一种沙门氏菌的四重pcr检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种沙门氏菌的四重PCR检测方法。本发明中将hns基因(152bp)、fliM基因(418bp)、invA基因(681bp)和Hut基因(495bp)，作为PCR检测的四个基因靶点，将扩增这4个基因片段的4对引物放在一个PCR反应体系，通过各项参数调整优化，建立直接从样品中检测沙门氏菌的四重PCR检测方法。与传统PCR不同，本发明建立的快速检测沙门氏菌四重PCR体系，同时扩增沙门氏菌的四个毒力因子特异性序列，一方面具有四重保险的特点，提高检测的准确性和可靠性，另一方面还可以对其毒力因子编码基因结构变异进行分析，从而掌握其变异趋势，起到一箭双雕的效果。
【专利说明】-种沙门氏菌的四重PCR检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物【技术领域】的多重PCR检测方法，具体是一种能检测沙门氏菌 的四重PCR方法。
【背景技术】
[0002] 沙门氏菌是肠杆菌科的一类革兰氏阴性菌，目前已经发现有2500多个血清型。沙 门氏菌除可感染人外，还可感染很多动物包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。沙门 氏菌含有多个毒力因子，能够引起动物患肠胃炎、伤寒、菌血症、流产、脑膜炎、呼吸道疾病、 心脏疾病、骨髓炎以及一些当地性疾病。沙门氏菌存在于人类的整个食物链中（动物饲料、 饲养动物、屠宰场、动物产品零售、餐馆）。至今为止，沙门氏菌仍然威胁着养殖动物及其人 类的健康，危害着养殖业的发展，沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病 之一，包括食物中毒，胃肠炎、伤寒和副伤寒等。人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现 为有临床症状的致死疾，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力。沙门氏菌 的属的种类很多，其中最常见的引起食物中毒的沙门氏菌有鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门 氏菌、肠炎沙门氏菌等。沙门氏菌大多属于条件性致病菌，而且常与猪繁殖与呼吸综合征病 毒、猪圆环病毒、猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌等猪呼吸道病原微生物混合或继发 感染，所以区分出致病性沙门氏菌是确诊的关键所在。由此可见，建立有效、灵敏的检测方 法无疑是防治沙门氏菌感染和沙门氏菌病的关键。
[0003] 沙门氏菌是兼性胞内菌，在实验中较难培养，同时在采样过程中分离率也较低，传 统的沙门氏菌检测方法（临床观察、培养镜检、玻片凝集试验、生化指标、和噬菌体分型）等 耗时耗力，传统的血清型诊断方法有操作繁琐复杂，特异性和灵敏性低等多种不足。而已经 报道的常规PCR检测方法，虽可以通过扩增沙门氏菌特异性基因片段，快速有效地检测沙 门氏菌，但这些PCR检测方法不能很好地对所检出的沙门氏菌进行分型和致病性鉴定。
[0004] 多重PCR(multiplex PCR)是在常规PCR的基础上加以改进，于一个PCR反应体 系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的 PCR技术。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染。由于毒力因子是区 分致病性的重要标志物。所以建立基于扩增毒力因子的沙门氏菌杆菌多重PCR检测方法对 于及时准确掌握沙门氏菌感染分布状况、实时跟踪其流行趋势及遗传变异规律等都具有重 要意义。
【发明内容】
[0005] 鉴于沙门氏菌属的种类很多，且往往与其他常见病原体混合感染，传统的诊断技 术如细菌分离、免疫学实验等费时费力，不适于临床快速诊断，也不适于大规模的流行病学 调查的现状，本发明目的在于克服现有技术不足，提供一种直接从样品中检测沙门氏菌并 对其进行分型的四重PCR检测方法。本发明的检测方法采用四重PCR体系检测，具有多重 保险的特点，检测的准确性和可靠性高，检测速度快。
[0006] 本发明针对实际生产中沙门氏菌常与多种病原体混合感染、且临床很难区分的情 况，本着既能检测病原体又能分析其重要毒力因子编码基因变异特点的原则，从已发表的 文献中筛选出沙门氏菌编码DNA结合蛋白的hns基因（152bp)、编码鞭毛开关蛋白的fIiM 基因（418bp)、与沙门氏菌入侵肠道上皮细胞有关的invA基因（681bp)以及编码组氨酸结 合周质蛋白的Hut基因（495bp)，作为PCR检测的四个基因靶点，将扩增这4个基因片段的 4对引物放在一个PCR反应体系，通过各项参数调整优化，建立直接从样品中检测沙门氏菌 的四重PCR检测方法。
[0007] 本发明是通过以下的技术方案实现的。
[0008] -种沙门氏菌的四重PCR检测方法，将沙门氏菌四个毒力因子hns基因（152bp)、 fliM基因（418bp)、invA基因（681bp)和Hut基因（495bp)，作为PCR检测的四个基因靶点， 采用四重PCR于PCR反应体系中一次性同时扩增上述4个基因片段，再通过琼脂糖凝胶电 泳检测鉴定PCR扩增产物；其中：扩增hns基因的上游引物的序列如SEQIDNO. 1所示，下 游引物的序列如SEQIDNO. 2所示；扩增fliM基因的上游引物的序列如SEQIDNO. 3所示； 下游引物的序列如SEQIDNO. 4所示；扩增invA基因的上游引物的序列如SEQIDNO. 5所 示；下游引物的序列如SEQIDNO. 6所示；扩增Hut基因的上游引物的序列如SEQIDNO. 7 所示；下游引物的序列如SEQIDNO. 8所示（见表1)。
[0009] 表1沙门氏菌四个毒力因子编码基因引物
[0010]
【权利要求】
1. 一种沙门氏菌的四重PCR检测方法，其特征在于，将沙门氏菌编码DNA结合蛋白的 hns基因，编码鞭毛开关蛋白的fliM基因，沙门氏菌入侵肠道上皮细胞有关的invA基因和 编码组氨酸结合周质蛋白的Hut基因作为4个基因靶点，采用四重PCR于PCR反应体系中 一次性同时扩增上述4个基因片段，再通过琼脂糖凝胶电泳检测鉴定PCR扩增产物；其中： 扩增hns基因的上游引物的序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO. 2 所示； 扩增fliM基因的上游引物的序列如SEQ ID NO. 3所示；下游引物的序列如SEQ ID NO. 4所示； 扩增invA基因的上游引物的序列如SEQ ID NO. 5所示；下游引物的序列如SEQ ID NO. 6所示； 扩增Hut基因的上游引物的序列如SEQ ID NO. 7所示；下游引物的序列如SEQ ID NO. 8 所示。
2. 根据权利要求1所述的四重PCR检测方法，其特征在于，PCR反应体系如下：cDNA模 板1μ 1，4对上、下游引物各0. 5μ 1，PCR Mixl2. 5μ 1，超纯水补充至25μ 1 ;PCR反应条件： 95°C预变性5min，进入95°C 60s，58°C lmin和72°C lmin的循环，循环35次，最后72°C延伸 5min〇
【文档编号】C12Q1/68GK104278102SQ201410571423
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年10月23日 优先权日:2014年10月23日
【发明者】朱建国, 韩少鹏 申请人:上海交通大学