乙肝病毒特异性的microRNA样siRNA序列及其用途
【专利摘要】本发明提供针对乙肝病毒S基因的1个microRNA样siRNA的序列即msiHBs的核苷酸序列，及其二级结构。这个msiRNA与报告HBV复制型质粒pHY106+wta共转染HepG2和Huh7细胞后，可抑制HBsAg和HBeAg的表达；msiHBs转染HepG2.2.15细胞后，也可有效抑制HBsAg的和HBeAg表达水平，和上清中HBV病毒载量。另外msiRNA还具有免疫刺激活性，可以通过Toll样受体通路活化天然免疫。因此，这个msiRNA，具有抑制HBV基因表达和复制及免疫刺激双重活性，可在制备HBV慢性感染的治疗药物中应用。
【专利说明】乙肝病毒特异性的microRNA样s iRNA序列及其用途
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程【技术领域】，涉及乙肝病毒特异性的microRNA样siRNA序列及 其用途。
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎病毒（HepatitiSBViruS，HBV)感染是导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞肝 癌的重要原因之一。我国现有慢性HBV感染者约9300万，对乙型肝炎的防治研究一直是医 疗卫生科研的重要领域。迄今，对HBV感染仍缺乏长期有效的抗病毒药物。干扰素（IFN- α ) 和核苷（酸）类似物治疗虽然可以取得一定疗效，但是仍存在持续应答率较低，有一定副作 用以及长期应用易产生耐药性等问题。研究表明，慢性乙肝患者免疫系统不健全、免疫细胞 应答数量和质量的不足，加上病毒颗粒和抗原的耐受原作用等因素形成HBV特异性免疫耐 受，这种免疫耐受是导致HBV持续感染和久治不愈的重要根源，仅仅抑制病毒复制难以清 除HBV感染。多样性、强大的特异性免疫是控制HBV感染的关键因素。因此，新的抗HBV治 疗策略应该是：一方面高效抑制HBV基因表达和复制以清除"耐受原"，另一方面诱导并增 强天然免疫和HBV特异性免疫应答以达到控制甚至清除HBV感染的目的。
[0003] 抗病毒和免疫调节的联合治疗是公认的研究方向，但是方案还不成 熟。如何活化肝脏天然免疫，尽可能降低病毒抗原和病毒颗粒的水平，以恢复或 诱导HBV特异性免疫应答，可能在控制HBV感染方面发挥重要作用。microRNA样 siRNA(microRNAlikesiRNA, msiRNA)是在siRNA的信使链引入非配对的类似microRNA的尿 啼陡（uracil,U)环状突起，这种结构修饰既增加了 siRNA序列中U的数目，又降低了 siRNA 双链的亲和力，因而既具有很强的免疫刺激活性，又保持高度的RNAi活性。msiRNA首先可 以与内体中丰富的Toll样受体（Tolllikerec印tor，TLR)7/8结合，触发IFN通路，活化免 疫应答；然后随着内体的裂解，msiRNA被释放到胞浆后，一方面可以触发RIGI通路，进一步 活化天然免疫；另一方面进入RNAi通路，发挥直接的抗病毒作用；再者，乙肝病毒RNA降解 产物又可以通过TLR3、TLR7/8,以及PKR等通路进一步活化细胞天然免疫；最后，病毒抗原 表达的阻断还可以部分解除抗原特异性免疫耐受。msiRNA的免疫刺激和抗病毒双重活性， 一方面肝脏天然免疫，诱导增强毒特异性免疫应答；另一方面发挥直接的病毒抑制作用，在 乙型肝炎病毒慢性感染个体内打破病毒特异性免疫耐受中发挥重要作用，有可能开发为全 新的乙型肝炎治疗方案。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供乙肝病毒特异性的miRNA样SiRNA序列及其用途，为乙型 肝炎的治疗提供双活性的siRNA，为打破HBV特异性免疫耐受提供新的技术方法，在此基础 上可开发为全新的乙型肝炎治疗方案。
[0005] 序列1为HBVS基因特异性msiRNA的sense链序列：
[0006] 5, -GAAUCCUCUUUUUACCGCAtt-3,，和
[0007] antisense: 3' -ttCUUAGGAGUGUUAUGGC⑶-5'。
[0008] 进一步，乙肝病毒特异性的microRNA样siRNA的二级结构如下：
[0009]
【权利要求】
1. 乙肝病毒特异性的microRNA样siRNA序列，其特征在于： 序列1为HBVS基因特异性msiRNA的sense链序列： 5, -GAAUCCUCUUUUUACCGCAtt-3,，和 antisense:3' -ttCUUAGGAGUGUUAUGGCGU-5'。
2. 按照权利要求1所述乙肝病毒特异性的microRNA样siRNA序列，其特征在于：乙肝 病毒特异性的microRNA样siRNA的二级结构如下：
【文档编号】C12N15/113GK104059916SQ201410269570
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月17日 优先权日:2014年6月17日
【发明者】孟忠吉, 张永红, 陈悦 申请人:湖北医药学院附属太和医院