重组人成纤维细胞生长因子-20的基因克隆、表达及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种表达和生产FGF-20的方法。通过生物信息学手段优化设计合成FGF-20核苷酸序列全长，将其与pET系列载体相连接，并将该表达载体连接导入适当的大肠杆菌宿主细胞中，通过筛选获得表达量高且稳定遗传的工程菌株，并建立了高密度发酵方法和包涵体表达FGF-20的纯化方法及建立相应质量检测方法，使大规模生产rhFGF-20成为可能。在此基础上，进一步探讨FGF-20在组织修复、退行性神经系统疾病中的临床应用及其在肿瘤发生、发展及迁移中的作用。
【专利说明】重组人成纤维细胞生长因子-20的基因克隆、表达及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种优化的生产成纤维细胞生长因 子-20 (FGF-20)的方法，以及用于该方法的表达载体、宿主，表达、纯化方法及可能的临床 应用。
【背景技术】
[0002] 成纤维细胞生长因子（Fibroblast Growth Factor, FGF)是一类广泛存在于多种 组织中的多肽细胞生长因子，目前已发现23个成员，分子量为16kD?34kD，其中心区域含 有高度同源性（30%?70% )的大约120个氨基酸序列，对来源于中胚层和神经外胚层的 多种类型细胞具有广泛的生物学活性。FGFs在体内含量甚微但分布广泛，其中大多数FGFs 成员与胚胎发育、组织损伤修复、神经保护和营养、肿瘤的发生、发展和转移有密切关系，具 有广泛的应用前景。
[0003] FGF-20是FGF家族的一个新成员，属FGF9亚家族（FGF9、FGF16、FGF20)，是通过 内质网-高尔基体分泌途径产生的，在组织维修和伤口愈合中发挥着重要和广泛的作用， 近年来，研究其在神经系统的保护和治疗及遗传性耳聋疾病的发生成为研发的热点。2000 年，日本科学家Shigeki Ohmachi首次从老鼠大脑中发现FGF-20mRNA在脑组织尤其是小 脑组织黑质致密部表达量最高，预示其是对神经元具有保护作用的一种神经营养因子。人 FGF-20基因定位于人类染色体8p21. 3-p22区域，由3个外显子和2个内含子组成，编码211 氨基酸残基组成的多肽，分子质量约为25kDa，为一种碱性蛋白。人FGF-20与老鼠的氨基 酸序列具有95%的高度同源性。在结构上，FGF20与FGF9、FGF16相似，其同源性分别70% 和62%，均缺乏典型的N端信号序列，都能分泌到细胞外。体外和体内的多项研究表明， FGF-20在分化发育、血管生成、肿瘤形成和其他细胞发育过程中也发挥着重要的作用。
[0004] FGF-20在组织修复方面有良好的应用前景。与大多数FGFs成员相同，FGF-20 能与一系列FGFR特异性结合，具有促上皮和间质细胞有丝分裂的功能。与目前已上市的 FGF-UFGF-2功能相似，可开发成为治疗烧烫伤及慢性溃疡创面的外用药物。同时，经研究 发FGF-20对组织粘膜损伤修复具有良好的功效。JefTers等研究FGF-20对溃疡性结肠炎 和炎症性肠病动物模型的作用，发现预防剂量的FGF-20能有效地减少黏膜损伤的范围和 减轻黏膜损害的严重程度；Alvarez等研究发现，FGF-20对放化疗诱发的口腔粘膜炎同样 具有治疗作用；Maclachlan等研究发现，FGF-20能够明显增加致命剂量电离辐射后小鼠的 生存率。可以预期，FGF-20在溃疡性结肠炎、炎症性肠病、口腔粘膜炎及放疗辐射预防等临 床方向具有巨大的应用前景。目前，美国CuraGen公司研发的新型生长因子FGF-20,已被 FDA批准用于治疗因放疗引起的口腔粘膜炎（OM)的罕见病用药，并已完成I期临床研究。 (Jeffers M et al. Gastroenterology,2002,123(4) :1151-1162 ；Alvarez E et al.Clin Cancer Res,2003,9 (9) :3454-3461 ；Maclachlar T et al. Int J Radiat Biol,2005, 81(8) :567-579 ；Beenken A et al. Nat Rev Drug Discov. 2009Mar ；8 (3) :235-53.)
