一种用于快速检测人类cyp2c19基因多态性的试剂盒及其使用方法

一种用于快速检测人类cyp2c19基因多态性的试剂盒及其使用方法
【专利摘要】本发明属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术，具体涉及一种用于快速检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒及其使用方法。本发明所述试剂盒包括3对引物、3条探针、6条PNA序歹[I，1对13-Actin内标引物及1条内标探针，还包括Mg2+的PCR反应缓冲液、dNTP混合物、Taq酶和ddH20。利用本发明试剂盒能够对CYP2C19基因多态性位点进行定性检测，根据SNP位点进行两管PNA-PCR荧光扩增反应，只需根据两管荧光曲线是否起线就能进行结果判断，不会产生人为误差，假阳性和假阴性率低；本发明试剂盒更容易实现高通量检测，更能满足临床使用。
【专利说明】-种用于快速检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒及其 使用方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术，具体涉及一种用于快 速检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒及其使用方法。

【背景技术】
[0002] 细胞色素？450化7丨〇(*1'〇1116?450,0￥?450)是由一组结构和功能相关的超家族 基因（Superfamily gene)编码的同工酶，对于人类，其主要存在于肝细胞微粒体中。在 CYP450超家族中，CYP2是最大的家族，有15个亚家族（CYP2A到2Q)，它们代谢约20 %目前 临床使用的药物，其中CYP2A、CYP2C、CYP2D和CYP2E均具有遗传多态性和种族差异。人的 肝脏中CYP2C约占20%，现已克隆出CYP2C8、2C9/10、2C18和2C19。近年来CYP450的基因 型与不同个体的药物代谢酶活性的相关性研究有很大进展，通过检测编码相关药物代谢酶 的基因型来判断不同个体对药物的代谢以及药效、不良反应情况，从而指导用药，达到个体 化医疗的目的。
[0003] 研究表明，CYP2C19对药物代谢的能力随着等位基因的不同组合而呈现出一定 的规律性，表现为：正常基因纯合子〉正常基因与突变基因杂合子〉突变基因纯合子或杂 合子，即通常所说的基因剂量效应。CYP2C19*1/*1野生纯合子代表的是强代谢者（EM)， CYP2C19*2/*2或CYP2C19*3/*3突变纯合子代表的是弱代谢者（PM), CYP2C19*l/*2或 CYP2C19*l/*3杂合子代表的是中间代谢者（IM)，即杂合子强代谢者，CYP2C19*1/*17或 CYP2C19*17/*17代表的是超快代谢者（UM)。这些代谢类型的不同会造成药物体内不同的 代谢速率，造成不同的药效。因此根据CYP2C19基因型来判断不同个体对药物的代谢以及 药效、不良反应情况，从而指导用药，达到个体化医疗的目的。
[0004] 目前，用于基因分型的检测方法分为四类：测序法，聚合酶链反应-限制性片段长 度多态性技术（PCR-RFLP)、芯片法、荧光定量PCR法（qPCR)四种方法。
[0005] 测序法：先进行PCR扩增，得到含有目的SNP位点的PCR产物，然后纯化PCR产物， 再对其进行测序，根据测序峰图判读基因型。优点：结果准确，测序法是基因多态性位点检 测的金标准。但是其成本较高，操作繁琐，试验周期长，限制了其在临床使用。
[0006] PCR-RFLP技术：先进行PCR扩增，得到含有目的SNP位点的PCR产物，然后对PCR 产物进行酶切，电泳检测酶切条带，根据酶切条带进行判读。优点：成本低，结果比较直观； 缺点：有的多态性位点所在位置没有合适的限制性酶切位点，需要人工引入突变，另外容易 造成产物污染，导致假阳性结果，同时操作繁琐，试验周期长。
[0007] 芯片法：先进行PCR扩增，得到含有目的SNP位点的PCR产物，然后将PCR产物与 突变探针、野生探针杂交，通过比较两个探针杂交的信号强度判断样品基因型。缺点=PCR 产物需要进行后续分析，操作繁琐；另外结果不好判读，容易出现假阳性。
[0008] qPCR法：又分为ARMS-PCR法、HRM法和Taqman探针法。qPCR的优点是操作简单， 试验周期短，PCR产物无需进行后续分析即可判断结果，因全过程在封闭的管内进行，减少 产物交叉污染。同时该方法操作简单，检测周期短。目前该方法已成为临床常用的检测方 法。
