无血清培养基及其用途和一种猪瘟病毒的培养方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，特别是涉及兽用生物制品工程【技术领域】，更为具体的说是涉及无血清培养及其用途和应用这些培养基的猪瘟病毒的培养方法。本发明以MEM为基础培养基，通过对猪睾丸细胞以及猪瘟病毒的生长、增殖特征研究，利用在基础培养基内添加不同成分，分别得到一系列的猪睾丸细胞无血清培养基、以及不同生长阶段的猪瘟病毒增殖无血清培养基，从而既避免了BVDV及其抗体可能产生的污染风险，同时可以实现ST细胞贴壁生长，且生长迅速、细胞面完整，个体饱满，可以长期传代培养。
【专利说明】无血清培养基及其用途和一种猪瘟病毒的培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，特别是涉及兽用生物制品工程【技术领域】，更为具体的 说是涉及无血清培养及其用途和应用这些培养基的猪瘟病毒的培养方法。
【背景技术】
[0002] 猪瘟（Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒（CSFV)引起的一种高度接触 性传染病，被世界动物卫生组织列为A类动物传染病。目前，我国控制猪瘟疫病的主要手段 是接种猪瘟兔化弱毒（HCLV)活疫苗。传统的猪瘟疫苗生产方式是感染兔体，然后收集脾脏 及腹腔淋巴制成组织苗，或者是采用原代牛睾丸细胞增殖的细胞苗。但上述两种方式已逐 步被连续传代猪睾丸细胞（Swine testis，ST)生产猪瘟疫苗所替代。
[0003] 对于ST细胞而言，一般采用基础培养基中添加10%的牛血清进行贴壁培养，其方 法是在基础培养基中添加2%的牛血清进行猪瘟病毒的增殖。由于猪瘟病毒在ST细胞上不 产生细胞病变，所以一般可以允许3?5次接种病毒、收集病毒的操作。
[0004] 但是在细胞生长及病毒增殖过程中加入的牛血清有几率造成牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)及其抗体的污染。BVDV与CSFV同属于黄病毒科，瘟病毒属。猪瘟弱毒活疫苗产品 中如果残有BVDV的污染可能会造成免疫动物严重的副反应。生产过程中如果有BVDV抗体 的存在，则可能导致加入的猪瘟病毒种毒被中和，无法实现病毒的高滴度增殖，从而导致无 法获得高滴度疫苗产品。
[0005]目前无血清培养基已经有所报道，但是目前现有文献报道的无血清培养基主要针 对的是商业应用专属细胞株，或者最为接近的也是针对动物的肾脏组织来源的细胞。
[0006] 由于不同的细胞，或者病毒所需要的培养条件差异性很大，因此发明人无法直接 借鉴现有的无血清培养基组成，必须针对这一问题，重新研究，获得适用于ST细胞培养，以 及CSFV增殖的无血清培养基。
【发明内容】
[0007] 本发明针对目前ST细胞培养，以及CSFV病毒增殖中适用的无血清培养基的研究 空白，公开了一系列分别用于猪睾丸细胞的生长、猪瘟病毒增殖的无血清培养基，并针对全 新的培养基提出了一种新的猪瘟病毒培养方法。
[0008] 首先，本发明公开了第一种无血清培养基，所述无血清培养基为pH为7. 0?7. 5 的水溶液，其组分如下：
[0009] MEM 基础培养基 9. 8g/L ;
[0010] 丙丽酸纳 5〇 ?2〇〇mg/L ;
[0011] 大豆蛋白水解物〇. 1?2g/L ;
[0012] 胆固醇 0· 1 ?6mg/L ;
[0013] 碱性成纤维细胞生长因子0· 5?50mg/L ;
[0014] 抑制素 B 0· 5 ?50mg/L ;
[0015] 胰岛素 5 ?50mg/L ;
[0016] L-丙氨酸 2 ?30mg/L ;
[0017] L-缬氨酸 52 ?150mg/L ;
[0018] L-亮氨酸 10 ?80mg/L ;
[0019] L-异亮氨酸 5 ?180mg/L ;