[0005] FGF-20在帕金森症等退行性神经系统疾病治疗有良好的应用前景。帕金森 症（PD)是一种黑质多巴胺能神经元变性缺失所引起的神经系统退行性疾病，患病率在 10-405/10万之间，是目前一种严重和常见的中老年人神经系统变性疾病，其发病机制中遗 传因素的作用越来越受到人们的重视。临床针对ro患者基因组筛查发现，FGF-20正好位 于与ro关系最密切的8号染色体短臂连锁区域，且其编码的蛋白在正常脑组织中具有明显 的神经营养特性；FGF-20蛋白在正常脑组织尤其是在小脑中有表达，可能对中枢神经系统 的发育具有调节作用；在体外细胞培养中添加 FGF-20可显著提高多巴胺能细胞的存活能 力，促进细胞分化为多巴胺能神经元。这些现象皆提示FGF-20在神经退行性病变过程中 可能发挥重要作用。Ohmachi等将重组FGF-20蛋白作用于小鼠，发现其中脑多巴胺神经元 存活率显著提高而其他神经元的存活率无明显变化，表明FGF-20是一种对多巴胺神经元 具有选择性的神经营养因子；Takagi等研究表明，培养基中添加 FGF-20,可增加 Nurrl细 胞分化成酪氨酸羟化酶阳性表达的神经元的能力，并将其移植到猴子帕金森病模型，行为 学和功能学等均有显著治疗效果；有报道称FGF20和MAOB基因的SNP多态性存在相互作 用，二者同样参与多巴胺生物旁路，在的遗传机制中具有重要意义。可以预期，FGF-20 在治疗帕金森症、阿尔次海墨症等退行性神经系统疾病的治疗具有巨大的临床应用前景。 (Scott WK et al. JAMA,2001,286(18) :2239-2244 ；Jeffers M et al. Cancer Res,2001, 61(7) :3131-3138 ；de Mena L et al. Neurosci Lett,2010,479(I) :22-25 ；Rideout HJ et al. Neurochem,2003,84(4) :803-813 ：Tabares-Seisdedos R et al. Mol Psychiatry, 2009,14(6) :563-589 ；Shigeki Ohmachi et al. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2000,277 :355-360 ；Takagi Y et al. J Clin Invest, 2005,115 (I)： 102-109 ;Gao X et al. Ann Hum Genet,2008,72(pt2) :157-162.)
[0006] FGF-20在肿瘤发生、发展及迁移中的作用。FGF-20在异常表达时能与细胞表面 的酪氨酸激酶型受体 FGFR2a (Illb)、FGFR2a (IIIc)、FGFR2P (IIIb)和 FGFR3a (IIIc) 发生特异性结合，通过MPK途径引起细胞DNA合成以及细胞增殖。值得关注的是，FGF-20 与其他家族成员相比，还具有血管生成源性，参与肿瘤新生血管的形成，在肿瘤的发生发展 中起重要作用。Jeffers等研究表明，将携带有FGF-20的表达载体转入NIH 3T3细胞，发 现细胞形态发生了改变，随后将稳定转染的NIH3T3细胞注射裸鼠，结果均出现快速生长的 肿瘤；Chamorro等做了相反方向的实验，即采用RNA干扰技术封闭FGF-20基因表达，发现 RK3E细胞克隆显著减少，非锚定性生长特征消失，出现接触抑制。进一步实验证实FGF-20 转录水平受到与许多人类恶性肿瘤发生密切相关的Wm/B-链蛋白信号转导通路调节，说 明FGF-20表达与肿瘤形成有密切关系。目前已证实，在绝大多数人肿瘤细胞株中均异常 表达FGF-20,其中在肺癌、结直肠癌和胃癌细胞中异常高表达，并可能是参与肿瘤病理过 程的主要因素，与肿瘤的浸润、转移密切相关，可作为肿瘤诊断和治疗的靶分子具有广阔的 前景。（Engstrom W et al. An ticancer Res，2006,26 (5A) :3307-3310 ;Polnaszek N et al. C ancer Res,2003,63(18) :5754-5760 ；Jeffers M et al. Cancer Res,2001,61(7)： 3131-3138 ；Chamorro MN et aI. EMBO J,2005,24(I) :73-84 ；Katoh M et al. Onco I Rep, 2005,14(1) :287-290 ；Mario N Chamorro et al. The EMBO Journal,2005,24 :73-84.)