[0009] ARMS-PCR法又叫等位基因特异PCR，TaqDNA聚合酶缺少3' - 5'外切酶活性，在 一定条件下PCR引物3'末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变，分别设计 突变引物、野生引物，2个引物主要是3'末端碱基不同。由于3'末端不配对的引物产物量 减少或不扩增，突变引物和野生引物的Ct值会有显著差异，通过设定区分野生型和突变型 的阈值，当突变引物与野生引物Ct值差值（ACt)大于阈值时即为突变型。缺点：引物设计 困难，对于多态性位点还有大量GC或AT序列时，往往束手无策，同时结果判断较为困难。
[0010] HRM法：高分辨率熔解曲线分析技术（High Resolution Melting，HRM)，有染料法 和荧光共振能量转移（FRET)双探针法等。染料法对荧光染料、PCR仪器要求较高，临床检 测比较少用。FRET (fluorescence resonance energy transfer, FRET)探针比较常用，罗氏 专利的FRET探针又称为双杂交探针。在SNP位点设计两条FRET探针，当两条探针和模版 互补、且相邻的特异探针组成，上游探针的3'端标记供体荧光基团，相邻下游探针的5' 端标记Red640受体荧光基团。当复性时，两探针同时结合在模板上，供体基团和Red640受 体基团紧密相邻，激发供体产生的荧光能量被Red640基团吸收，使得检测探头可以检测到 Red640发出波长为640的荧光。当变性时，两探针游离，两基团距离远，不能检测到640波 长的荧光。FRET探针检测的信号是退火时的实时信号，每次检测信号始终严格对应模版的 数量，非累积信号，可以用于做Tm曲线进行SNP检测。优点：一个SNP位点基因型，只需要 一管PCR完成检测；缺点：根据HRM溶解曲线Tm值差异不容易判读，不同基因型溶解曲线峰 图差异不明显。
[0011] MGB-Taqman探针法：Taqman探针是一种经典的定量PCR技术，现阶段得到广泛应 用，在PCR反应体系中加入一对引物的和一个特异性荧光探针，探针只与两条引物之间特 异性模板结合，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程。探针的5'端连接报告荧光，3' 端连接淬灭荧光，随后进行实时定量PCR。如果探针能够与DNA杂交，则在PCR用引物延伸 时，TaqDNA聚合酶5'到3'端的外切酶活性会将探针序列上5'端的报告荧光切下，淬灭 荧光不再能对报告荧光进行抑制，使得报告荧光发光。针对SNP位点分别设计两个不同荧 光标记突变探针、野生探针，根据突变探针、野生探针荧光信号强度进行SNP位点基因型判 读。缺点=Taqman探针需要采用MGB-Taqman探针，当SNP位点的上游和下游含有大量GC或 AT碱基时，MGB-Taqman探针的设计和合成非常困难，且价格非常昂贵。


【发明内容】

[0012] 本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种用于快速检测人类CYP2C19基因 多态性的试剂盒及其使用方法，本发明提供的是一种基于PNA-PCR方法的基因多态性检测 试剂盒，该试剂盒成本低廉、操作简单、特异性和敏感性好，能够快速灵敏地检测待测位点 基因类型，从而准确对人类CYP2C19基因多态性进行基因分型。
[0013] 为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0014] 一种用于快速检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒，包括3对引物、3条探针、6 条PNA序列，1对P-Actin内标引物及1条内标探针序列，具体的包括：
[0015] 用于检测CYP2C19基因681G的引物序列如SEQ NO. 1、SEQ NO. 2所示，探针序列如 SEQ NO. 7所示，PNA序列如SEQ NO. 10所示；
[0016] 用于检测CYP2C19基因681A的引物序列如SEQ NO. 1、SEQ NO. 2所示，探针序列如 SEQ NO. 7所示，PNA序列如SEQ NO. 11所示；
[0017] 用于检测CYP2C19基因836G的引物序列如SEQ NO. 3、SEQ NO. 4所示，探针序列如 SEQ NO. 8所示，PNA序列如SEQ NO. 12所示；
[0018] 用于检测CYP2C19基因836A的引物序列如SEQ NO. 3、SEQ NO. 4所示，探针序列如 SEQ NO. 8所示，PNA序列如SEQ NO. 13所示；
