解淀粉芽孢杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了解淀粉芽孢杆菌及其应用。该解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）SWJS22于2013年11月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?No.8425。经单因素实验优化了解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）SWJS22产蛋白酶的条件，其培养、发酵条件简单，遗传性质稳定，并且该菌株分泌的蛋白酶在较低温度和碱性环境中的稳定性较好，在制革、洗涤和食品等行业中有着广泛的用途。
【专利说明】解淀粉芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及深海中微生物筛选及发酵领域，具体涉及解淀粉芽孢杆菌 SWJS22及其液体发酵产蛋白酶的方法。
【背景技术】
[0002] 海洋是生命之源，人类物质资源的天然宝库。它覆盖着地球表面积的71%，海水总 体积占地球总水量的97%，生物量约占地球生物总量的80%，生物种类20万种以上，蕴藏着 丰富的资源。为了寻求更广泛的微生物及活性物质资源，人类将目光投向了海洋，期望寻求 到符合要求的新型菌株及蛋白酶。其中，由于微生物几乎能分泌所有现今已知的酶类，并且 微生物来源的酶制剂，相比于木瓜、猪胰脏等动植物来源的酶制剂有其不可替代的优势，因 此对微生物菌株及其活性物质的利用已成为了研究的热点。
[0003] 蛋白酶（Protease)属于水解酶类，是最重要的三大工业用酶之一，销售额约占全 球酶制剂市场的60%。如今，在酶类市场中，在碱性条件下具有稳定活性的碱性蛋白酶占据 了最大的份额。其应用已经深入到食品、酿造、医药、纺织、皮革、日用化学、洗涤剂、饲料以 及水产加工等多个行业，对国民经济的发展起着重要的作用。目前，已被结晶和纯化的蛋白 酶超过100种。
[0004] 正是由于海洋中所具有的低温、高盐、高压的环境，使得海洋中的微生物及其所产 的胞外酶具有陆生微生物所不具备的特性。通常，海洋微生物所产酶具有作用pH范围宽， 最适pH和反应温度适中，温度对蛋白酶活力影响小等特点。因此，从中国南海的深海海泥 中筛选出了能分泌特殊性能或研究价值较高的蛋白酶的微生物菌株，并探讨了其发酵性能 和条件。
【发明内容】
[0005] 本发明目的之一是提供了一种解淀粉芽孢杆菌
[0006] 本发明目的之二是提供了一种解淀粉芽孢杆菌r&ciBm SWJS22在液体发酵生产蛋白酶的应用。
[0007] 本发明中可生产蛋白酶的深海菌株，为解淀粉芽孢杆菌 SWJS22,该菌于2013年11月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所， 保藏编号为CGMCCNo. 8425。
[0008] 对保藏号为CGMCC No. 8425的菌株进行形态学及生理生化鉴定，有以下特征： (1)菌落形态：白色，形状不规则，表面有颗粒感，乳头状凸起，不透明，边缘呈波状；（2)细 胞形态：直杆状，链状排列，周生鞭毛，革兰氏阳性；（3)生理生化特征：可在4-40°C环境中 生长，好氧，能耐受7% (wt)氯化钠，能水解明胶、淀粉、酪素、柠檬酸盐，能利用硫酸铵、硝酸 铵，可利用果糖、葡萄糖、甘露醇、木糖为碳源，吲哚反应、V. P.反应、甲基红试验、接触酶和 氧化酶试验为阳性，能产过氧化氢酶，不产硫化氢。
[0009] 保藏号为CGMCC No. 8425菌株经16S rDNA鉴定，测得基因片段长度为1449bp， 具体基因序列见序列表1。将获得的基因序列输入Genbank，应用Blast程序将获得 的基因序列与数据库中基因序列进行对比。结果显示与解淀粉芽孢杆菌 的16S rDNA序列同源性为99%。将此结果结合菌株形态学及生理生 化鉴定特征，确定该菌为解淀粉芽孢杆菌入
[0010] 保藏号为CGMCC No. 8425菌株通过单因素试验对其液体发酵产蛋白酶条件进行 了优化。
[0011] 本发明与现有技术相比，具有如下优点和技术效果：本发明公开了解淀粉芽孢杆 菌rifeciBws 产蛋白酶的条件，其培养、发酵条件简单，遗传性 质稳定。由于该菌株来源于深海，所分泌蛋白酶具有特殊的性质，并且关于该菌株的文献报 道较少，在开发新型深海菌株及酶制剂的研究中，具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1为不同种子液培养时间对解淀粉芽孢杆菌 SWJS22产蛋白酶的影响曲线。
[0013] 图2为不同装液量对解淀粉芽孢杆菌职e/aciea^SWJS22产 蛋白酶的影响曲线。
[0014] 图3为不同发酵温度对解淀粉芽孢杆菌SWJS22 产蛋白酶的影响曲线。
[0015] 图4为不同发酵时间对解淀粉芽孢杆菌r&ciBiAs SWJS22 产蛋白酶的影响曲线。
【具体实施方式】
[0016] 富集及种子培养基：蛋白胨5g，酵母膏lg，硫酸铁0· lg，人工海水1L，ρΗ7· 6-7. 8。
[0017] 酪蛋白培养基：酪蛋白l〇g，牛肉浸粉3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2g，琼脂15g，去 尚子水 L，ρΗ7· 3-7· 5。