[0020] L-甲硫氨酸 I5 ?3〇Omg/L ;
[0021] L-脯氨酸 10 ?250mg/L ;
[0022] L-苯丙氨酸 10 ?250mg/L ;
[0023] L-色氨酸 5 ?300mg/L ;
[0024] L-甘氨酸 0 ?50mg/L ;
[0025] L-丝氛酸 5 ?150mg/L ;
[0026] L-苏氨酸 5 ?250mg/L ;
[0027] L-半胱氨酸 5 ?250mg/L ;
[0028] L-天冬酰胺 5 ?200mg/L ;
[0029] L-谷氨酰胺 250 ?400mg/L ;
[0030] L-酪氨酸 5 ?250mg/L ;
[0031] L-天冬氨酸 2 ?80mg/L ;
[0032] L-谷氨酸 5 ?2〇Omg/L ;
[0033] L-赖氨酸 6 ?100mg/L ;
[0034] L-精氨酸 5 ?3〇Omg/L ;
[0035] L-组氨酸 5 ?3〇Omg/L ;
[0036] 羟脯氨酸0?40mg/L ;
[0037] 豆蘧酸 0· 01 ?0· 3mg/L ;
[0038] 棕榈酸 0· 01 ?0· 3mg/L ;
[0039] 棕榈油酸 0· 01 ?0· 3mg /L ;
[0040] 硬脂酸 0· 01 ?0· 3mg/L ;
[0041] 精胺 0· 1 ?0· 3ml/L ;
[0042] 亚精胺 0· 1 ?0· 3ml/L ;
[0043] 还原型谷胱甘肽1?3mg/L ;
[0044] 乙醇胺 1. 5 ?3ml/L ;
[0045] β -疏基乙醇 0· 5 ?2ml/L ;
[0046] 甘油 0· 5 ?2g/L ;
[0047] 生物素 0· 01 ?0· lmg/L ;
[0048] 批卩多醇1?5mg/L ;
[0049] 抗坏血酸0· 5?5mg/L ;
[0050] 维生素 B-12 0· 5 ?2mg/L ;
[0051] 次黄嘌呤3?20mg/L ;
[0052] 胸苷 0· 01 ?lmg/L ;
[0053] NaHCO3 1 ?I. 5g/L ;
[0054] FeSO4 · 7H20 5 ?20mg/L ;
[0055] ZnSO4 2 ?40mg/L ;
[0056] Na2SeO3 0· I ?2mg/L ;
[0057] 柠檬酸铁2?20mg/L。
[0058] 进一步地，我们还限定了所述无血清培养基为pH为7. 2的水溶液。
[0059] 同时，我们还进一步限定了所述的无血清培养基在猪睾丸细胞体外培养和扩增中 的应用。
[0060] 本发明所公开的第一种无血清培养基在猪睾丸细胞的体外培养和扩增中可以提 供细胞生长所需的足够的营养物质，并且通过各种成分的配比，保证其生长速率快、增殖获 得的细胞完整，以及氨基酸代谢良好。通过本发明所共公开的培养基培养在猪睾丸细胞的 培养增殖过程中，无氧化作用干扰，细胞在驯化过程中无结团现象，细胞受外部环境干扰损 伤少，得到的细胞完整度高，增殖快。
[0061] 然后，我们公开了第二种无血清培养基，所述无血清培养基为pH为6. 2?6. 8.的 水溶液，其组分如下：
[0062] MEM 基础培养基 9. 8g/L ;
[0063] 丙丽酸纳 5〇 ?3〇Omg/L ;
[0064] 大豆蛋白水解物0. 1?2g/L ;
[0065] 胆固醇 2 ?6mg/L ;
[0066] 碱性成纤维细胞生长因子0. 5?20mg/L ;
[0067] 抑制素 B 0· 5 ?20mg/L ;
[0068] 胰岛素 10 ?50mg/L ;
[0069] L-丙氨酸 10 ?100mg/L ;
[0070] L-缬氨酸 2 ?35mg/L ;
[0071] L-甲硫氨酸 10 ?30mg/L ;
[0072] L-脯氨酸 10 ?250mg/L ;
[0073] L-色氨酸 5 ?300mg/L ;