[0019] 用于检测CYP2C19基因-806C的引物序列如SEQ NO. 5、SEQ NO. 6所示，探针序列 如SEQ NO. 9所示，PNA序列如SEQ NO. 14所示；
[0020] 用于检测CYP2C19基因-806T的引物序列如SEQ NO. 5、SEQ NO. 6所示，探针序列 如SEQ NO. 9所示，PNA序列如SEQ NO. 15所示；
[0021] 用于P -Actin内标扩增的引物序列如SEQ NO. 16、SEQ NO. 17所示，内标探针序列 如SEQ NO. 18所示。
[0022] 按上述方案，所述的用于快速检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒还包括Mg2+ 的PCR反应缓冲液、dNTP混合物、Taq酶和CldH 2O。
[0023] 按上述方案，所述的用于快速检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒还包括6个 阳性对照品和1个阴性对照品，所述阳性对照品为包含有CYP2C19基因多态性位点681G、 681A、836G、836A、-806C或-806T的重组质粒和包含有内标基因的重组质粒的混合物，所述 阴性对照品为不包含内标基因和目的基因位点的重组质粒。
[0024] 按上述方案，所述3条探针为Taqman探针，探针5'端的荧光基团为FAM，3'端的 淬灭基团为BHQl。
[0025] 按上述方案，所述1条内标探针为Taqman探针，探针5'端的突光基团为R0X，3' 端的淬灭基团为BHQl。
[0026] 一种用于快速检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒的使用方法，包括如下步 骤：（1)提取待测人的基因组DNA作为检测样品；
[0027] (2)取1个PCR8联管，在其中A?F 6个管中分别加入检测样品，另取一个PCR8 联管，在A?F 6个管中分别加入6个不同的阳性对照品，再取一个PCR8联管，在A?F 6 个管中分别加入阴性对照品；
[0028] (3)将PCR8联管置于荧光PCR仪器中进行荧光PCR扩增反应，采集FAM和ROX荧 光信号；
[0029] (4)结果判断：a.当阳性对照管均有FAM和ROX荧光信号起线，阴性对照管均无 FAM和ROX荧光信号起线，检测样品管均有ROX荧光信号起线时，判断试验成功；b.根据检 测样品管A和B的FAM荧光信号是否起线判断CYP2C19基因681的分型，根据检测样品管 C和D的FAM荧光信号是否起线判断CYP2C19基因836的分型，根据检测样品管E和F的 FAM荧光信号是否起线判断CYP2C19基因-806的分型。
[0030] 按上述方案，所述PCR8联管中A和B管内含有与检测人类CYP2C19基因681分型 相关的PCR反应液，所述C管和D管内含有与检测人类CYP2C19基因836分型相关的PCR反 应液，所述E管和F管中含有与检测人类CYP2C19基因-806分型相关的PCR反应液，所述 PCR反应液包含与检测基因位点相对应的引物、探针、PNA序列、内标引物及内部探针、Taq 酶、dNTP混合液、Mg2+的PCR反应缓冲液和ddH20。
[0031] 按上述方案，所述阳性对照品为包含有CYP2C19基因多态性位点681G、681A、 836G、836A、-806C或-806T的重组质粒和包含有内标基因的重组质粒的混合物，所述阴性 对照品为不包含内标基因和目的基因位点的重组质粒。
[0032] 本发明试剂盒是基于PNA-PCR方法的基因多态性检测试剂盒，其技术原理是：肽 核酸是（peptide nucleic acids,PNA) -类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物。它 是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成的第三代反 义试剂，是一种全新的DNA类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了 DNA 中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同，PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形 式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。