一种鹅突变型oaz1基因真核表达载体的构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种鹅突变型OAZ1基因真核表达载体的构建方法。步骤为：应用定点突变技术，设计引物P3、P4和P5、P6，PCR扩增获得缺失掉+175位碱基的鹅突变型OAZ1基因；设计引物P7和P8，PCR扩增获得5'端含有kozak序列的鹅突变型OAZ1基因；酶切含有kozak序列的突变型OAZ1基因及pEGFP-N1骨架载体，连接酶切产物，转化至E.?coli?DH5α中，获得突变型OAZ1基因的真核表达载体。应用本发明可快速获得+175位碱基缺失的突变型OAZ1基因，并可构建突变型OAZ1基因的真核表达载体，使OAZ1表达不再受细胞内游离多胺调控而直接表达全长功能蛋白质。
【专利说明】—种鹅突变型0AZ1基因真核表达载体的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于突变型OAZl真核表达载体的构建方法，其具体步骤包括OAZl基因的CDS区的获得；0AZ1基因+175位碱基的定点缺失以及突变型OAZl基因的pEGFP-Nl真核表达载体的构建。
【背景技术】
[0002]多胺(主要包括腐胺、亚精胺和精胺)是一类带有两个或两个以上氨基的低分子脂肪族化合物，它在几乎所有的真核细胞生物体内都存在。在生理pH下，多胺呈高密度的阳性电荷，它们能与带有大量负电荷的DNA、RNA和蛋白质等生物大分子结合并发挥其调控作用。多胺可参与调控基因表达和翻译、细胞增殖、细胞信号转导、细胞膜稳定等生命活动过程，并且能够调节某些阳离子通道的活性。多胺被认为是一种生长素，细胞内多胺浓度降低可抑制细胞的增殖并使细胞停留在G1期；而细胞内多胺含量过多，也可使细胞过度增殖诱导癌变。所以，细胞中多胺的浓度受到机体的精密调控。鸟氨酸脱羧酶抗酶(ornithinedecarboxylase antizyme, 0AZ)能抑制多胺合成过程中的第一限速酶鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase, ODC)的活性,并能抑制多胺转运体的活性,对体内多胺合成代谢的调控有至关重要的调控作用。
[0003]OAZl基因是最早发现的依靠翻译阅读框的转换来正确解码的哺乳动物基因。OAZl的开放阅读框(open reading frame, ORF)由重叠的ORFl和0RF2组成，ORFl含有起始密码子和终止密码子，编码非保守的多肽链；而0RF2只含有终止密码子，编码高度保守的多肽链。OAZl mRNA翻译 需要一个+1移码过程。四川白鹅OAZl基因的cDNA序列包含652 bp的完整编码区序列，其ORFl (由58个氨基酸组成)与0RF2 (由158个氨基酸组成)间的+1移码位点位于第I个起始密码子ATG后的第175位T碱基。研究表明，多胺和部分多胺类似物能通过一个特殊的调控机制调节OAZl功能蛋白质的合成。当细胞内多胺浓度较低时，核糖体解码至ORFl的5’端终止密码子TGA处终止翻译，合成无抗酶活性的多肽链。当细胞内多胺浓度较高时，核糖体解码至ORFl的5’端终止密码子处，翻译框架+1移码，核糖体越过ORFl的终止密码子中的T，以0RF2的指导进行翻译，合成由全部227个氨基酸残基组成的OAZl全长功能性蛋白质。可见，在体外，为获得表达OAZl全长功能蛋白的真核表达载体必须先将OAZl基因的+175位碱基定点缺失。因此，我们通过定点突变技术获得了 +175位碱基缺失的突变型OAZl基因，并构建了突变型OAZl基因的真核表达载体，应用本发明可在体外获得OAZl全长功能蛋白质，这将为OAZl基因功能以及多胺代谢分子调控机制的研究奠定基础。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于定点缺失鹅OAZl基因⑶S区+175位碱基，并构建能够表达OAZl基因全长功能蛋白质的真核表达载体pEGFP-Nl-OAZl-mutation。
[0005]为实现上述目的，本发明的技术方案为:根据本实验室前期获得的四川白鹅OAZl基因的CDS区序列，采用Primer 5.0软件设计能扩增获得OAZl基因的CDS区序列的引物Pl (TGCGGGGTGTTCAAGATGT)和 P2 (GAGGGAGAGGACCTGCAAAC)。
[0006]提取四川白鹅卵巢组织的总RNA，并反转录成cDNA，用PI (TGCGGGGTGTTCAAGATGT )和P2 (GAGGGAGAGGACCTGCAAAC)引物进行PCR扩增，扩增条件为:95°C预变性3 min ；95°C变性10 sec，60°C退火30 sec，72°C延伸30 sec，35个循环；72°C延伸10 min，获得鹅野生型OAZl基因。
[0007]胶回收PCR产物，连接胶回收产物至pMD19-T载体中，再转化至疋co7iDH5a中，提取质粒，获得野生型OAZl载体质粒,命名为plasmid-OAZl-wild。