[0074] L-甘氨酸 10 ?50mg/L ;
[0075] L-丝氛酸 5 ?150mg/L ;
[0076] L-半胱氨酸 5 ?250mg/L ;
[0077] L-天冬酰胺 5 ?200mg/L ;
[0078] L-谷氨酰胺 100 ?200mg/L ;
[0079] L-天冬氨酸 2 ?80mg/L ;
[0080] L-谷氨酸 5 ?2〇Omg/L ;
[0081] 羟脯氨酸10?60mg/L;
[0082] 豆蘧酸 0· 01 ?0· 3mg/L ;
[0083] 棕榈酸 0· 01 ?0· 3mg/L ;
[0084] 棕榈油酸 0· 01 ?0· 3mg/L ;
[0085] 硬脂酸 0· 01 ?0· 3mg/L ;
[0086] 精胺 0· 1 ?0· 3ml/L ;
[0087] 亚精胺 0· 1 ?0· 3ml/L ;
[0088] 还原型谷胱甘肽3?15mg/L ;
[0089] 乙醇胺 1. 5 ?3ml/L ;
[0090] β -巯基乙醇1?2ml/L ;
[0091] 甘油 0.5 ?2g/L;
[0092] 二甲基亚砜 0· 1 ?10ml/L ;
[0093] 轻乙基脈嚷乙横酸1000?5000mg/L ;
[0094] 生物素 0· 01 ?0· lmg/L ;
[0095] 批卩多醇1?5mg/L ;
[0096] 抗坏血酸2?5mg/L ;
[0097] 维生素 B-12 0· 2 ?2mg/L ;
[0098] 次黄嘌呤3?20mg/L ;
[0099] 胸苷 0· 01 ?lmg/L ;
[0100] FeSO4 · 7H20 5 ?20mg/L ;
[0101] ZnSO4 2 ?40mg/L ;
[0102] Na2SeO3 0· 1 ?2mg/L ;
[0103] 柠檬酸铁2?20mg/L。
[0104] 进一步地，我们限定了第二种无血清培养基中，所述无血清培养基为pH为6. 6的 水溶液。
[0105] 同时，我们进一步公开了第二种无血清培养基在猪瘟病毒增殖前期中的应用。
[0106] 紧接着，我们还公开了第三种无血清培养基，所述无血清培养基为pH为7. 0? 7.2.的水溶液，其组分如下：
[0107] MEM 基础培养基 9. 8g/L ;
[0108] 丙酮酸钠 10 ?100mg/L ;
[0109] 大豆蛋白水解物0· 1?0· 5g/L ;
[0110] 胆固醇 0· 01 ?0· 5mg/L ;
[0111] 膜岛素 0· 01 ?2. 5mg/L ;
[0112] 豆蘧酸 0· 01 ?0· 3mg/L ;
[0113] 掠桐酸 0· 01 ?0· 3mg/L ;
[0114] 棕榈油酸 0. 01 ?0. 3mg /L ;
[0115] 硬脂酸 0· 01 ?0· 3mg/L ;
[0116] 精胺 0· 1 ?0· 3ml/L ;
[0117] 亚精胺 0· 1 ?0· 3ml/L ;
[0118] 还原型谷胱甘肽0. 1?10mg/L ;
[0119] 乙醇胺 0· 1 ?lml/L ;
[0120] β -巯基乙醇 0· 1 ?lml/L ;
[0121] 甲基-β -环糊精 1 ?1000mg/L ;
[0122] Y -环糊精 1 ?1000mg/L ;
[0123] 轻乙基哌嗪乙磺酸1000?5000mg/L ;
[0124] 生物素 0· 01 ?0· lmg/L ;
[0125] 批咳醇 0· 1 ?3mg/L ;
[0126] 抗坏血酸2?5mg/L ;
[0127] 维生素 B-12 0· 1 ?2mg/L ;
[0128] 次黄嘌呤1?10mg/L ;
[0129] 胸苷 0· 01 ?lmg/L ;
[0130] FeSO4 · 7H20 5 ?20mg/L ;
[0131] ZnSO4 2 ?40mg/L ;
[0132] Na2SeO3 0· 1 ?lmg/L ;
