生长曲线图。
[0044] 1. 3. 2芽孢杆菌0D_值与活菌数量的关系
[0045] 参考陈莉等(陈莉，汪立平等，枯草芽孢杆菌KCYCZ发酵条件优化及放大[J].食品 工业科技.2014 (3M72-176)，活菌数的测定将待测菌液梯度稀释1(Γ3-1(Τ然后取稀释液 100 μ L均匀涂布在营养琼脂固体平板培养基上，每个梯度做三个重复，培养24h，计算活菌 个数。
[0046] 1. 3. 3芽孢杆菌活菌数量、芽孢数与时间的关系
[0047] 测出 4h、8h、12h、16h、20h、24h 的活菌数量。
[0048] 芽抱数测定方法参考 Hoben 等（Hoben HJ, Somasegaran P. Comparison of the poor, spread, and drop plate methods for enumeration of Rhizobium spp. in inoculants made from Presterilized peat[J]. Applied and environmental Microbiol ogy，1982, 44 (5) : 1246-1247)，去各个时间待测菌液放置在80°C的水浴锅中水浴lOmin，按 照活菌计数方法，梯度稀释10_3-10_ 7然后取稀释液1〇〇 μ L均匀涂布在营养琼脂固体平板培 养基上，每个梯度做三个重复，培养24h，计算芽孢数量。
[0049] 2.结果与分析
[0050] 2. 1芽孢杆菌的筛选结果
[0051] 从养殖塘底泥和异育银鲫肠道内共筛选出具有芽孢且为革兰氏阳性菌的菌株33 株，经溶血性检查筛选出5株没有溶血性的菌株分别为Τ-l、D-l、Y-1、DY-1、Y-9,而FF1-2、 DS-2具有溶血性。图1、图2为28°C、37°C条件下培养24h的观察结果。
[0052] 2. 2具有群体感应抑制活性芽孢杆菌筛选结果
[0053] 采用"H"字划线法和二层琼脂法筛选出芽孢杆菌T-l，"H"字划线法可发现与T-1 与指示菌株紫色杆菌接触处紫色褪去（图3)，二层琼脂法显示在芽孢杆菌Τ-l上方及周边 呈椭圆型紫色褪去（图4)。
[0054] 2. 3具有群体感应抑制效果的芽孢杆菌菌株Τ-l生长曲线的测定结果
[0055] 试验结果显示(如图5)，菌株Τ-l在37°C 150r/min条件下的生长曲线：0-4h为迟 缓期，4-32h为对数增长期，32h-52h为稳定期，52h后为衰亡期。
[0056] 2. 4芽孢杆菌0D_值与活菌数量的关系
[0057] 地衣芽孢杆菌Τ-l的0D6(?值与活菌数量的标准曲线，由图可知当0D值大于0. 859 之后两者之间的关系趋于直线，当0D值为1. 604时活菌数量达到5. 0xl09CFU/mL (图6)。
[0058] 2. 5芽孢杆菌Τ-l活菌数量、芽孢数与时间的关系
[0059] 地衣芽孢杆菌Τ-l活菌数量、芽孢数与时间之间的关系，由图可知随着培养时间 的延长，在〇?4h内活菌数生长较慢，处于停滞期；而后迅速生长，这一阶段是对数生长 期，菌体数量急剧增多，活菌数迅速提高，24h活菌数依然快速增长，说明还没有到达稳定 期；芽孢数量在0?4h增长缓慢，4h后芽孢量逐渐增多，24h芽孢量也是继续快速增长，说 明还未到达稳定期（图7)。
[0060] 以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何 不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的 保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
【权利要求】
1. 一种具有群体感应抑制作用的芽孢杆菌，其特征在于所述的芽孢杆菌为具有与保藏 号为CCTCCNO :M2014049的地衣芽孢杆菌95%同源性的地衣芽孢杆菌；优选的，所述的芽孢 杆菌为保藏号为CCTCCNO :M2014049的地衣芽孢杆菌或其直接传代物。
2. 根据权利要求1所述的芽孢杆菌，所述的具有群体感应抑制作用的芽孢杆菌来源于 养殖塘底泥或异育银鲫肠道。
3. -种芽孢杆菌制剂，其特征在于含有有效量的上述芽孢杆菌。
4. 根据权利要求3所述的芽孢杆菌制剂，所述的芽孢杆菌制剂为液体制剂或固体制 剂。
5. 上述芽孢杆菌制剂在水产养殖中的应用。
6. 上述芽孢杆菌制剂在制备水产养殖抗菌制剂中的应用。
【文档编号】C12N1/20GK104195060SQ201410149206
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年4月15日 优先权日:2014年4月15日
【发明者】宋增福, 陈彪, 张庆华, 徐华东, 郭婧 申请人:上海海洋大学