[0008]设计缺失OAZl 基因 +175 位碱基的引物 P3 (TGGTGCTCCGATGTCCCTCACC)和 P4 (GGATCTTCCAGAGATTGAGCTCATGGTGAAATCCTCCCTGC),P5 (TGAGGGACATCGGAGCACCACCG)和 P6 (CTGCCGTTCGACGATTAAGCTTCTATTCTTCTTCTGATGTCTC)。以 plasmid-OAZl-wild 为模板，PCR 扩增出产物I (209 bp)和II (511 bp)，PCR扩增条件为:98°C变性10 sec，55°C退火10 sec,72°C延伸30 sec，30个循环；72°C延伸10 min。胶回收产物I和II，再用In-Fusion? HDCloning Kit试剂盒连接胶回收产物到pMD19-T载体中，连接条件为:50°C水浴15 min，再转化至疋coli DH5a中，提取质粒，获得缺失OAZl基因+175位碱基的突变型OAZl基因载体质粒，命名为:plasmid-OAZ 1-mutation。 [0009]设计引物P7 (ATCGAGCTCGCCGCCACCATGGTGAAATCCTCCCT)和 P8 (GGAAGCTTTTCTTCTTCTGATGTCTCTCTCTCAAACG )以 p lasmid-OAZ 1-mutation 为模板，扩增出含 kozak 序列(GCCGCCACC)并去除OAZl终止密码子的基因片段(674 bp)，PCR扩增条件为:94°C预变性2min;94°C变性 30 sec，55°C退火 45 sec，68°C延伸 3 sec，30 个循环；68°C延伸 10 min，连接PCR产物至pMD19-T载体，转化至疋coli DH5 α中，提取质粒，获得带有kozak序列的突变型 OAZl 基因质粒,命名为:plasmid-OAZl-mutation-kozak。
[0010]双酶切plasmid-OAZl-mutation-kozak 和 pEGFP-Nl 骨架载体，之后用 T4 酶连接酶切产物，将连接产物转化至疋coli DH5a中，获得真核表达载体质粒，命名为pEGFP-Nl-OAZ1-mutation。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1四川白鹅OAZl基因扩增凝胶电泳图。图中Marker条带对应的长度为:2000bp,1000 bp,750 bp,500 bp,250 bp,100 bp。
[0012]图2定点突变引物P3和P4，P5和P6的PCR产物凝胶电泳图。图中Marker条带对应的长度为:2000 bp, 1000 bp, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp ;产物 I (209 bp)为定点突变引物P3和P4的PCR产物;产物II (511 bp)为定点突变引物P5和P6的PCR产物。
[0013]图3野生型OAZl基因与缺失+175位碱基的突变型OAZl基因测序图。
[0014]图4含有kozak序列的突变型OAZl基因和载体pEGFP-Nl酶切产物电泳图。图中I为pEGFP-Nl酶切产物；2为含有kozak序列的突变型OAZl基因酶切产物，3为DNA LadderMix，条带对应的长度为 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp,900 bp,1000 bp,1200 bp,1500 bp,2000 bp,2500 bp,3000 bp,3500 bp,4000 bp,5000 bp,6000 bp,8000 bp,10000 bp。
[0015]图5突变型OAZl基因真核表达载体阳性菌落菌液PCR凝胶电泳图。图中I为阳性菌落PCR产物，2为DNA Ladder Mix，条带对应的长度为100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp,500 bp,600 bp,700 bp,800 bp,900 bp,1000 bp,1200 bp,1500 bp,2000 bp, 2500 bp,3000bp,3500 bp,4000 bp,5000 bp,6000 bp,8000 bp,10000 bp。
【具体实施方式】
[0016]以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明的范围仅限于下述实施例。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0017]若未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0018]仪器与试剂。
[0019]微量加样枪(Eppendorf, Germany);恒温水浴锅(KS-8, China);冷冻离心机(Eppendorf, Germany);电泳槽(北京六一，DYY_m);电泳仪(北京六一，DYY-1OC);Min1-Protean?3cell 型凝胶成像系统(Bio-Rad);S1000?Thermal Cyler PCR (Bio-Rad)仪蛋白质核酸测定仪(德国，Eppendorf );Allegra2?lR型高速冷冻离心机(Thermo);_20° C低温冰箱(中国，海尔)；超纯水系统(美国MILLIPORE，F4PN84631) ;SS_325高压灭菌锅(Ibmy, Germany) ；PCR 仪(美国，BIO-RAD) ；Sff-CJ-2FD 超净工作台(苏州，中国)；_80。C超低温冰箱(Thermo Electron Corporation, USA)；恒温水浴锅(Thermo ElectronCorporation, USA) ;HQL150C恒温摇床(武汉，中国),摇床(Thermo, Germany),细菌培养箱(Thermo, Germany)；
