一种酶法制备(3r,5r)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法
【专利摘要】本发明公开了一种酶法制备(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法，所述方法包括如下步骤：将共表达全细胞、(R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代叔丁酯、辅因子、葡萄糖和缓冲液按一定比例混合，在pH＝5～8、温度为20～45℃下反应，经后处理得到产物。与现有技术相比，本发明所采用的方法操作过程简单、生产效率高、环境友好、生产成本较低且反应转化率及产物光学纯度高，具有良好的工业应用价值。
【专利说明】-种酶法制备（3R, 5R)-6-氰基-3, 5-二羟基己酸叔丁酯的 方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于制药工业生物【技术领域】，具体涉及一种（3R，5R)-6-氰基-3, 5-二羟基 己酸叔丁酯的生物制备方法。
【背景技术】
[0002] 辉瑞公司生产的立普妥自1997年上市以来迅速占领降胆固醇他汀类药物市场， 成为该药物领域和医药界的重磅炸弹药物，迄今上市17年，销售额远超千亿美元。其有效 成分为阿托伐他汀（八1:〇；1^^8丨31:;[11)，而（31?，510-6-氰基-3,5-二轻基己酸叔丁酯是该有效 成分的关键手性中间体，因而此中间体的合成技术受到广泛的研究与关注。目前文献报道 的制备方法主要有化学法和生物法。
[0003] 化学法工艺生产（3R，5R)-6-氰基-3, 5-二羟基己酸叔丁酯是利用硼烷类衍生 物在-70°C下将（R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代叔丁酯不对称还原得到。该工艺需要极端 低温和无水无氧的反应条件，所用的硼烷易燃，能耗严重且产品的立体异构纯度仅为98% (US2009/0216029A1)，不利于工业化生产。
[0004] 生物催化技术以具有底物专一性强、催化效率高、反应条件温和、反应步骤简便及 环境污染小等特点，被广泛用于制备他汀类手性侧链前体。
[0005] 已报道的制备（3R，5R)-6-氰基-3, 5-二羟基己酸叔丁酯的生物法中，大部分均需 要同时使用酮还原酶和葡萄糖脱氢酶，而且都是分开表达、分开加料的，这就使得发酵次数 增加、成本提高，同时也影响生产的使用和效率（W02008042876)。
[0006] 此外，CN103911403公开了一种（3R，5R)-6-氰基-3, 5-二羟基己酸叔丁酯的生物 制备方法，以（R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代叔丁酯为底物，用重组大肠杆菌发酵液作为催 化剂，底物浓度最高只有55克/L，且需添加助溶剂二甲亚砜。该方法采用发酵液直接作催 化剂时发酵液中含有的杂质会对反应带来不利的影响，而且助溶剂二甲亚砜对环境污染较 大，底物浓度过低等，都不利于工业化生产。
【发明内容】
[0007] 为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明公开了一种（3R，5R)-6-氰基-3, 5-二 羟基己酸叔丁酯的生物制备方法。
[0008] 具体工艺路线如下所示：
[0009]
【权利要求】
1. 一种酶法制备（3R，5R)-6-氰基-3, 5-二羟基己酸叔丁酯的方法，其特征在于：将共 表达全细胞、（R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代叔丁酯、辅因子、葡萄糖和缓冲液按一定比例混 合后反应得到产物。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述共表达全细胞为含羰基还原酶（KRED) 与葡萄糖脱氢酶（GDH)的基因工程菌。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述共表达全细胞是由能同时表达羰 基还原酶（KRED)与葡萄糖脱氢酶（GDH)重组基因的大肠杆菌或酵母菌通过发酵培养得到， 其中优选为大肠杆菌。
4. 如权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于：利用所述共表达全细胞直接催化反 应。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述共表达全细胞的浓度为10?300g/L、 所述（R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代叔丁酯的浓度为100?300g/L、所述辅因子的浓度为 0. 005?0. 01g/L、所述葡萄糖的浓度为100?300g/L和所述缓冲液的浓度为10?lOOmM/ L〇
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应在pH = 5?8、温度为20?45°C 下进行。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述辅因子为NAD、NADH、NADP和NADPH的 任意一种或它们的组合，其中优选为NADP。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液或三乙醇胺 缓冲液，其中优选为三乙醇胺缓冲液。
【文档编号】C12R1/19GK104195191SQ201410462724
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】竺伟, 贾翠英, 包蕾, 陈加利, 吴会 申请人:尚科生物医药（上海）有限公司