由于PNA不带负电荷，与DNA和 RNA之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于DNA或DNA、RNA 间的杂交，PNA与DNA或RNA的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与DNA或RNA分子的杂 交能力远优于DNA/DNA或DNA/RNA，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、 不被核酸酶和蛋白酶水解。并且PNA与互补DNA具有1个碱基不匹配时，其溶解温度会下 降8°C?20°C，2个碱基不匹配时则完全不能杂交，当PNA与互补DNA完全匹配时，因其PNA 为肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键，所以能够阻止DNA扩增。本试剂盒利用PNA的这些特性 进行CYP2C19基因多态性位点分型，此处以CYP2C19基因681分型为例说明本发明试剂盒 的工作原理：首先根据CYP2C19基因681G设计PNA序列1 (序列如SEQ ID NO. 10所示）， 根据CYP2C19基因681A设计PNA序列2(序列如SEQ ID NO. 11所示），然后对待测基因同 时进行两管PNA-PCR荧光PCR反应（即在进行荧光PCR反应时加入PNA序列），其中一管 PNA-PCR荧光PCR反应中加入PNA序列1，另一管PNA-PCR荧光PCR反应中加入PNA序列2， 当PNA与待测基因的DNA序列相匹配时，荧光PCR反应被阻断，荧光PCR反应无起线；当PNA 与待测基因的DNA序列不相匹配时，荧光PCR反应顺利进行，荧光PCR反应有起线），因此可 以根据两管荧光PCR反应是否起线来判断CYP2C19基因681的分型，所述分型为纯合野生 型（仅一管PCR反应起线）、杂合型（二管PCR反应同时起线）或纯合突变型（仅一管PCR 反应起线）。
[0033] 本发明的有益效果：
[0034] (1)利用本发明试剂盒能够对CYP2C19基因多态性位点进行定性检测，根据SNP位 点进行两孔PNA-PCR荧光扩增反应，只需根据两孔荧光曲线是否起线就能进行结果判断， 不会产生人为误差，假阳性和假阴性率低，避免了传统ARMS-PCR方法需要根据A ct值进行 结果判断，结果判定困难的缺点；
[0035] (2)本发明试剂盒所使用的荧光检测探针为Taqman探针，该探针费用低廉；同时 本发明所有的反应全程闭管操作，PCR反应后不需要进行PCR产物纯化、电泳、酶切、杂交 等，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测的效率，另外降低了 PCR 产物污染引起假阳性的风险。
[0036] (3)本发明试剂盒中包括内标引物和探针，通过检测内标基因，减少了因样本提取 问题导致的假阴性。
[0037] (4)本发明中使用的PNA设计简单，不需要进行特殊的修饰就可以满足CYP2C19基 因多态性检测分析。
[0038] (5)本发明试剂盒是采用PNA钳夹荧光定量PCR技术平台，相对于测序法、 PCR-RFLP、芯片法更容易实现高通量检测，更能满足临床使用。

【专利附图】

【附图说明】
[0039] 附图1是CYP2C19基因681纯合野生型扩增曲线；
[0040] 附图2是CYP2C19基因681杂合型扩增曲线；
[0041] 附图3是CYP2C19基因681纯合突变型扩增曲线；
[0042] 附图4是CYP2C19基因836纯合野生型扩增曲线；
[0043] 附图5是CYP2C19基因836杂合型扩增曲线；
[0044] 附图6是CYP2C19基因836纯合突变型扩增曲线；
[0045] 附图7是CYP2C19基因-806纯合野生型扩增曲线；
[0046] 附图8是CYP2C9基因-806杂合型扩增曲线；
[0047] 附图9是CYP2C9基因-806纯合突变型扩增曲线；
[0048] 附图10是内标P -Actin基因扩增曲线。 具体实施方案
[0049] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。
[0050] -种用于快速检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒，试剂盒中包括以下多态性 检测的3对引物，3条探针、6条PNA序列、1对P-Actin内标引物和1条内标探针。

【权利要求】
