中温酸性淀粉酶Amya及其基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及中温酸性淀粉酶Amya及其基因和应用，其具有如SEQ?ID?NO.1或2所示的氨基酸序列。本发明的淀粉酶具有以下性质:Amya的最适作用pH为4.5，在pH4.5-5.5能保持80％以上的酶活；在pH范围为4-10间都很稳定；最适作用温度60℃；在50℃和55℃条件下，Amya热稳定性良好。
【专利说明】中温酸性淀粉酶Amya及其基因和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体涉及中温酸性淀粉酶Amya及其基因和应用。
【背景技术】
[0002]淀粉酶(Amyalase, E.C.3.2.1.1),是可对支链淀粉、直链淀粉或其他葡聚糖分子内部糖苷键以随机的方式进行水解，生成长度不等的直链和支链寡糖的一类酶的总称(Gupta R et al.2003)。淀粉酶的来源非常广泛，包括动物植物和微生物，其中微生物来源的淀粉酶具有来源丰富性能多样和易于工业化生产的特点，可满足多种工业应用需求，在工业上的应用也最为广泛(Gupta R et al.2003, Swetha S et al.2006)。在现代工业的淀粉质处理过程中，微生物淀粉酶的水解方法已经彻底取代传统的化学水解方法(van derMaarel MJ et al.2002)。虽然有多种微生物可以产生淀粉酶，包括丝状真菌酵母、细菌和放线菌等。但是，目前能够满足工业应用需求的淀粉酶主要来源于细菌和丝状真菌(GuptaR et al.2003)，其中由真菌产生的淀粉酶即称为真菌淀粉酶。
[0003]与大多数淀粉酶类似，真菌淀粉酶通常含有三个结构域，分别称为A、B和C。结构域A为酶的催化反应中心区域，其典型结构为(α / β ) 8桶状结构，结构域B和结构域C基本上位于结构域的对立两端(Jens et al.2000)。目前工业上应用的真菌淀粉酶几乎全部来源于丝状真菌中的曲霉属微生物，如黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillusoryzae)等。随着基因工程技术的广泛应用，很多糖化酶基因已被克隆并进行了异源表达。报道的淀粉酶多属于糖苷水解酶13家族。已报道有多种淀粉酶基因在不同宿主中得到表达，其中真菌淀粉酶基因的异源表达主要集中在真核表达系统。
[0004]真菌淀粉酶从20世纪50年代开始相继在英国和美国作为食品添加剂应用于面包生产行业，在现代的淀粉糖浆、焙烤制品、啤酒酿制和生料酒精等行业已得到广泛的应用随着现代制糖工业与发酵工业的发展及其对真菌淀粉酶的使用需求，使得真菌淀粉酶在现代工业酶制剂中占有显著地位。但淀粉酶表达一直也是一难题。真菌来源的淀粉酶主要集中在真核表达系统，如:A.0ryzae分别在B.brevis HPD31 (Shogo et al.1993)、
S.cerevisiae (Kasper et al.2004)> S.kluyveri(Kasper et al.2004)和 Baker’syeast (Randez et al.1995)中得到了表达。
[0005]不同微生物所产生的淀粉酶的pH适性、耐热性、催化特性等也不相同。目前对淀粉酶性质的测定主要集中在最适温度和最适PH值的研究上，工业上应用的淀粉酶主要来源于芽孢杆菌，多是应用它的耐高温。而大多数真菌淀粉酶的最适反应PH值为
4.5-5.5,在酸性条件下稳定,最适反应温度为40-60°C,分别来源于Aspergillus oryzaeATCC76080 (Chang CT et al.1995, B1chem Mol B1l Int.36:185 - 193)、Sclerotiniasclerot1rum(Imen et al.2008, J.Microb1l.B1technoll8:1555 - 1563)、Fusicoccumsp.BCC4124 (Champreda V et al.2007, B1sci B1technol B1chem71:2010 - 2020)等，但该酶的pH稳定区间较宽，且最适作用温度和pH与糖化酶的最适最适作用条件(4.0-4.5，60-650C )相当，可完成一步酶法制糖。
[0006]筛选耐热淀粉酶或克隆表达耐热淀粉酶基因，提高淀粉酶的耐热性，会使淀粉制糖过程简化，从而降低能源消耗及生产成本，将给淀粉酶在工业中的应用开辟更为广阔的前景，具有重要的商业价值。
【发明内容】