[0018] 发酵培养基：麦芽糖5g，酵母粉10g，氯化钙2. 8g，氯化钠 lg，SE170 1. 5g，去离子 水 1L，ρΗ7· 5。
[0019] 编号CGMCC No. 8425菌株的分尚、筛选 细菌的富集：取少许海泥于含无菌去离子水的锥形瓶中，加入粒无菌玻璃珠，37°C、 150rpm摇床中分散30min。吸取lml上清液接种于富集培养基中（25ml/250ml)，37°C、 150rpm摇床中培养24h。
[0020] 初筛：取lml富集液适当稀释后涂布于酪蛋白培养基上。若细菌产蛋白酶，在菌落 周围出现透明水解圈，根据水解圈直径（D)与菌落直径（d)的比值（D / d)大小确定产蛋 白酶能力较强的菌株。
[0021] 分离纯化：挑取D / d比值较大的菌株，连续划线分离三次以上，得纯培养物。将 其于接种于斜面上，4°C保藏。
[0022] 复筛：将上述保藏的菌株接种于种子培养基中，37°C，150r/min，活化12h后，以1% 的接种量接种于发酵培养基中（25ml/250ml )，发酵培养48h。将发酵完成液于4°C，lOOOOr/ min条件下高速离心lOmin，过滤得上清液，即粗酶液。采用福林-酚法测发酵液中性蛋白 酶酶活，筛选出酶活较高的菌株。
[0023] 编号CGMCC No. 8425菌株的鉴定 将活化的编号CGMCC No. 8425的菌株接种于L-B培养基中，37°C，150r/min培养12h， 经L-B培养液传代培养2-3次后，取1. 5mL对数生长末期的菌体培养物，4°C，10000r/min离 心5min，收集菌体，去尽培养液。菌体经SDS及蛋白酶K裂解、酚-氯仿-异戊醇抽提、转 移上清、0. 6倍体积异丙醇析出DNA沉淀后短暂离心、70%乙醇洗涤、TE溶解模板DNA。电 泳检测后采用通用引物进行PCR (正向引物：5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物： 5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。
[0024] 扩增总反应体系为（20 μ L):模板基因 DNA 0. 5 μ L ;上下游引物（20 μ mol/1)各 1. 0 μ L ;Taq DNA 聚合酶 0· 2 μ L ;10Xbuffer 2. 0 μ L ;4 种脱氧核苷酸混合物 dNTP (各 2. 5 臟〇1/1)1.6 4 1^，25臟〇1/1]\%(：12 1.6 4 1^，双蒸水（(1(1!120)12.14 1^。？0?扩增条件：951：5 min;95°C 30 s;55°C 30 s;72°C 1.5 min;72°C 10 min;10°C，共 30 个循环。PCR产物纯 化后完成测定的16S rDNA基因基因片段长度为1449bp，与 sirai/75·相似性最高，同源性达99%，具体序列见序列表。结合菌株形态学、生理生化特征， 判定编号CGMCC No. 8425的菌株为解淀粉芽孢杆菌r&ciBm 职e/acieas)。
[0025] 海水芽孢杆菌CGMCC No. 8425液体发酵产蛋白酶条件优化 种龄的优化：将菌株接种于种子液中，37°C，150r/min，分别培养4h、8h、12h、16h、24h 后，接种于发酵培养基发酵48h，测定其酶活。结果见图1。种龄对发酵液中蛋白酶活力无 显著影响。
[0026] 摇瓶装液量的优化：采用250ml锥形瓶进行摇瓶发酵，装液量分别为10%、20%、 30%、40%、60%、80%，在371：，1501'/1^11条件下发酵4811。测定发酵液中蛋白酶酶活，结果如图 2, 装液量为10%时酶活最高，随着装液量的增加，蛋白酶活力下降较快。
[0027] 发酵温度的优化：将发酵液分别置于25°C、30°C、37°C、40°C、45°C、5(rC^，150r/ min，装液量为10%，发酵培养48h。测其发酵液中蛋白酶酶活，结果如图3,在37°C的环境中 发酵，发酵液中蛋白酶活较高。
[0028] 发酵时间优化：将接种后的装液量为10%的发酵液放于37°C，150r/min，培养72h， 每隔6h取样，测其蛋白酶酶活。结果如图4,蛋白酶活在54h时达到最大，随着时间进一步 延长，酶活力有较小幅度下降。
[0029] 编号CGMCC No. 8425菌株的遗传稳定性 表1
【权利要求】
1. 一株解淀粉芽抱杆菌Cfeci77^s*湖?j7c>7i识A9/^i<9/?6〇SWJS22,该菌于2013年11月 1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 8425。
2. 权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌在液体发 酵生产蛋白酶的应用。
【文档编号】C12N1/20GK104140939SQ201410349296
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月22日 优先权日:2014年7月22日
【发明者】崔春, 周池虹伶, 赵谋明, 赵强忠 申请人:华南理工大学