[0133] 柠檬酸铁2?20mg/L。
[0134] 进一步地，我们公开了第三种无血清培养基中，优选pH为7.0的水溶液。
[0135] 同时，我们还进一步公开了第三种无血清培养基在猪瘟病毒增殖后期中的应用。 最后，我们公开了一种猪瘟病毒的培养方法，包括以下步骤：
[0136] 将猪瘟病毒接种于第二种无血清培养基中，控制DO值为30 %，pH值为6. 6,搅拌转 速为75rpm,温度为37°C,接种病毒后每三天进行收毒换液操作,完成3?5批次收毒后,转 用第三种无血清培养基进行培养增殖，控制DO值为30 %，pH值为7. 0,搅拌转速为55rpm， 温度为32°C,接种病毒后每四天进行收毒换液操作,完成2批次收毒后，即完成猪癌病毒的 培养、收集。
[0137] 在本发明中，大豆蛋白水解物即大豆蛋白酶解蛋白胨。可以采用市售的产品，譬如 sigma公司出品的大豆蛋白酶解蛋白胨。
[0138] 本发明以MEM为基础培养基，通过对猪睾丸细胞以及猪瘟病毒的生长、增殖特征 研究，利用在基础培养基内添加不同成分，分别得到一系列的猪睾丸细胞无血清培养基、以 及不同生长阶段的猪瘟病毒增殖无血清培养基，从而既避免了 BVDV及其抗体可能产生的 污染风险，同时可以实现ST细胞贴壁生长，且生长迅速、细胞面完整，个体饱满，可以长期 传代培养。
【专利附图】
【附图说明】
[0139] 图1为采用本发明所公开的无血清培养基培养ST细胞时，ST细胞在培养方瓶中 生长形态照片。
[0140] 图2为采用本发明所公开的无血清培养基培养ST细胞时，ST细胞在微载体上悬 浮培养形态照片。
[0141] 图3为采用本发明所公开的无血清培养基，ST细胞连续增殖4批次HCLV后的细 胞形态。
【具体实施方式】
[0142] 下面结合【具体实施方式】中的实施例进一步对本发明进行说明，但是本发明不限于 以下实施例。
[0143] 如果没有特别说明，在本发明中所指的原料均来自sigma公司所售产品，其基础 操作，譬如溶解方式，预处理方式等参考产品说明书处理。
[0144] 本发明中操作均在室温条件下进行，即25°C左右的温度下进行操作。
[0145] 实施例1
[0146] 分别将以下物质溶解，将各个溶解液混合，避光搅拌30分钟，直至充分混合后，力口 入无热源的超净纯水800ml，再次搅拌混合后，定容至1000ml，并调节溶液pH至7. 2。所加 入物质包括：MEM基础培养基9. 8g ;丙酮酸钠50?200mg ;大豆蛋白水解物0. 1?2g ;胆固 醇0· 1?6mg ;碱性成纤维细胞生长因子0· 5?50mg ;抑制素 B0. 5?50mg ;胰岛素5? 50mg ;L-丙氨酸2?30mg ;L-纟颜氨酸52?150mg ;L-亮氨酸10?80mg ;L-异亮氨酸5? 180mg ;L-甲硫氨酸15?300mg ;L-脯氨酸
[0147] 10?250mg ;L_苯丙氛酸10?250mg ;L_色氛酸5?300mg ;L_甘氛酸
[0148] 0?50mg ;L_丝氛酸5?150mg ;L_苏氛酸5?250mg ;L_半胱;氛酸5?250mg ; L-天冬酰胺5?200mg ;L-谷氨酰胺250?400mg ;L-酪氨酸5?250mg ;L-天冬氨酸2? 80mg ;L-谷氨酸5?200mg ;L-赖氨酸6?IOOmg ;L-精氨酸
[0149] 5?300mg ;L_组氨酸5?300mg ;轻脯氨酸0?40mg ;豆蘧酸0· 01?0· 3mg ;棕 榈酸0. 01?0. 3mg ;棕榈油酸0. 01?0. 3mg ;硬脂酸0. 01?0. 3mg ;精胺0. 1?0. 3ml ;亚 精胺0. 1?0. 3ml ;还原型谷胱甘肽1?3mg ;乙醇胺1. 5?3ml ; β -巯基乙醇0. 5?2ml/ 1;甘油0.5?28;