[0007] 由于FGF-20的发现对于退行性神经系统疾病、组织修复及肿瘤方面有着重要意 义，其研究以及临床应用的前景口益受到人们的关注。FGF-20作为新型的生长因子，目前国 内外相关报道较少。本申请专利，通过基因优化、表达载体和宿主菌的筛选，进而获得大肠 杆菌的高效表达菌株；利用流加补料的方式建立了规模化的高密度培养技术；优化包涵体 清洗、变性及复性方法，通过阳离子交换柱层析、肝素柱层析（IIeparin Sepharose CL-6B) 或金属离子螯合柱层析（Chelating Sepharose Fast Flow)及其组合,最终获得蛋白纯度 超过95%并具有高生物学活性的？6?-20重组蛋白，为进一步开展？6?-20相关作用机制研 究和新药开发奠定了基础。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种简便并且高效的生产FGF-20的方法。
[0009] 本发明的目的还在于提供含有编码FGF-20基因的载体或质粒。
[0010] 本发明的另一目的是提供用于该方法的表达载体和宿主细胞。
[0011] 为实现上述目的，本发明首先将FGF-20的天然序列按照大肠杆菌偏好性进行优 化，在不改变其氨基酸序列的前提下，设计合成rhFGF-20的全长序列。同时本发明提供 了筛选优化的表达载体和宿主细胞的组合，如pET3a、pET3c、pET28a表达载体及对应的 BL21 (DE3) plysS、Transetta (DE3)宿主细胞，并构建了高效稳定表达的工程菌株。
[0012] 进一步，本发明提供了一种生产重组人成纤维细胞生长因子-20的方法，通过优 化培养基、控制参数及补料流加策略，建立了规模化的高密度培养方法，最后通过柱层析分 离纯化得到高纯度和活性的rhFGF-20。具体包括如下步骤：
[0013] (1)通过改良种子培养基对工程菌进行活化和扩增，接种至发酵罐中通过优化控 制参数及采用流加补料的方式进行规模化的高密度培养，优化诱导时机和诱导时间高效表 达外源蛋白FGF-20 ;
[0014] (2)优化裂解溶液并通过高压均质机进行菌体破碎，低温高速离心弃上清收沉淀； 优化包涵体清洗、变性及复性方法与步骤，并通过中空纤维超滤装置进行初步分离纯化；
[0015] (3)通过柱层析进行精细分离纯化，具体包括：阳离子交换柱层析（SP S^harose Fast Flow或CM Sepharose Fast Flow)、肝素柱层析（Heparin Sepharose CL-6B)或金属 离子螯合柱层析（Chelating Sepharose Fast Flow)及其组合。
[0016] 所述的高密度培养方法是：
[0017] (1)罐内培养基优化：降低底物浓度，优化培养基配伍组成，如降低底物中碳源 含量，添加无机盐、微量元素、促生长因素等营养成分提供全面营养，并保护质粒的稳定遗 传；
[0018] (2)控制参数优化：通过优化诱导前及诱导后关键控制参数，如温度、pH值、溶解 氧、转数及诱导时机和诱导时间等，获得高产量及经济指标合理的生产工艺；
[0019] (3)流加补料方法：优化流加补料的营养成分，采用不同流加补料策略，如变速补 料、DO-stat法或pH-stat法，降低底物对工程菌生长及产物合成的抑制，延长工程菌的对 数生长周期，有效提高产量及表达量，提高了设备有效利用率高、降低生产成本，并对发酵 过程实现了优化控制。
[0020] 本发明具有以下优点：
[0021] (1)通过对FGF-20核苷酸序列进行优化及适宜的表达载体和宿主细胞的组合，获 得高效稳定表达的工程菌株；
[0022] (2)通过建立高密度培养方法，可使FGF-20的表达水平达到菌体总蛋白的25%以 上，菌体产量达70g/L发酵液以上；
[0023] (3)外源蛋白以包涵体形式表达，表达量高且破碎与纯化过程中不易被降解；进 一步建立了包涵体清洗、变性复性和柱层析方法，简化了纯化步骤，提高了蛋白及活性收 率。蛋白收率达150mg/L发酵液以上，蛋白纯度高于95%以上。
[0024] (4)建立了 FGF-20活性测定方法。生物学活性是反映重组蛋白质量及功效的重要 指标，本发明建立了用NIH3T3细胞株进行FGF-20促增殖作用的活性测定方法。实验结果 呈典型的S型曲线，并在一定范围内具有剂量依赖性，显示出良好的重复性和可靠性。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图lpET3c_FGF20重组载体图
[0026] 图 2pET28a_FGF20 重组载体图
[0027] 图3FGF-20发酵表达SDS-PAGE电泳分析
[0028] 图4CM柱层析SDS-PAGE电泳分析
[0029] 图5亲和柱层析SDS-PAGE电泳分析
[0030] 图6MTT法测定FGF-20蛋白对NIH3T3细胞的促增殖生物学活性
【具体实施方式】
[0031] 实施例1FGF-20蛋白高效表达工程菌的构建