[0007]本发明目的是提供一种中温酸性淀粉酶。
[0008]本发明的再一目的是提供上述编码上述淀粉酶的基因。
[0009]本发明的再一目的是提供包含上述淀粉酶编码基因的重组载体。
[0010]本发明的再一目的是提供包含上述淀粉酶基因的重组菌株。
[0011]本发明的再一目的是提供一种制备中温酸性淀粉酶的方法。
[0012]本发明的再一目的是提供上述中温酸性淀粉酶的应用。
[0013]本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种中温、酸性的性质优良的新酶。本发明人从Talaromyces emern1nii得到一个新的中温、酸性、作用pH广的淀粉酶。它所产生的淀粉酶适合于在葡萄糖、麦芽糖、麦芽四糖糖浆、不规则连接低聚糖混合物和高分子量支链糊精的生产以及纺织和废水处理等多个行业中使用。
[0014]本发明从上述菌株中获得了一种中温酸性淀粉酶Amya，其氨基酸序列如SEQ IDN0.1所示:
[0015]
IMKLPLFIAST ALTSAVLAAD AADffRSRSIY QLLTDRFSRP DGSTTAPCVT
51EDRRYCGGTF QGIIKQLDYI QRMGFTAIWI SPVTHQLEGR TPYGEAYHGY
101WQQDLYKLNS HFGSPDDLRE LAEELHRRDM YLMLDVVVNH NGffNGSASTV
151DYSVFHPFNK KEYYHDYCPI LDWSNQTQVE DCWIGDNLVS CPDLYTQHPH
[0016]
201VRREYQSWIS DLVRDYSVDG LRIDTAREVE KDFFLGFVSA SGVFATGEVM
251VNDANEACPY QPYLGSFLNY PAYYSLIDAF KSPSGNISSL VNQINLVKST
301CLDTTVLGSF SENHDiNPRFA NYTADLSLAK NVIAFTMLAD GIPIIYAGQE
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401KNQPIYSDST TLAMRKGFDG QQVITVLSNL GTSGPKYVLS LGNTGYQRGQ
451ELVEVLTCTH VTVDDNGNVP VQMEQGLPRV FYPEHQLRGS GLCDL*
[0017]其中，该酶蛋白全长495个氨基酸和一个终止密码子，N端18个氨基酸为信号肽序列 “MKLPLFIASTALTSAVLA”。
[0018]因此，成熟的淀粉酶Amya的氨基酸序列如SEQ ID N0.2:
[0019]
【权利要求】
1.一种中温酸性淀粉酶Amya，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1或SEQ IDN0.2所示。
2.一种中温酸性淀粉酶基因Amya，其特征在于，编码权利要求1所述的淀粉酶。
3.如权利要求2所述的中温酸性淀粉酶基因Amya，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.3、SEQ ID N0.4 或 SEQ ID N0.5 所示。
4.包含权利要求2所述的中温酸性淀粉酶基因Amya的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体pPIC9-Amya。
6.包含权利要求2所述中温酸性淀粉酶基因Amya的重组菌株。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母细胞、酿酒酵母细胞、大肠杆菌、曲霉或木霉细胞。
8.一种制备中温酸性淀粉酶Amya的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)用权利要求4重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2)培养重组菌株，诱导重组淀粉酶的表达； 3)回收并纯化所表达的中温酸性淀粉酶Amya。
9.根据权利要求1 所述中温酸性淀粉酶Amya的应用。
【文档编号】C12N15/56GK104130989SQ201410302766
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年6月27日 优先权日:2014年6月27日
【发明者】姚斌, 罗会颖, 华慧芳, 石鹏君, 黄火清, 王亚茹, 柏映国, 杨培龙, 孟昆, 师霞 申请人:中国农业科学院饲料研究所