[0150] 生物素0· 01?0· Img ;批卩多醇1?5mg ;抗坏血酸0· 5?5mg ;维生素 B120. 5? 2mg ;次黄嘌呤 3 ?20mg ;胸苷 0· 01 ?Img ;NaHC03l ?I. 5g ;FeS04 ·7Η205 ?20mg ;ZnS042 ? 40mg ;Na2Se030. I ?2mg ;朽1 樣酸铁 2 ?20mg/L。
[0151] 从而制备得到第一目标培养基，用0. 22 μ m滤膜过滤除菌后，于4°C冰箱中避光保 存，待用。
[0152] 实施例2
[0153] 按照实施例1中的方式，制备第一种目标无血清培养基，其中各物质如表1中所 示，
[0154] 表1适用于ST细胞生长的无血清培养基组分
[0155]
【权利要求】
1.无血清培养基，其特征在于：所述无血清培养基为pH为7. (Γ7. 5的水溶液，其组分 如下： MEM基础培养基9. 8 g/L ; 丙酮酸钠 50?200mg/L ; 大豆蛋白水解物 0. 1?2g/L; 胆固醇〇· 1?6mg/L ; 碱性成纤维细胞生长因子 0. 5?50mg/L ; 抑制素 B 0· 5?50mg/L ; 胰岛素 5?50mg/L ; L-丙氨酸 2?30mg/L ; L-缴氨酸 52?150mg/L ; L-亮氨酸 10?80mg/L ; L-异亮氨酸5?180mg/L ; L-甲硫氨酸15?300mg/L ; L_脯氨酸 10?250mg/L ; L-苯丙氨酸10?250mg/L ; L-色氨酸 5?300mg/L ; L-甘氨酸 0?50mg/L ; L-丝氛酸 5?150mg/L ; L-苏氨酸 5?250mg/L ; L-半胱氨酸5?250mg/L ; L_天冬酰胺5?200mg/L ; L_谷氨酰胺250?400mg/L ; L_酪氨酸 5?250mg/L ; L-天冬氨酸2?80mg/L ; L-谷氨酸 5?200mg/L ; L-赖氨酸 6?100mg/L ; L_精氨酸 5?300mg/L ; L-组氨酸 5?300 mg/L ; 轻脯氨酸 0?40mg/L ; 豆蘧酸〇· 01?〇· 3mg/L ; 棕榈酸〇· 01?〇· 3 mg /L ; 棕榈油酸 0· 01?0· 3 mg /L ; 硬脂酸0· 01?0· 3 mg /L ; 精胺 0· 1 ?0· 3ml/L ; 亚精胺〇· 1?〇· 3ml/L ; 还原型谷胱甘肽 1?3mg/L ; 乙醇胺1.5?3ml/L; β-巯基乙醇 0.5?2ml/L; 甘油 0. 5?2g/L ; 生物素〇· 01?〇· lmg/L ; 批口多醇1?5mg/L ; 抗坏血酸 0· 5?5mg/L ; 维生素 B-12 0· 5 ?2mg/L ; 次黄嘌呤 3?20mg/L ; 胸苷 0· 01 ?lmg/L ; NaHC03 1 ?1. 5g/L ; FeS047H20 5 ?20mg/L ; ZnS04 2 ?40mg/L ; Na2Se03 0· 1 ?2mg/L ; 柠檬酸铁 2?20mg/L。
2. 根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于：所述无血清培养基为pH为7. 2 的水溶液。
3. 权利要求1所述的无血清培养基在猪睾丸细胞体外培养和扩增中的应用。
4. 无血清培养基，其特征在于：所述无血清培养基为pH为6. 2飞.8.的水溶液，其组分 如下： MEM基础培养基9. 8 g/L ; 丙酮酸钠 50?300mg/L ; 大豆蛋白水解物 0. 1?2g/L; 胆固醇2?6mg/L ; 碱性成纤维细胞生长因子 0. 5?20mg/L ; 抑制素 B 0· 5?20mg/L ; 胰岛素10?50mg/L ; L-丙氨酸 10?100mg/L ; L-缴氨酸 2?35mg/L ; L-甲硫氨酸10?30mg/L ; L_脯氨酸 10?250mg/L ; L_色氛酸 5?300mg/L ; L-甘氨酸 10?50mg/L ; L-丝氛酸 5?150mg/L ; L-半胱氨酸5?250mg/L ; L_天冬酰胺5?200mg/L ; L_谷氨酰胺100?200mg/L; L-天冬氨酸2?80mg/L ; L_谷氨酸 5?200mg/L ; 轻脯氨酸 10?60mg/L ; 豆蘧酸〇· 01?