[0032] 根据GenBank中公布的人FGF-20天然序列（登录号：BC098128. 1)和氨基酸序列， 按照大肠杆菌密码子偏好性进行优化，在不改变氨基酸序列的条件下，设计rhFGF-20的编 码序列引物。通过PCR扩增的方法获得rhFGF-20的全长核苷酸序列。在rhFGF-20优选序 列的5'端与3'端分别加起始密码子和终止密码子，并引入特异性酶切位点Nde I和BamH I，再用NdeI和BamHI双酶切分别处理rhFGF-20基因和表达载体pET3a-c (或pET28a)，37°C 酶切3h?4h后回收相应的片段，用T4DNA连接酶16°C连接过夜，构建重组表达载体（见图 1、图2)。连接产物转化进入大肠杆菌Transetta(DE3)(或BL21(DE3)plysS)，在含有载体 抗性的的LB平板上挑选阳性克隆并进行质粒双酶切鉴定及菌落PCR检定，证实表达序列已 正确插入载体中。委托基因测序公司进行正向、逆向序列分析测定，证实克隆序列与设计序 列完全一致。进行摇瓶培养，诱导后测定目的蛋白表达量占总蛋白25%左右，并进行免疫印 迹（Western Blot)检测呈现阳性反应，证实所表达的重组外源蛋白为FGF-20。进行工程菌 稳定性试验，连续传代50次，检测其质粒稳定性、结构稳定性和表达稳定性，并证实获得了 高效表达、遗传稳定的FGF-20工程菌株，为下一步试验奠定了良好的基础。本工程菌将目 的基因插入含Lac操纵子的诱导的pET系列表达载体中，再转化与表达载体相容的大肠杆 菌宿主菌，可利用IPTG或乳糖进行诱导表达。
[0033] 实施例2FGF-20蛋白高密度培养方法的建立
[0034] 在本发明中，工程菌表达rhFGF-20的发酵条件没有特别限制。可以采用本领域常 规的发酵条件。通常，工程菌在以胰蛋白胨、酵母粉、铵盐等为氮源，葡萄糖、甘油等为碳源， 磷酸盐为缓冲体系组成，并辅以硫酸镁、氯化钠及微量元素和添加维生素作为基础培养基； 并通过控制参数（pH、温度、溶解氧、搅拌速度等）的调节及营养物质的流加，监测发酵液中 的葡萄糖含量和尾气分析，调节产物比生长速率，减少乙酸的积累，延长对数生长周期，显 著提高了菌体产量及表达水平。具体为：将FGF-20工程菌株以I : 200?300接种至LB 培养基中进行活化制备一代种子，培养3h?4h，待A_达到0. 8?I. 0左右，按I : 10? 20的比例接种至含有磷酸盐缓冲对的LB培养基中进行扩增制备二代种子，培养8h?10h， 待八_达到4?8左右，按I : 10?20的比例接种至含有罐内培养基的发酵罐中，以温度 35°〇?371：4!1值6.8?7.0、搅拌转数200印111?600印111、00>25%并辅以营养物质的流 加方式进行培养4h?6h。待A_达到20?25,流加加人诱导剂（IPTG)至终浓度ImM进 行诱导。调节诱导后温度为33°C?35°C、pH值7. 0?7. 2、搅拌转数600rpm?300rpm、D0 > 30%并辅以流加碳源、氮源及磷酸盐缓冲溶液的流加方式进行表达4h?6h。低温高速 离心，菌体-20°C冻存，样品进行SDS-PAGE检测并测定表达量（见图3)。
[0035] 表1各阶段培养基组成
[0036]
【权利要求】
1. 一种源至pET3a-C或pET28a(+)的原核表达载体，其含有编码FGF-20的重组DNA， 其中所述编码FGF-20的核苷酸序列见核苷酸或氨基酸序列表所示。
2. 含有权利要求1所述表达载体的大肠杆菌BL21 (DE3) plysS或Transetta (DE3)。
3. -种生产FGF-20的方法，通过培养权利要求2所述的宿主细胞，并加诱导剂诱导表 达FGF-20，并进一步通过分离纯化获得高纯度的FGF-20蛋白。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤： (1) 通过改良种子培养基对权利要求2所述的工程菌进行活化和扩增，接种至发酵罐 中通过优化控制参数及采用流加补料的方式进行规模化的高密度培养，优化诱导时机和诱 导时间高效表达外源蛋白FGF-20 ; (2) 优化裂解溶液并通过高压均质机进行菌体破碎，低温高速离心弃上清收沉淀；优 化包涵体清洗、变性及复性方法与步骤，并通过中空纤维超滤装置进行初步分离纯化； (3) 通过柱层析进行精细分离纯化，具体包括：阳离子交换柱层析（SP Sepharose Fast Flow 或 CM Sepharose Fast Flow)、肝素亲和柱层析（Heparin Sepharose CL-6B)或金属 离子螯合柱层析（Chelating Sepharose Fast Flow)及其组合。
5. 根据专利权要求1?4所述制备的FGF-20,其特征是，可应用于皮肤或黏膜损伤的 组织修复、治疗帕金森或阿尔次海墨症等退行性神经系统疾病。还可制备成不同制剂，应用 于生物美容及烧烫伤、难愈性溃疡的治疗。
【文档编号】C12N15/70GK104293821SQ201410403065
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年8月13日 优先权日:2014年8月13日
【发明者】田海山, 李校堃, 姜潮, 马吉胜, 赵央, 郑婕 申请人:温州医科大学, 浙江格鲁斯特生物科技有限公司