Trizol RNA提取试剂,M-MLV反转录试剂盒,In-Fusion? HD Cloning Kit,胶回收试剂盒，DEPC, Trypton, Yeast Extract, X_gal, IPTG, T4 连接酶，Sac I 限制性内切酶，DH5a 感受态细胞，质粒提取试剂盒，Hind III限制性内切酶，Prime STAR? HS DNA聚合酶，pMD19_TVector,DNA A-Tailing Kit,DL2000 DNA Maker，琼脂糖，In-Fusion? HD Cloning Kit ；GoldView,以上试剂均购置于Takara大连分公司。
[0020]引物设计:根据本实验室前期研究获得的四川白鹅OAZl基因的CDS区序列，采用
Primer 5.0软件设计能扩增OAZl基因⑶S区序列的引物Pl和P2 (见下表)。根据定点突
变位点要求设计缺失+175位的T碱基的引物P3、P4和P5、P6 (见下表)。为使真核表达载
体pEGFP-Nl-OAZl-mutation能更好的表达OAZl融合蛋白设计引物P7和P8 (见下表)。
【权利要求】
1.一种鹅突变型OAZl基因真核表达载体的构建方法，其特征在于，定点缺失鹅OAZl基因CDS区+175位碱基以及用于定点突变的引物设计为:P3(TGGTGCTCCGATGTCCCTCACC)、P4(GGATCTTCCAGAGATTGAGCTCATGGTGAAATCCTCCCTGC)、P5 (TGAGGGACATCGGAGCACCACCG)和 P6(CTGCCGTTCGACGATTAAGCTTCTATTCTTCTTCTGATGTCTC)。
2.一种鹅突变型OAZl基因真核表达载体的构建方法，其特征在于，在OAZl基因CDS区前加入kozak (GCCGCCACC)序列以增强pEGFP-Nl-OAZl-mutation的翻译效率，去掉OAZl基因的终止密码子使OAZl全长功能蛋白质与荧光蛋白质GFP融合，为达到此目的其引物设计为:P7 (ATCGAGCTCGCCGCCACCATGGTGAAATCCTCCCT)和 P8 (GGAAGCTTTTCTTCTTCTGATGTCTCTCTCTCAAACG)。
3.一种鹅突变型OAZl基因真核表达载体的构建方法，其特征在于，其步骤为: (1)设计引物Pl (TGCGGGGTGTTCAAGATGT)和 P2 (GAGGGAGAGGACCTGCAAAC)扩增鹅 OAZl基因编码区序列，连接至PMD19-T载体中，并转化到疋coli DH5a中，提取质粒，获得野生型OAZl基因编码区序列T载体质粒，命名为plasmid-OAZl-wild ； (2)设计用于OAZl基因⑶S区+175位碱基定点缺失的引物P3、P4和P5、P6，PCR扩增获得产物I和II，将产物I和II连接至PMD19-T载体中，再转化至疋coli DH5 α中，提取质粒，获得突变型OAZl基因的T载体质粒，命名为:plasmid-OAZl-mutation ； (3)设计引物P7 (ATCGAGCTCGCCGCCACCATGGTGAAATCCTCCCT)和 P8 (GGAAGCTTTTCTTCTTCTGATGTCTCTCTCTCAAACG), PCR 扩增，使 OAZl 基因 5’ 端前加入 kozak 序列，去除 OAZl基因的终止密码子，胶回收PCR产物，连接胶回收产物至pMD19-T载体中，并转化至疋coli DH5a中，提取质粒，获得 带有kozak序列的突变型OAZl基因的T载体质粒，命名为:PIasmid-OAZ1- mutation—kozak ； (4)酶切plasmid-OAZl-mutation-kozak 及 pEGFP-Nl 骨架载体，用 T4 酶连接酶切产物，再转化至疋coli DH5 α中，提取质粒获得真核表达载体质粒pEGFP-Nl-OAZ1-mutation。
4.根据权利要求1所述的获得鹅OAZl真核表达载体的方法，其特征在于，用于OAZl基因⑶S区+175位碱基定点缺失的引物设计为P3、P4和P5、P6。
5.根据权利要求1所述的获得鹅OAZl真核表达载体的方法，其特征在于，使真核表达载体pEGFP-Nl-OAZl-mutation能够更好表达融合蛋白的引物设计为P7和P8。
6.根据权利要求2所述的获得OAZl真核表达载体的方法，其特征在于，先将OAZl基因⑶S区+175位T碱基定点缺失，然后再构建OAZl基因的真核表达载体。
【文档编号】C12N15/79GK103981208SQ201410184963
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月5日 优先权日:2014年5月5日
【发明者】康波, 姜冬梅, 何珲, 马容, 白林, 王迅, 赵玲 申请人:四川农业大学