1. 一种用于快速检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括 3对引物、3条探针、6条PNA序列，1对P -Actin内标引物及1条内标探针，所述3对 引物的序列如SEQ ID NO. 1?SEQ ID NO. 6所示，所述3条探针的序列如SEQ ID NO. 7?SEQ ID NO. 9所示，所述6条PNA序列如SEQ ID NO. 10?15所示，所述1对0-Actin内标引物的 序列如SEQ ID NO. 16?SEQ ID NO. 17所示，所述1条内标探针的序列如SEQ ID NO. 18所 /Jn 〇
2. 根据权利要求1所述的用于快速检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒，其特征在 于，还包括Mg2+的PCR反应缓冲液、dNTP混合物、Taq酶和ddH 20。
3. 根据权利要求1所述的用于快速检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒，其特征在 于，还包括6个阳性对照品和1个阴性对照品，所述阳性对照品为包含有CYP2C19基因多态 性位点681G、681A、836G、836A、-806C或-806T的重组质粒和包含有内标基因的重组质粒的 混合物，所述阴性对照品为不包含内标基因和CYP2C19基因多态性位点的重组质粒。
4. 根据权利要求1所述的用于快速检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒，其特征在 于，所述3条探针为Taqman探针，探针5'端的荧光基团为FAM，3'端的淬灭基团为BHQl。
5. 根据权利要求1所述的用于快速检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒，其特征 在于，所述1条内标探针为Taqman探针，探针5'端的突光基团为R0X，3'端的洋灭基团为 BHQl 0
6. 权利要求1所述的用于快速检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒的使用方法，其 特征在于，包括如下步骤： (1) 提取待测人的基因组DNA作为检测样品； (2) 取1个PCR8联管，在其中A~F 6个管中分别加入检测样品，另取一个PCR8联管， 在A~F 6个管中分别加入6个不同的阳性对照品，再取一个PCR8联管，在A~F 6个管中分 别加入阴性对照品； (3) 将PCR8联管置于荧光PCR仪器中进行荧光PCR扩增反应，采集FAM和ROX荧光信 号； (4) 结果判断：a.当阳性对照管均有FAM和ROX荧光信号起线，阴性对照管均无FAM和 ROX荧光信号起线，检测样品管均有ROX荧光信号起线时，判断试验成功；b.根据检测样品 管A和B的FAM荧光信号是否起线判断CYP2C19基因681的分型，根据检测样品管C和D 的FAM荧光信号是否起线判断CYP2C19基因836的分型，根据检测样品管E和F的FAM荧 光信号是否起线判断CYP2C19基因-806的分型。
7. 根据权利要求6所述的用于快速检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒的使用方 法，其特征在于，所述PCR8联管中A和B管内含有与检测人类CYP2C19基因681分型相关 的PCR反应液，所述C管和D管内含有与检测人类CYP2C19基因836分型相关的PCR反应 液，所述E管和F管中含有与检测人类CYP2C19基因-806分型相关的PCR反应液，所述PCR 反应液包含与检测基因位点相对应的引物、探针、PNA序列、内标引物及内部探针、Taq酶、 dNTP混合液、Mg 2+的PCR反应缓冲液和ddH20。
8. 根据权利要求6所述的用于快速检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒的使用 方法，其特征在于，所述阳性对照品为包含有CYP2C19基因多态性位点681G、681A、836G、 836A、-806C或-806T的重组质粒和包含有内标基因的重组质粒的混合物，所述阴性对照品 为不包含内标基因和目的基因位点的重组质粒。
【文档编号】C12Q1/68GK104212904SQ201410473101
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月17日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】叶伦, 王宁, 刘金水, 李雪梅, 李倩, 陈刚 申请人:武汉康录生物技术有限公司