〇· 3mg/L ; 棕榈酸〇· 01?〇· 3 mg /L ; 棕榈油酸 0· 01?0· 3 mg /L ; 硬脂酸0· 01?0· 3 mg /L ; 精胺 0· 1 ?0· 3ml/L ; 亚精胺〇· 1?〇· 3ml/L ; 还原型谷胱甘肽 3?15mg/L ; 乙醇胺1.5?3ml/L; β-巯基乙醇 1?2ml/L; 甘油 0. 5?2g/L ; 二甲基亚讽0. 1?10ml/L ; 轻乙基哌嗪乙磺酸1000?5000mg/L ; 生物素〇· 01?〇· lmg/L ; 批口多醇1?5mg/L ; 抗坏血酸 2?5mg/L ; 维生素 B-12 0· 2 ?2mg/L ; 次黄嘌呤 3?20mg/L ; 胸苷 0· 01 ?lmg/L ; FeS047H20 5 ?20mg/L ; ZnS04 2 ?40mg/L ; Na2Se03 0· 1 ?2mg/L ; 柠檬酸铁 2?20mg/L。
5. 根据权利要求4所述的无血清培养基，其特征在于：所述无血清培养基为pH为6. 6 的水溶液。
6. 权利要求4所述的无血清培养基在猪瘟病毒增殖前期中的应用。
7. 无血清培养基，其特征在于：所述无血清培养基为pH为7. (Γ7. 2.的水溶液，其组分 如下： MEM基础培养基9. 8 g/L ; 丙酮酸钠 10?100mg/L ; 大豆蛋白水解物 0. 1?0. 5g/L ; 胆固醇0. 01?0. 5mg/L ; 胰岛素〇· 01?2. 5mg/L ; 豆蘧酸〇· 01?〇· 3mg/L ; 棕榈酸〇· 01?〇· 3 mg /L ; 棕榈油酸 0· 01?0· 3 mg /L ; 硬脂酸0· 01?0· 3 mg /L ; 精胺 0· 1 ?0· 3ml/L ; 亚精胺〇· 1?〇· 3ml/L ; 还原型谷胱甘肽 0· 1?10mg/L ; 乙醇胺〇· 1?lml/L ; β-巯基乙醇 0.1?lml/L; 甲基-β -环糊精 1?1000mg/L ; γ -环糊精 1?l〇〇〇mg/L ; 轻乙基哌嗪乙磺酸1000?5000mg/L ; 生物素〇· 01?〇· lmg/L ; 批口多醇〇· 1?3mg/L ; 抗坏血酸 2?5mg/L ; 维生素 B-12 0· 1 ?2mg/L ; 次黄嘌呤 1?10mg/L ; 胸苷 0· 01 ?lmg/L ; FeS047H20 5 ?20mg/L ; ZnS04 2 ?40mg/L ; Na2Se03 0· 1 ?lmg/L ; 柠檬酸铁 2?20mg/L。
8. 根据权利要求7所述的无血清培养基，其特征在于：所述无血清培养基为pH为7. 0 的水溶液。
9. 权利要求7所述的无血清培养基在猪瘟病毒增殖后期中的应用。
10. -种猪瘟病毒的培养方法，其特征在于，包括以下步骤： 将猪瘟病毒接种于权利要求5所述的无血清培养基中，控制DO值为30%，pH值为6. 6， 搅拌转速为75rpm,温度为37°C,接种病毒后每三天进行收毒换液操作，完成3、批次收毒 后，转用权利要求7所述的无血清培养基进行培养增殖，控制DO值为30%，pH值为7. 0,搅 拌转速为55rpm,温度为32°C,接种病毒后每四天进行收毒换液操作，完成2批次收毒后，即 完成猪瘟病毒的培养、收集。
【文档编号】C12N5/071GK104278009SQ201410467191
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】冯磊, 褚轩, 吴培培, 王伟峰, 侯继波, 华涛, 陈丽 申请人:江苏省农业科学院